СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПАТОЛОГИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ МИКРОФЛОРЫ ПОЛОСТИ РТА Российский патент 2008 года по МПК G01N33/48 C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно к стоматологии, и может использоваться для диагностики патологических изменений микрофлоры полости рта с целью своевременного проведения диагностики, профилактики, лечения и прогноза различных патологических состояний, связанных с нарушениями микрофлоры полости рта.

Проблема заболеваний пародонта является одной из наиболее значимых в стоматологии. Не менее 20% жителей Европы в возрасте более 35 лет имеют выраженные проявления зубного камня, инфекций десен и прикорневых зон зубов, что впоследствии ведет к постепенному выпадению зубов в результате хронического пародонтита. Ранняя диагностика этого заболевания и применение способов профессиональной гигиены (удаление зубного камня и др.) снижает частоту и интенсивность развития пародонтитов, сохраняя зубной аппарат на долгое время. Тем самым возникает существенная экономия средств на лечении и протезировании зубов у лиц трудоспособного возраста.

Данные экспериментальных и клинических исследований свидетельствуют о том, что развитие воспаления десен и пародонтита связано с размножением особых микроорганизмов в составе зубного напета. Из нескольких сот видов микрофлоры полости рта ряд бактериальных видов регулярно встречается в зубном налете и обладает выраженной патогенностью в отношении тканей пародонта. К числу таких патогенных бактерий относят, в частности, Actinobacter. actinomycetemcomitans (A.actinomycetemcomitans), Bacteroides forsyfhus (В.forsythus), Porphyromonas gingivalis (P.gingivalis). Эти бактерии регулярно (до 80-90%) выявляются в десневой жидкости больных пародонтитами (особенно - при агрессивных формах), в отличие от здоровых лиц (10-30%), в частности, согласно новым данным [Kumar P.S., Griffen A.L, Barton J.A., Paster B.J., Moeschberger M.L., Leys E.J. New bacterial species associated with chronic periodontitis. // J.Dental Res. - 2003. - Vol.82. P.338-344]. Так, при обследовании молодых пациентов с патологией пародонта выявили A actinomycetemcomitans в 40% образцов субгингивального зубного налета [Maida С., Campus G., Piana A., Solinas G., Milia E., Castiglia P. Periodontal status in an Italian young adult population. Prevalence and relationship with periodontopathic bacteria. // New Microbiol. - 2003. - Vol.26. - N1. - P.47-56]. При этом были отмечены четкие корреляции между наличием данного микроба, кровоточивостью десен и наличием зубного камня у больных.

Известны способы диагностики патологических изменений микрофлоры полости рта путем обычного микробиологического исследования [Ушаков Р.В., Царев В.Н. Местное антимикробное лечение в стоматологии. М: МИА - 2004 - 136 с.]. Однако почти все представители микрофлоры пародонта являются анаэробными организмами. Поэтому хранение и транспортировка образцов биологического материала для последующего культивирования микроорганизмов из пародонта достаточно сложны и мало применимы в условиях клинических лабораторий. Кроме того, культивирование биомассы, содержащей много различных микробных видов, не всегда позволяет выявить все виды бактерий, присутствующие в исходной пробе в связи с различной способностью отдельных видов микробов к выживанию.

Известны способы диагностики патологических изменений микрофлоры полости рта путем микроскопии биоматериала зубного налета, позволяющая различить отдельные виды микроорганизмов по их характерному виду: размеры, форма, наличие оболочки, жгутиков и др. [Ушаков Р.В., Царев В.Н. Местное антимикробное лечение в стоматологии. М: МИА. - 2004. - 136 с.]. Однако методика этих способов является трудоемкой и менее точной в плане идентификации отдельных видов микробов. Кроме того, нет четкого критерия, по которому можно было бы судить о патологических изменениях микрофлоры.

