ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI BL21/pPINS07(BL07)-ПРОДУЦЕНТ ПРОИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2006 года по МПК C12N15/17 C12N1/21 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генной инженерии, и касается нового штамма бактерий Escherichia coli, который может быть использован для получения высокоочищенного генно-инженерного инсулина человека для изготовления лекарственных препаратов, применяемых при лечении сахарного диабета.

Известен штамм Е.coli O17/pTrpZZ-R-proinsulin - продуцент рекомбинантного инсулина человека (Nilson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M., 1996, Journal of biotechnology, v.48, 241-250).

В этом случае штамм - хозяин представляет собой производное Е.coli К12 (F^- sup⁺) и содержит неизмененными подавляющее большинство генов штамма дикого типа (Yanisch-Perron С., Vieira J., Messing J., 1985, Gene, v.33, 103-119). Недостатками данного штамма являются присутствие генов RecA-зависимой системы рекомбинации, что отрицательно сказывается на стабильности рекомбинантной плазмиды, а также наличие всех генов внутриклеточных и мембранных протеолитических ферментов, которые деградируют белковый продукт экспрессии проинсулинового гена, уменьшают выход рекомбинантного инсулина и затрудняют его очистку.

Известен наиболее близкий по технической сущности к предлагаемому изобретению штамм-продуцент проинсулина человека (Пат. РФ №2141531, МКИ С 12 Р 21/02, опубл. 1999 г.). В данном случае клетки Е.coli JМ109 (recA1 supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi Δ (lac-proAB)) содержат рекомбинантную плазмиду pрINS07, которая экспрессирует гибридный полипептид, включающий аминокислотную последовательность проинсулина человека. Клетки данного штамма-хозяина не обладают способностью к RecA-зависимой рекомбинации, что стабилизирует рекомбинантные плазмиды, и содержат удобные генетические маркеры (Olsson M.O., laaksson L.A., Mol. Gen. Genet., 1979., v.169, 251-257). Однако им характерна система протеолиза, типичная для штаммов Е.coli дикого типа, функционирование которой приводит к накоплению в клетках во время индукции гибридного гена, а также при получении телец включения продуктов протеолитической деградации рекомбинантного предшественника инсулина. Данная особенность штамма затрудняет проведение эффективного процессинга инсулина и понижает выход конечного продукта.

Изобретение решает задачу создания штамма бактерий Escherichia coli - продуцента рекомбинантного проинсулина человека, с повышенной внутриклеточной стабильностью.

Поставленная задача решается за счет создания штамма бактерий Escherichia coli BL07, продуцента рекомбинантного проинсулина человека, содержащего плазмидную ДНК pINS07, определяющую синтез проинсулина.

Штамм получают трансформацией плазмидной ДНК рpINS07 клеток Е.coli BL21. Трансформантов отбирают на селективной агаризованной питательной среде, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, по резистентности к антибиотику, т.е. способности к росту в его присутствии. Плазмида pрINS07 является рекомбинантной, содержит искусственный ген, кодирующий гибридный полипептид, состоящий из одного IgG-связывающего домена белка А из Staphylococcus aureus, пептидного линкера His₆GlySerArg и проинсулин человека, гибридный tac-промотор и терминатор рибосомного оперона E.coli, а также ген bla, кодирующий β-лактамазу, которая придает клеткам устойчивость к ампициллину. Содержание рекомбинантного проинсулина человека в предлагаемом штамме составляет не менее 25% суммарного клеточного белка.

Штамм Escherichia coli BL07 имеет следующие характеристики:

Культурально-морфологические признаки.

Клетки мелкие палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные, 1×3,5 мкм, подвижные.

Штамм хорошо растет на обычных питательных средах (МПА, МПБ, LB-бульон, LB-агар, минимальная среда с глюкозой). При росте на агаризованной среде LB колонии круглые, гладкие, полупрозрачные, блестящие, серые. Край ровный, диаметр колоний 1-3 мм, консистенция пастообразная. Рост в жидких средах (LB, минимальная среда с глюкозой) характеризуется ровным помутнением, осадок легко седиментирует.

Физиолого-биохимические признаки.

