СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ЯЗВ РОГОВИЦЫ Российский патент 2008 года по МПК A61K35/14 A61F9/00 A61P27/02 

Изобретение относится к области медицины, офтальмологии, конкретно к способам лечения язв роговицы.

Наиболее близким к предлагаемому является способ лечения язв роговицы путем аутолимфокинотерапии, основанный на применении комплекса цитокинов, секретируемых мононуклеарами периферической крови [5, 6, 11]. Сущность метода состоит в следующем: мононуклеарные клетки выделяют из периферической крови пациента, помещают в культуральную посуду и в течение 3 часов инкубируют с лабораторным диагностикумом фитогемагглютинином. Затем клетки дважды отмывают раствором Хэнкса и вновь культивируют в течение 24 часов. Далее клетки осаждают центрифугированием и отбирают супернатант. После стерилизации супернатант расфасовывают в стерильные флаконы и хранят в морозильном отделении холодильника при -20°С. Лечение аутоцитокинами проводится в комплексе с базисной терапией в виде инсталляций по 2 капле 5 раз в день в течение 10 дней.

Однако широкое применение данного способа в клинической практике ограничено в связи с длительностью и трудоемкостью получения супернатанта в подготовительном периоде, также недостаточно высока эффективность способа и достаточно длителен курс лечения.

Новая техническая задача - повышение эффективности способа за счет сокращения сроков заживления язвенного дефекта, снижения числа осложнений при значительном упрощении способа.

Для решения поставленной задачи в способе лечения язв роговицы, включающем введение антибактериальных и противовоспалительных препаратов и инсталляцию в конъюнктивальную полость глаза клеточной взвеси мононуклеаров, выделенных из периферической крови больного, путем фракционирования в градиенте плотности, для инсталляций используют клеточную взвесь, полученную непосредственно после центрифугирования, которую отмывают и разбавляют не менее чем в три раза изотоническим раствором хлорида натрия, причем инсталляции проводят с частотой 6-8 раз в день и интервалом 3-4 дня, курс включает не менее 2 процедур.

Способ осуществляют следующим способом. Кровь, взятую из локтевой вены пациента в количестве 4,0-5,0 мл, помещают в стерильную пробирку, содержащую 1,0 мл гепарина. Аутологичные мононуклеары выделяют методом фракционирования в градиенте плотности (1,067-1,077 г/мл) на разделяющем растворе фиколл-верографин [2]. Взятую кровь в 2 раза разбавляют изотоническим раствором хлорида натрия и наслаивают на 3,0 мл смеси фиколл-верографина. Пробы центрифугируют в течение 15 минут при 800 g (2000 об/мин). Далее интерфазный слой, содержащий мононуклеары и располагающийся между плазмой и градиентом, забирают пипеткой. Добавляют 1,0 мл изотонического раствора хлорида натрия и полученную суспензию вновь центрифугируют в течение 7 минут при 400 g (1500 об/мин) для отмывания клеток. Чистота мононуклеаров, выделенных на градиенте фиколл-верографин, составляет 95-98%. После размещения в стерильный флакон и добавления 3,0 мл изотонического раствора хлорида натрия клеточную взвесь инсталлируют в конъюнктивальную полость больного глаза с частотой 6-8 раз в день каждые 3-4 дня в зависимости от степени тяжести заболевания и динамики клинической картины, выполняя не менее 2 процедур.

Лечение предлагаемым способом проводят на фоне традиционной фармакотерапии язв роговицы с использованием антибактериальных и противовоспалительных препаратов.

Необходимость разработки новых методов лечения язв роговицы обусловлена недостаточной эффективностью традиционной фармакотералии данного заболевания и высокой частотой развития осложнений. Согласно опубликованным данным [3, 7, 12, 13, 14] в 8-9% случаев патологический процесс завершается анатомической гибелью глаза, в 17% выполняется энуклеация в связи с безуспешностью лечения, в 23-25% наблюдается осложненное течение заболевания. Кроме того, к настоящему времени стали очевидными негативные эффекты применения антибактериальных препаратов: развитие дисбактериоза, подавление иммунитета, повышение резистентности микроорганизмов [3, 7, 17].