В последние годы, по мере расшифровки последовательностей ДНК в микробных хромосомах, появилась возможность идентифицировать различные патогенные микроорганизмы по минимальным различиям в сходных участках их генома. Так были разработаны методы молекулярной гибридизации, в которых ДНК изучаемых микробов связывается со специфическими ДНК-зондами, и наличие искомой микробной ДНК легко определяется по окраске или флуоресцентному свечению. Ранее были предложены способы диагностики зубных микроорганизмов, основанные на этом принципе. Однако в последние 10 лет в микробиологии стал широко применяться метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК, основанный на избирательном размножении искомых участков ДНК, специфичных для данных микроорганизмов. ПЦР является оптимальным методом диагностики анаэробных бактерий, в том числе и пародонтопатогенов, что было продемонстрировано в эпидемиологических исследованиях групп здоровых лиц и стоматологических больных [Amano A., Kuboniwa M., Nakagawa I., Akiyama S., Morisaki I., Hamada S. Prevalence of specific genotypes of Porphyromonas gingivalis fimA and periodontal health status. // J. Dent. Res. - 2000. - Vol.79. - N9. - P.1664-1668}, [Sirinian G., Shimizu Т., Sugar C., Slots J., Chen C. (2002) Periodontopathic bacteria in young healthy subjects of different ethnic backgrounds in Los Angeles. // J. Periodontol. - 2002. - Vol.73. - N3. - P.283-288].

Известен способ мультиплексной ПЦР ДНК (применение нескольких видов специфических ДНК-зондов в общем реакционном объеме), заключающийся в том, что за время одного исследования определяют один из нескольких видов пародонтопатогенов (например, A.actinomycetemcomitans, В.forsythus, P.Gingivalis), предложенный Tran и Rudney [Tran S.D., Rudney J.D. Improved Multiplex PCR Using Conserved and Species-Specific 16S rRNA Gene Primers for Simultaneous Detection of Actinobacillus actinomycetemcomitans, Bacteroides forsythus, and Porphyromonas gingivalis. // J. Clin. Microbiol. - 1999. - Vol.37. - P.3504-3508].

Недостатком способа является отсутствие критериев патологических изменений микрофлоры полости рта. Способ носит чисто исследовательский характер и служит для подтверждения возможности выявления одного из нескольких видов пародонтопатогенов при постановке одной реакции ПЦР. Поэтому, строго говоря, по своему назначению данный способ не отнесен к способам диагностики патологических изменений микрофлоры полости рта. Однако по сходству существенных признаков, в том числе и по виду идентифицируемых микроорганизмов, был принят авторами в качестве прототипа заявляемого изобретения.

Задачей изобретения является создание способа диагностики патологических изменений микрофлоры полости рта, позволяющего одновременно идентифицировать три вида пародонтопатогенов и осуществлять диагностику по их сочетанию.

Технический результат изобретения заключается в повышении точности диагностики патологических изменений микрофлоры полости рта.

Указанный технический результат достигается тем, что в известном способе диагностики патологических изменений микрофлоры полости рта путем исследования ДНК, выделенной из биологических образцов полости рта, методом ПЦР ДНК с применением олигонуклеотидов, специфичных для A.actinomycetemcomitans, P.gingivalis, B.forsythi, согласно изобретению проводят одновременную идентификацию трех указанных видов микробов и при наличии положительной реакции на два и более из указанных видов диагностируют патологические изменения микрофлоры полости рта.

Новыми существенными признаками являются одновременная идентификация трех видов пародонтопатогенов методом ПЦР и неизвестный критерий диагностики патологических изменений микрофлоры полости рта.

Из существующего уровня техники авторам неизвестно достижение указанного технического результата за счет заявленных существенных признаков, поэтому изобретение отвечает критерию «изобретательский уровень».

Проведенные исследования выявили четкую взаимосвязь между стандартным показателем поражения пародонта (стандартный клинический критерий CPITN) и числом выявляемых микробных видов у больных, что позволяет установить критерий патологических изменений микрофлоры полости рта как наличие положительной реакции на два и более из указанных видов пародонтопатогенов в исследуемом образце.

Сущность способа поясняется чертежом, на котором отображена зависимость количества микробных видов от показателей клинического критерия CPITN в большой группе (400 жителей Санкт-Петербурга в возрасте от 12 до 65 лет).