Клетки растут при 4-42°С, оптимум рН 6,8-7,6. В качестве источника азота используют как минеральные соли аммония, так и органические соединения: аминокислоты, пептон, триптон, дрожжевой экстракт. В качестве источника углерода при росте на минимальной среде используют глицерин, углеводы, аминокислоты.

Генетические признаки.

F^- ompT hsdS_В(r_В ^- m_В ⁺) gal dcm. Проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием генов устойчивости в ДНК рекомбинантной плазмиды pINS07.

Условия хранения штамма

Штамм бактерий Escherichia coli BL07 хранят на чашках и косяках при 4°С. Пересевы на свежие среды один раз в месяц. Может храниться не менее года в среде LB, содержащей 30% глицерин, при -20-70°С.

Устойчивость к антибиотикам: клетки штамма-продуцента проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл), обусловленную наличием генов устойчивости в ДНК рекомбинантной плазмиды pPINS07.

Преимуществом полученного штамма Е.coli BL07 перед штаммами-продуцентами прототипа является возрастание внутриклеточной стабильности рекомбинантного проинсулина человека как следствие неактивного состояния генов lon и ompT, кодирующих соответственно АТР-зависимую протеиназу и протеиназу внешней мембраны бактериальных клеток. Вследствие этого, в клетках нового штамма отсутствуют продукты деградации предшественника инсулина, затрудняющие его очистку при использовании штамма-прототипа, что сопровождается повышением выхода очищенного рекомбинантного инсулина человека.

Изобретение иллюстрирует пример.

Пример.

Штамм Escherichia coli BL07 получают путем введения ДНК плазмиды pPINS07 в компетентные клетки Escherichia coli BL21 с помощью электропорации. Для получения компетентных клеток, бактериальные клетки исходного штамма Е.coli BL21 F^- ompT hsdS_В(r_В ^- m_В ^-) gal dcm, полученного из музея ГосНИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов (г.Москва), выращивают в жидкой среде LB в течение ночи при 37°С и используют для засева 1 литра той же среды. Культуру выращивают до ранней лог-фазы на качалке при интенсивной аэрации, быстро охлаждают во льду, клетки осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 8000 об/мин на центрифуге JA21 (Beckman, США), дважды промывают деионизованной водой и один раз - 30% глицерином, охлажденными до 4°С, суспендируют в 2 мл 30% глицерина, разливают в пробирки "Эппендорф" по 40 мкл, быстро замораживают и хранят при -70°С.

Плазмиду pPINS07 получают из клеток ночной культуры Е.coli JM 109/pPINS07 стандартным щелочным методом (Maniatis, Т., Fritsch, Е. F. and Sambrook, J. (1982) Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) и используют для введения в компетентные клетки Е. coli BL21 с помощью электропорации. Для этого к 40 мкл суспензии компетентных клеток во льду добавляют 2 мкл плазмидной ДНК, инкубируют 5 мин, смесь подвергают кратковременному электрическому импульсу на электропораторе CellTec (EuroGenTec, Франция), к ней добавляют 1 мл холодного бульона LB, инкубируют сначала во льду в течение 10 мин, а затем в течение 1 часа при 37°С. После этого 50-200 мкл суспензии бактериальных клеток высевают на чашки Петри с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина. Чашки инкубируют в течение ночи при 37°С, бактериальные клетки нескольких выросших колоний используют для независимого засева микробиологических пробирок с 5 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, с последующим выращиванием бактериальных клеток на качалке при 37°С в течение ночи. После этого в пробирки добавляют глицерин до конечной концентрации 30%, суспензию клеток разливают в пластиковые ампулы и хранят при -70°С.

Изобретение относится к генной инженерии и касается нового штамма бактерий Escherichia coli, который может быть использован для получения высокоочищенного генно-инженерного инсулина человека. Путем трансформации клеток E.coli BL21 плазмидной ДНК pINS07, определяющей синтез проинсулина, получают штамм бактерий Escherichia coli BL21/pРINS07(BL07) - продуцент рекомбинантного проинсулина человека. Изобретение решает задачу повышения внутриклеточной стабильности рекомбинантного проинсулина человека.

Штамм бактерий Escherichia coli BL21/pРINS07(BL07) - продуцент рекомбинантного проинсулина человека, содержащий плазмидную ДНК pРINS07.