В последние годы появились исследования, свидетельствующие о возможности ускорения регенераторных процессов в поврежденной роговице под действием цитокинов, вырабатываемых мононуклеарными клетками периферической крови [5, 11].

Режим предлагаемого способа подобран на основании анализа данных клинических наблюдений за группой из 56 больных (56 глаз) с язвой роговицы различной степени тяжести. При этом тяжелый патологический процесс наблюдался у 67% больных, средней степени тяжести - у 33%. На момент обращения в стационар острота зрения в большинстве случаев (59%) составляла ниже 0,1, в 41% - 0,1-0,2. Сроки обращаемости составляли от 1 до 3-4 дней.

Бактериологическое исследование отделяемого язвенного дефекта выявило рост микрофлоры в 78,9% случаев. Патогенная микрофлора обнаруживалась в 63,4% и была представлена Pseud. aeruginosa - 42,1%, Staph. aureus - 21,1%. Условно патогенная микрофлора выявлялась в 15,5%, среди которой преобладали Staph. epidermidis - 5,2%, Е. coli - 10,5%.

Всем пациентам данной группы наряду с традиционным лечением (антибактериальные и противовоспалительные средства) выполнялись инсталляции свежеприготовленной, разбавленной изотоническим раствором хлорида натрия клеточной взвеси аутологичных мононуклеаров периферической крови с частотой 6-8 раз в день. В процессе лечения процедуру повторяли 2-3 раза с интервалом 3-4 дня в зависимости от степени тяжести заболевания и динамики клинической картины.

Контрольная группа была представлена 40 пациентами (40 глаз), получавшими аналогичное лечение без применения инсталляций аутологичных мононуклеаров крови.

Пациенты обеих групп сопоставимы по полу, возрасту и тяжести поражения роговицы.

Всем больным проводили общеофтальмологическое обследование, включавшее визометрию, периметрию, биомикроскопию, офтальмоскопию, определение чувствительности роговицы, флюоресцеиновую пробу, фоторегистрацию, исследование мазков конъюнктивы.

Интенсивность помутнения роговицы оценивали по 10-балльной шкале Войно-Ясенецкого.

Критерием выздоровления считали: устранение роговичного синдрома, резорбция некротических масс и инфильтрации стромы роговицы, рассасывание гипопиона, эпителизация роговицы, повышение остроты зрения.

Сравнительный анализ (табл.1) результатов лечения язв роговицы позволил выявить значительную эффективность применения инсталляций аутологичных мононуклеаров крови.

Так, например, срок очищения язвенного дефекта от некротических масс сократился в 1,5-2 раза по сравнению с контрольной группой (р<0,01). Рассасывание перифокального отека и инфильтрации стромы роговицы ускорилось на 35-40%. Как следствие, в более ранние сроки, чем в контрольной группе наступала эпителизация роговицы (в основной группе в среднем к 6,2±0,17 дню от начала лечения, в контрольной - к 11,0±0,16 дню). Число осложнений (формирование десцеметоцеле, перфорация роговицы, развитие эндофтальмита) уменьшилось в исследуемой группе в 2,5 раза.

Формирующееся в исходе язвы помутнение роговицы у пациентов основной группы было значительно меньшей интенсивности, чем у пациентов в группе контроля (по шкале Войно-Ясенецкого - 4,5 и 6,0 баллов соответственно). При этом у большинства больных контрольной группы помутнение роговицы выходило за пределы язвенного дефекта на 1,5-2,0 мм.

