СПОСОБ СОЗДАНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО АДЕНОВИРУСА ПТИЦ ДЛЯ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ Н5N1 Российский патент 2008 года по МПК C12N7/01 

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии вирусов и касается оригинальной технологии получения рекомбинантного аденовируса птиц CELO, содержащего ген гемагглютинина вируса гриппа птиц, либо ген нейраминидазы вируса гриппа птиц под контролем эукариотического промотора, либо оба гена одновременно, и может быть использовано в ветеринарии для создания генно-инженерных рекомбинантных вакцин нового поколения.

Вирус гриппа птиц является опасным инфекционным агентом, вызывающим массовый падеж птицы. Одним из подходов к решению проблемы является создание эффективного вакцинного препарата против вируса птиц на основе инактивированного вируса. Однако инактивированные вакцины не отвечают всем требованиям эффективности и безопасности, которые предъявляются в настоящее время к вакцинам для человека и животных. В связи с этим проводят разработку кандидатных маркерных рекомбинантных вакцин на основе аденовирусных векторов человека и животных (Hum Gene Ther. 2005, V 16, p.157-168; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004, V.101, p.14567-14571). Рекомбинантные аденовирусы по сравнению с другими векторными системами отличаются высокой эффективностью экспрессии трансгена в различных типах клеток, безопасностью вектора для человека и животных, накоплением рекомбинантных вирусов в клетках-продуцентах в высоком титре, индукцией как гуморального, так и клеточного иммунного ответа на трансгенный продукт в организме человека и животных, большой пакующей емкостью вектора и т.д.

Создание генетической конструкции на основе аденовируса птиц CELO chicken embryo lethal orphan (аденовируса птиц 1 серотипа FAV-1) имеет ряд практических преимуществ. Вирус CELO является инфекционным агентом, но при этом вызываемая им инфекция не несет значительных экономических последствий или угрозы здоровью птицы. Данный вирус может быть выделен от здоровых цыплят и не вызывает заболевания в результате экспериментального заражения цыплят (Vaccine 2004, V.22, р.2351-2360). Рекомбинантные аденовирусы птиц CELO, экспрессирующие гены протективных (защитных) антигенов различных патогенов, обладают выраженным тропизмом по отношению к эпителиальным тканям птиц. Это позволяет осуществлять эффективную и пролонгированную экспрессию целевого гена в организме иммунизированных птиц, что, в свою очередь, приводит к формированию у них мощного специфического гуморального и цитотоксического иммунного ответа против патогена. Дополнительным преимуществом рекомбинантных аденовирусов птиц CELO является низкая себестоимость получения препаративных количеств вируса в аллантоисе куриного эмбриона - безопасной и высокотехнологичной системе, традиционно использующейся для производства вакцин. В связи с этим рекомбинантный вирус CELO был использован для клонирования гена VP2 вируса инфекционного бурсита птиц (IBDV) (Vaccine 2004, V.22, р.2351-2360) и гена гликопротеина G вируса бешенства (Микробиология, 2006, т.4, с.69-71). Полученные рекомбинантные аденовирусы CELO были использованы для вакцинации животных и птиц. Результаты экспериментов продемонстрировали, что иммунизированные животные были защищены от патогенных штаммов вирусов, что подтверждает хорошие перспективы использования рекомбинантного аденовируса CELO для создания векторных вакцин для использования в ветеринарии.

Гемагглютинин и нейраминидаза являются поверхностными антигенами вируса гриппа. Эти белки отвечают за первичное взаимодействие вируса с клеткой хозяина, характеризуются гетерогенностью и изменчивостью. Известно 16 подтипов гемагглютинина (H1-16), которые в совокупности с подтипами белка нейраминидазы (N1-9) определяют подтипы вируса гриппа. Наличие иммунного ответа организма на антигенные белки гемагглютинина и нейраминидазы привело к использованию кодирующих последовательностей вышеназванных белков при создании рекомбинантных плазмид для вакцинации человека и животных. Так, известно, что нуклеотидную последовательность гемагглютинина вируса гриппа человека клонировали в челночный плазмидный вектор. В результате гомологичной рекомбинации был получен рекомбинантный аденовирус человека 5-го серотипа (Ad5) с целью его дальнейшего использования в качестве вакцины для человека и животных против патогенного штамма вируса гриппа (Vaccine, 2005, V 23, р.1029-1036). Ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N1 клонировали в человеческий аденовирус 5-го серотипа также с целью использования полученного рекомбинантного вируса как вакцины для человека, животных и птиц (Vaccine, 2006, J. of Virology, 2006, V.80, №4, p.1959-1964). В результате было показано, что рекомбинантный человеческий аденовирус 5-го серотипа, несущий экспрессирующую кассету с геном гемагглютинина вируса гриппа птиц, вызывает образование высокого уровня антител к патогенному штамму вируса в исследованных организмах. Однако, что касается вакцинации птиц, существует возможность повышения эффективности действия подобной вакцины путем использования рекомбинантного вектора на основе аденовируса птиц CELO (chicken embryo lethal orphan), для которого птица является природным хозяином.