Способ осуществляют следующим образом.

Стерильным одноразовым зондом проводят соскоб со спинки языка. Полученный образец биомассы переносят на стерильный бумажный эндодонтический штифт (размер - медиум). Взятие проб со щечной и лингвальной поверхностей зубов проводят после изоляции зубов стерильными валиками. Наддесневой налет вдоль края десны и по краям коронки снимают стерильным одноразовым зондом и переносят на стерильный бумажный эндодонтический штифт (размер - медиум). Поддесневые пробы забирают со щечной и лингвальной поверхностей шести зубов (с соблюдением представительства всех секстантов зубных рядов). При наличии зубо-десневых карманов забор материала проводят в области зубов с наибольшей глубиной пародонтального зондирования. После изоляции зубов стерильными валиками удаляют избыток слюны стерильным ватным тампоном, помещают стерильный бумажный эндодонтический штифт (размер - медиум) в мезиальную часть зубо-десневой борозды каждого зуба на 10 секунд. Бумажные штифты с пробами переносят в отдельную стерильную пластиковую пробирку типа Eppendorf (1,5 мл), содержащую 100 мкл 0,1 М раствора ЭДТА, и замораживают при -20°С до накопления партии образцов. Транспортировку партий проб в лабораторию осуществляют в термоконтейнерах с хладагентом. При поступлении образцов в лабораторию их помещают в морозильник (-20°С) и хранят там до момента экстракции ДНК.

Выделение ДНК осуществляют, например, следующим образом.

С целью адаптации метода к анализу биологических образцов (слюна, над- и поддесневая жидкость) и увеличения выхода ДНК из микроорганизмов была отработана специальная методика выделения ДНК, состоящая из нескольких этапов.

1) добавление к пробам 0,1 М раствора ЭДТА (0,2 мл), интенсивное встряхивание проб (центрифуга-вортекс Elmi), извлечение тест-штифта;

2) инкубация с протеиназой К (50 мкг) в течение 30 мин,

3) однократная отмывка клеток, ресуспендирование осадка в 0,1 мл буфера ТЕ;

4) инкубация в лизирующем растворе, содержащем детергенты и ДНК-сорбент фирмы ICN;

5) двукратная отмывка сорбента в спиртовом растворе и высушивание при 55°С (10 мин.) в твердотельном термостате;

6) элюция ДНК в буфер ТЕ при 55°С и осаждение сорбента;

7) использование супернатанта для ПЦР непосредственно или хранение препаратов ДНК в контейнерах при -20°С до использования в ПЦР.

Отмывки проб проводят при +4°С на центрифуге Eppendorf 5415R, а отмывки сорбента - на центрифуге MiniSpin или Centrifugette. Указанная методика позволяет проводить серийное выделение ДНК с достаточно большим выходом (чувствительность - 100-500 копий бактериального генома на ПЦР-реакцию).

Используют следующие методы ПЦР-исследования для отдельных видов возбудителей.

Для специфического выявления ДНК A. actinomicetemcomitans, P.gingivalis, В.forsythus были взяты за основу методические подходы, отработанные Tran & Rudney, 1999. Были оптимизированы условия реакции мультиплексной ПЦР с применением трех форвард-праймеров, специфичных для каждого из возбудителей, и одного общего реверс-праймера при использовании. Праймеры, использованные Tran & Rudney, 1999 (сегмент гена 16S рДНК) дополнительно проверены на специфичность по базам данных GenBank на август 2004 г.(WWW.NCBI.NLM.NIH.GOV).

Программы ПЦР дифференцированы с учетом оптимальных температур отжига для отдельных видов микроорганизмов.