Применение инсталляций аутологичных мононуклеаров периферической крови согласно предлагаемому способу в комплексном лечении больных с язвенными поражениями роговицы положительно отразилось и на состоянии зрительных функций. На момент начала лечения острота зрения у пациентов обеих групп составляла 0,01-0,02. К окончанию лечения у пациентов основной группы острота зрения составляла в среднем 0,2-0,3, у пациентов контрольной группы - 0,09-0,1. При этом повышение остроты зрения до 0,4-0,5 отмечено в 46% случаев (25 человек) в основной группе и в 27% (10 человек) - в контрольной.

Важное в медико-социальном аспекте значение имеет также факт сокращения длительности пребывания пациентов основной группы в стационаре в среднем на 5,5±0,6 койко-дней.

Предлагаемый режим лечения основан на клиническом наблюдении, меньшая частота инсталляций аутологичных мононуклеаров периферической крови (3-4 раза в день) является недостаточной для достижения положительной динамики заболевания (очищение язвенного дефекта от некротических масс, купирование воспаления, эпителизация роговицы). С целью закрепления достигнутого терапевтического эффекта процедуру необходимо выполнить не менее 2 раз с интервалом 3-4 дня под обязательным контролем клинической картины. Однако необходимо отметить, что выполнение процедуры более 3 раз является нежелательным, т.к. в ряде случаев может привести к негативным последствиям (увеличение язвенного дефекта по площади и глубине).

На основании ранее проведенных экспериментальных и клинических исследований установлено, что функциональная активность свежеприготовленных мононуклеарных клеток сопоставима с таковой при культивировании клеток в стационарных условиях. Учитывая предложенную новую схему лечения патологии с частотой закапывания клеточной взвеси 6-8 раз в день, коротким курсом, была подтверждена возможность использования аутологичных мононуклеаров крови, полученных непосредственно после выделения и отмывания физраствором, предварительно разбавленным не менее чем в три раза, для получения клеточной взвеси с достаточной плотностью.

Клинический пример на осуществление способа

Больной М., 54 лет, обратился с жалобами на острую боль в правом глазу, светобоязнь, слезотечение, снижение зрения правого глаза.

Анамнез заболевания: во время ремонта автомобиля в правый глаз попало инородное тело. К окулисту обратился лишь через 2 дня. Инородное тело было удалено, назначено антибактериальное и противовоспалительное лечение. Однако пациент выполнял назначения нерегулярно, и через 6-7 дней вновь отметил ухудшение со стороны правого глаза, в связи с чем обратился в глазной травматологический пункт городской больницы скорой помощи.

Объективный осмотр:

Visus OD=0,03

OS=1,0

Биомикроскопия OD - смешанная инъекция, слезотечение, блефароспазм. Пальпаторно определяется цилиарная болезненность. На роговице парацентрально снизу язвенный дефект неправильной формы d=3,0 мм с рыхлыми, подрытыми краями. Дно язвы заполнено некротическими массами. Перифокально отмечаются отек и инфильтрация стромы роговицы. Передняя камера средней глубины. Гипопион 2,0 мм. Зрачок узкий, реакция на свет вялая. Рисунок радужки стушеван.

Офтальмоскопия OD затруднена.

Диагноз: посттравматическая гнойная язва роговицы правого глаза. Гипопионувеит правого глаза.

Назначено лечение: общее - внутримышечно Цефазолин 0,5 г 2 р. в день, Супрастин 1,0 мл 1 р. в день. Внутривенно Гемодез 250,0 мл 1 р. в день, внутрь Индометацин, Нистатин; местное - субконъюнктивально и парабульбарно Гентамицин, Стрептомицин, Мезатон, 5% раствора Хлорида натрия, инсталляции - Ципролет, Сульфацил натрия.

Дополнительно к местному лечению назначены инсталляции аутологичных мононуклеаров периферической крови 6-8 р. в день. С интервалом 3 дня процедура выполнена трижды.

Динамика течения заболевания

На 2-й день после инсталляций клеточной взвеси и соответственно 3-й день после госпитализации и начала лечения отмечена положительная динамика клинической картины.

Visus OD=0,06-0,07

Status localis OD: дно язвенного дефекта очистилось от некротических масс, уменьшились явления перифокальной инфильтрации стромы роговицы. Уровень гипопиона уменьшился до 1,0 мм.

После второй процедуры (8-й день после госпитализации и начала лечения):

Visus OD=0,1-0,2

Status localis OD: отмечается незначительная светобоязнь, умеренная цилиарная болезненность. Края язвенного дефекта стали значительно менее рыхлыми и подрытыми. Перифокально отмечается незначительный отек стромы роговицы. Дно язвы практически полностью покрыто эпителием. Влага передней камеры прозрачна. Рисунок радужки более рельефный. Зрачок средней ширины, округлой формы, реакция на свет несколько ослаблена.

После 3-й процедуры (12-й день после госпитализации и начала лечения):

Visus OD=0,5-0,6

Status localis OD: на роговице парацентрально снизу формируется нежное облаковидное помутнение на уровне передней трети стромы. Перифокально строма прозрачна. Влага передней камеры прозрачна. Рисунок радужки рельефный. Реакция зрачка на свет «живая».

При выписке из стационара (длительность пребывания в стационаре составила 16 койко/дней):

Visus OD=0,6-0,7

Status localis OD: на роговице парацентрально снизу облаковидное помутнение беловатого цвета. Остальные отделы роговицы прозрачные. Передняя камера средней глубины, влага прозрачная. Рисунок радужки рельефный, реакция зрачка на свет «живая».

Современные представления о биологической роли мононуклеаров основываются на их функциональной гетерогенности, включающей фагоцитарные, регуляторные и эффекторные свойства [4]. Однако в последние годы наряду с подробно изученными функциями миграции и хемотаксиса, эндоцитоза и внутриклеточного переваривания большое внимание исследователей привлекает секреторная функция мононуклеарных фагоцитов. Учение И.И.Мечникова о макрофагальных ферментах - цитазах, переросло в концепцию о монокинах - продуктах секреции моноцитов/макрофагов, которые вместе с лимфокинами получили название «цитокины». Современная трактовка мононуклеаров как секретирующих клеток основывается на их способности продуцировать и выделять более 75 различных видов молекул [4, 10]. Посредством цитокинов мононуклеары влияют на миграцию и пролиферацию гранулоцитов, эндотелиальных клеток, индуцируют хемотаксис и пролиферацию фибробластов, влияют на продукцию коллагена [8, 9, 10].

Попадая в очаг воспаления, мононуклеары испытывают влияние множества локальных факторов, включающих в себя как сам индуктор воспаления (например, микроорганизм), так и эндогенные флогогены - компоненты комплемента, простагландины и т.д. В результате происходит активация мононуклеарных фагоцитов, которая сочетается с ростом микробиоцидного и цитотоксического потенциала клеток-эффекторов воспаления.

Экзогенное введение аутологичных мононуклеаров периферической крови в конъюнктивальную полость при язвах роговицы позволяет создать локально высокую концентрацию клеток данной популяции в очаге экссудативно-деструктивного воспаления и направленно воздействовать на определенные стадии патологического процесса.

Можно предположить, что благодаря действию таких провоспалительных цитокинов, как интерлейкины - 1, 6, 8, фактор некроза опухоли и интерферон, происходит рекрутирование в очаг воспаления полиморфноядерных лейкоцитов с развитием респираторного взрыва, стимуляцией дегрануляции, индукцией синтеза и секреции лизосомальных ферментов и бактерицидных факторов, формированием аутокринного пути регуляции клеток [1, 8, 9].

Вследствие функциональной кооперации экзогенно вводимых мононуклеарных клеток и мигрирующих под их влиянием полинуклеарных фагоцитов в очаге экссудативно-деструктивного воспаления происходит ускоренное очищение от некротических масс, что подтверждается результатами клинического исследования, и переход воспалительного процесса в фазу репарации.