Реакционная смесь для мультиплексной ПЦР ДНК трех пародонтогенных бактерий (АА, BF и PG) содержала следующие компоненты: 5х буфер для ПЦР с 15 мМ MgCl₂ и красителем альциановым синим (Амплисенс, Москва) - 3 мкл; смесь АТФ, ТТФ, ГТФ и ЦТФ по 30 мкмоль (Хеликон, Москва); специфические праймеры (форвард-праймеры) - по 0,15 мкM, реверс - по 0,3 мкM (Синтол, Москва); Taq-ДНК-полимеразу (Хеликон, Москва) (по 0,25 ME в пробе) и изучаемую ДНК или контроли (по 2,5 мкл в пробе) в общем объеме 15 мкл. ПЦР проводили в амплификаторе ICyder фирмы Bio-Rad по программе, использованной Tran & Rudney (1999).

Помимо опытных образцов (стоматологический биоматериал) при постановке ПЦР используют отрицательный контроль (дистиллированная вода вместо образца ДНК). В положительном контроле к ПЦР-смеси добавляют ДНК изучаемого микроорганизма. Для получения положительного контроля, обязательного при проведении ПЦР, выделяют образцы ДНК из чистых культур определяемых микроорганизмов. Для культивирования A. Actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, B. forsythi используют питательную среду Fastidious Gel производства фирмы Sigma. Культивирование чистых линий микроорганизмов осуществляют в анаэростате с азото-углекислотной газовой смесью. ДНК для образцов положительного контроля выделяют по вышеописанной методике.

Фракционирование продуктов амплификации.

Продукты амплификации после ПЦР вносят в 1,5%-ный агарозный гель с бромистым этидием. В соответствующих сериях опытов, в лунки геля вносят маркер молекулярного веса (100-1000 н.п.) (Amresco, США), а также контрольные образцы ДНК гингивальных бактерий (10⁴-10⁷ геном-эквив/мл) и проводят электрофорез в буфере ТВЕ в камере SE-2 (Хеликон, Москва) при 150 В (источник питания "Эльф-2", ДНК-Технология, Москва) в течение 30 мин. Просмотр и фотографирование гелей проводят на УФ-трансиллюминаторе ТСР-20М (Vilber Lourmat, США) при длине волны излучения 312 нм. Сохранение и обработку данных осуществляют с помощью гель-документирующей системы DocPrint.

Оценку результатов ПЦР можно учитывать в баллах, а именно: 0 (отсутствие патогенов), 1, 2, или 3 (наличие 1, 2 или 3 видов исследованных генов). Патологические изменения микрофлоры диагностируют при наличии двух и более видов исследуемых генов.

Способ иллюстрируется следующими клиническими примерами.

Пример 1. Макеева Е.В 02.05.1976 г. Жалобы на кровоточивость десен, запах изо рта. Сопутствующие заболевания: аллергический дерматит. Полость рта не санирована. Патология прикуса, гиперемия, отек межзубных десневых сосочков в области верхней челюсти и нижней челюсти, обильно кровоточат при пальпации, травмированы обильными над- и поддесневыми зубными отложениями, обильный мягкий зубной налет. Индекс гигиены (ИГ) - 3,5, папиллярно-маргинально-альвеолярный индекс (РМА) - 20%. Патологические карманы до 5 мм с густым серозным отделяемым, обнажение шеек и корней зубов до одной четвертой длины. Результаты исследования микрофлоры зубодесневых карманов методом ПЦР: P.gingivalis - положительный, A.actinomycetemcomitans - отрицательный, B.forsythus - положительный, то есть идентифицировано 2 вида патогенов, что подтверждает патологические изменения микрофлоры полости рта. Диагноз: Пародонтит хронический генерализованный 1.

Проведена профессиональная гигиена, антисептическая обработка полости рта, назначена антибактериальная и физиотерапия.

Осмотр после лечения: (ИГ - 2,2 РМА - 10%). Слизистая межзубных десневых сосочков бледно-розовая, при пальпации кровоточит незначительно, отделяемое из патологических карманов светлое, серозное. При повторном обследовании методом ПЦР обнаружен один вид патогенов, что отражает эффективность проведенного лечения.

Пример 2. Кузнецова Т.В. 25.05.1959. Жалобы на кровоточивость десен в области нижней челюсти в течение 2-х лет. Сопутствующих заболеваний нет.