Необходимо отметить, что фибропластический процесс, ход которого находится под контролем множества механизмов, зарождается в недрах клеточной инфильтрации в очаге воспаления. Прежде всего фибропластический процесс зависит от структурно-функциональных параметров самих фибробластов, а также от формирующихся сложных каскадов межклеточных взаимодействий. Среди них важная роль принадлежит тандему «макрофаг-фибробласт» и триаде «лимфоцит-макрофаг-фибробласт» [8, 9, 15]. Связующей фигурой в указанных взаимодействиях является макрофаг.

Мононуклеары, как отмечалось выше, представляют собой источник многочисленных биорегуляторов, в том числе факторов, стимулирующих пролиферацию и другие функции фибробластов [8, 9, 15, 16]. Это обеспечивает один из центральных механизмов подключения фибробластов к репаративным процессам.

Безусловно, кроме монокинов, фибробласты воспринимают продукты лимфоцитов, нейтрофилов, тромбоцитов, эпителия. Пролиферацию фибробластов запускают тромбин и ряд протеиназ [8, 9]. Однако больше данных за то, что именно макрофаги ведут главный диалог с фибробластами, трансформируя через них часть собственного патогенетического потенциала, а также эффекторные возможности ряда других клеток и гуморальных факторов [15]. Другими словами, активированные макрофаги рассматриваются как важнейшее связующее звено между фибробластами и повреждением, фиброгенезом и гомеостазом.

Морфологически макрофагально-фибробластические взаимодействия ведут к миграции и ускоренной пролиферации фибробластов, их дифференцировке и продукции компонентов экстрацеллюлярного матрикса [9, 15], что обеспечивает закрытие язвенного дефекта соединительной тканью и формирование в исходе заболевания грубого помутнения роговицы.

Однако в зависимости от меняющихся по ходу воспалительного процесса условий мононуклеары за счет коллагенолитических ферментов и других гидролаз могут также участвовать в резорбции межуточного вещества, способны секретировать факторы, стимулирующие продукцию коллагеназы в фибробластах, и факторы, усиливающие фагоцитоз фибрилл фиброкластами [15].

В связи с этим можно предположить, что дополнительное экзогенное поступление в патологический очаг свежеприготовленной взвеси мононуклеарных клеток в предлагаемом режиме способствует включению механизмов подавления избыточного разрастания соединительной ткани, обеспечивая сопряжение воспаления и регенерации. Под влиянием гуморальных стимулов и факторов микроокружения большая часть фибробластов дифференцируется при этом в малоактивные фиброциты. Одновременно усиливается и феномен фиброклазии, что обеспечивает ремоделирование и инволюцию вновь образованной соединительной ткани. Клинически это проявляется формированием меньшего по площади и интенсивности помутнения роговицы.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет проводить эффективное лечение язв роговицы в более короткие сроки результаты при снижении числа осложнений.

Табл.1
Динамика течения бактериальной язвы роговицы в зависимости от метода леченияКлинический признакГруппа больныхосновнаяконтрольнаяЭпителизация роговицыначало3,7±0,155,6±0,16завершение6,2±0,1711,0±0,16Рассасывание инфильтрацииначало2,9±0,165,1±0,17завершение5,2±0,158,5±0,16Рассасывание гипопионаначало1,9±0,173,8±0,17завершение3,7±0,175,5±0,16Купирование воспаления8,2±0,1714,5±0,16

Список литературы

1. Васильева Г.И., Иванова И.А., Тюкавкина С.Ю. Кооперативное взаимодействие моно- и полинуклеарных фагоцитов, опосредованное моно- и нейтрофилокинами // Иммунология. - 2000. - №5. - С.11-17.

2. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 264 с.

3. Даутова З.А. Разработка и применение новых препаратов ранозаживляющего и антибактериального действия в офтальмологии: Автореф. дис. ... д-ра мед. наук, - Уфа, 2000. - 42 с.

4. Земсков В.М., Николаева Е.Н., Родионов С.В. Гетерогенность мононуклеарных фагоцитов // Успехи совр. биологии. - 1993. - Т.113, №3. - С.336-349.

5. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В. Иммуноцитокины и локальная иммунокоррекция // Иммунология. - 1995. - №1. - С.4-7.

6. Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Крайнева Т.А., Егорова Э.В. Аутолимфокинотерапия в стимуляции репаративных процессов тканей глаза // Вестник офтальмол. - 1993. - Т.109, №3. - С.8-9.

7. Майчук Ю.Ф. Принципы всемирной инициативы ВОЗ по ликвидации устранимой слепоты // Окулист. - 2003. - С.7-9.

8. Маянский А.Н., Пикуза О.И. Клинические аспекты фагоцитоза. - Казань: «Магариф», 1993. - 192 с.

9. Маянский Д.Н. Хроническое воспаление. - Москва: «Медицина», 1991. - 272 с.

10. Фрейдлин И.С. Дефекты цитокиновой сети и принципы их коррекции // Иммунология. - 1998. - №6. - С.23-25.

11. Хорошилова-Маслова И.П., Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Гундорова Р.А. Механизм регуляции заживления проникающих ранений роговицы с помощью естественного комплекса цитокинов // Вестник офтальмол. - 1995. - Т.3, №4. - С.14-19.

12. Шаимова В.А. Особенности гнойных язв роговицы, вызванной ношением контактных линз // Материалы II Евро-Азиатской конференции по офтальмохирургии. - Екатеринбург, 2001. - С.243-244.

13. Шаимова В.А. Гнойные язвы роговицы // Тез. докл. VII Съезда офтальмологов России. - Москва, 2000. - С.52-53.

14. Шаимова В.А. Клиника гнойной язвы роговицы // Актуальные проблемы клинической офтальмологии. - Челябинск, 1999. - С.104-106.

15. Шехтер А.Б., Серов В.В. Воспаление, адаптивная регенерация и дисрегенерация (анализ межклеточных взаимодействий) // Арх. патологии. - 1991. - Т.53, №7. - С.7-14.

16. Шубич М.Г., Авдеева М.Г. Медиаторные аспекты воспалительного процесса // Арх. патологии. - 1997. - Т.59, №2. - С.3-8.

17. Najjar D.M., Aktan S.G., Rapuano C.J. Contact lens-related corneal ulcres in complicant patients // Am. J. Ophthalm. - 2004. - Vol.137, №1. - P.170-172.

Изобретение относится к области медицины, офтальмологии, конкретно к способам лечения язв роговицы. Осуществляют выделение клеточной взвеси мононуклеаров из периферической крови больного путем фракционирования в градиенте плотности. Используют клеточную взвесь, полученную непосредственно после центрифугирования 4 мл крови. Отмывают и разбавляют взвесь 3,0 мл изотонического хлорида натрия. Инсталлируют взвесь с частотой 6-8 раз в день и интервалом 3-4 дня, курс включает 2-3 процедуры. Способ позволяет повысить эффективность лечения за счет сокращения сроков лечения. 1 табл.

Способ лечения язв роговицы, включающий введение антибактериальных и противовоспалительных препаратов и инсталляцию в конъюнктивальную полость глаза клеточной взвеси мононуклеаров, выделенных из периферической крови больного путем фракционирования в градиенте плотности, отличающийся тем, что для инсталляций используют клеточную взвесь, полученную из 4 мл крови непосредственно после центрифугирования, которую отмывают и разбавляют не менее чем в три раза изотоническим раствором хлорида натрия, причем инсталляции проводят с частотой 6-8 раз в день и интервалом 3-4 дня, курс включает 2-3 процедуры.