Прикус нормальный, полость рта санирована, некариозные дефекты в области всех зубов, незначительная гиперемия, отек десневых сосочков в области нижней и верхней челюсти, над- и поддесневые зубные отложения в области верхней челюсти. ИГ=4,0; РМА=10%. Патологические карманы до 3,5 мм со светлым серозным отделяемым.

Результаты исследования микрофлоры зубодесневых карманов методом ПЦР:

Р.gingivalis - отрицательный, A.actinomycetemcomitans - положительный, B.forsythus - положительный, то есть идентифицировано 2 вида патогенов, что подтверждает патологические изменения микрофлоры полости рта.

Диагноз: Пародонтит хронический генерализованный, смешанная форма, патологическая резорбция эмали.

Проведена профессиональная гигиена, антисептическая обработка полости рта, реминерализующая терапия, гидромассаж, санация полости рта.

Осмотр после лечения: ИГ - 2,0; РМА - 5%.

Слизистая десневого края бледно-розового цвета, при пальпации не кровоточат, отделяемое из патологических карманов незначительное. При повторном обследовании методом ПЦР обнаружен один вид патогенов, что отражает эффективность проведенного лечения.

Пример 3. Поневина НА, 22.10.1964. Жалобы на кровоточивость десен во время чистки зубов. Сопутствующие заболевания: эндокринные заболевания, прикус N, полость рта не санирована, гиперемия, отек десневых сосочков в области верхней и нижней челюсти, обильно кровоточат при пальпации, травмированы обильными над- и поддесневыми зубными отложениями (ИГ=4,0 РМА=25%). Патологические карманы до 4 мм с обильным серозным отделяемым, обнажение шеек и корней зубов до одной четвертой длины.

Результаты исследования микрофлоры зубодесневых карманов методом ПЦР:

Р. gingivalis - положительный, A. actinomycetemcomitans - положительный, B. forsythus - положительный, т.е. идентифицировано 3 вида патогенов, что подтверждает патологические изменения микрофлоры полости рта.

Диагноз: Пародонтит хронический генерализованный 2.

Проведена профессиональная гигиена, антисептическая обработка полости рта, реминерализующая терапия, курс вакуум терапии.

Осмотр после лечения; ИГ - 2,5 РМА - 10%. Слизистая десневого края бледно-розового цвета, при пальпации не кровоточат, отделяемое их патологических карманов незначительное серозное. При повторном обследовании методом ПЦР обнаружены два вида патогенов, что отражает эффективность проведенного лечения.

Предлагаемым способом проводилось обследование 500 лиц, проживающих в Санкт-Петербурге. Образцы биологического материала забирали при прохождении профилактического обследования в школах или поликлиниках. Взятие проб биологических материалов проводили из ротовой жидкости, зубного налета.

Способ позволяет прогнозировать высокий риск заболевания при обнаружении патологических изменений микрофлоры полости рта, проводить своевременные профилактические и лечебные мероприятия, контролировать эффективность лечения заболеваний пародонта.

Изобретение относится к области медицины, а именно к стоматологии, и может использоваться для диагностики патологических изменений микрофлоры полости рта. Для осуществления способа исследуют ДНК, выделенную из ротовой жидкости или зубного налета больного, методом ПНР ДНК с применением олигонуклеотидов, специфичных для Actinobacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides. forsythi. При этом проводят одновременную идентификацию трех указанных видов микробов и при наличии положительной реакции на два и более из указанных видов диагностируют патологические изменения микрофлоры полости рта. Использование изобретения позволяет прогнозировать высокий риск заболевания при обнаружении патологических изменений микрофлоры полости рта, проводить своевременные профилактические и лечебные мероприятия, контролировать эффективность лечения заболеваний пародонта. 1 ил.

Способ диагностики патологических изменений микрофлоры полости рта путем исследования ДНК, выделенной из ротовой жидкости или зубного налета больного, методом ПЦР ДНК с применением олигонуклеотидов, специфичных для Actinobacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Bacteroides. forsythi, отличающийся тем, что проводят одновременную идентификацию трех указанных видов микробов, и при наличии положительной реакции на два и более из указанных видов диагностируют патологические изменения микрофлоры полости рта.