Для получения рекомбинантных аденовирусов используют несколько способов. Первый включает направленное лигирование гена с аденовирусным геномом (Маниатис Т. и др. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984). Так как геном аденовирусов имеет размер порядка 40000 н.п. и содержит незначительное число уникальных сайтов рестрикции, этот способ технически сложен и нерезультативен. Второй способ основан на использовании фага лямбда, который также ограничивает возможности при получении рекомбинантных аденовирусов (J. Virology, 2001, V.75, N11, p.5288-5301). Третий способ основан на клонировании целевого гена в «shuttle»-векторе, который содержит участки, гомологичные концевым фрагментам генома аденовируса, с последующей гомологичной рекомбинацией, в результате которой происходит перенос целевого гена в геномную ДНК аденовируса.

Для получения рекомбинантного вируса CELO с помощью гомологичной рекомбинации используют полную геномную ДНК вируса CELO или плазмиду, содержащую полную геномную ДНК вируса CELO, а также плазмидную конструкцию, одновременно содержащую правый и левый участки генома CELO и экспрессирующую кассету из целевого гена под контролем эукариотического промотора и сигнала полиаденилирования. Экспрессирующая кассета содержится либо в левом участке генома CELO, либо в правом участке. В правом участке генома CELO из плазмидной конструкции осуществляют два вида делеций, либо в области 33358-43684 н.п., либо в области 41731-43684 н.п. в связи с ограничением пакующей емкости вирусной частицы (US, 6841158, 2005), при этом в область делеций 41731-43684 н.п. клонируют экспрессирующую кассету с одним целевым геном в связи с ограничением области до 2153 н.п.

За счет гомологичных участков плазмидной конструкции с экспрессирующей кассетой и полной геномной ДНК вируса CELO в клетках Е. coli проводят гомологичную рекомбинацию, результатом которой является получение плазмиды с полным геномом CELO и включенной экспрессирующей кассетой. Полученную плазмиду путем трансфекции вводят в пермиссивную (подходящую для размножения) для вируса CELO линию клеток гепатомы петуха леггорна (leggorn male hepatoma) LMH (J. Virology 1999, V.73, p.1399-1410). Данный способ имеет ограничения в использовании, поскольку из-за большого размера генома CELO (около 44 тыс.н.п.) целевые вставки должны быть ограниченного размера, а проведение их клонирования в несколько этапов приводит к увеличению затрат на получение вакцины.

Задачей изобретения является создание эффективного способа для получения рекомбинантного аденовируса птиц CELO с большей емкостью для клонирования целевых генов, экспрессия которых способствует иммунизации животных, например гена гемагглютинина или (и) гена нейраминидазы вируса гриппа птиц H5N1 для проведения вакцинации птиц.

Поставленные задачи решаются тем, что в способе создания рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации против вируса гриппа птиц H5N1 выбирают геномную ДНК аденовируса птиц CELO с делегированным фрагментом, несущественным для репликации, затем конструируют плазмидную конструкцию с зонами, гомологичными нуклеотидной последовательности геномной ДНК аденовируса птиц CELO, между которыми образуют делецию в 3620 н.п. для увеличения пакующей емкости вируса CELO, в область которой клонируют, как минимум, одну экспрессирующую кассету, состоящую из промотора, обеспечивающего высокий уровень экспрессии в эукариотических клетках, из, как минимум, одного целевого гена и из сигнала полиаденилирования. Гомологичную рекомбинацию проводят в культуре клеток гепатомы петуха леггорна (LMH), обеспечивая получение генетической конструкции рекомбинантного аденовируса, состоящего из геномной ДНК аденовируса птиц CELO, из нуклеотидной последовательности плазмидной конструкции, включающей в свою последовательность, как минимум, одну экспрессирующую кассету, при этом в культуре клеток LMH происходит сборка рекомбинантного вируса CELO с, как минимум, одной экспрессирующей кассетой. В качестве целевого гена в составе экспрессирующей кассеты используют либо ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N1, либо ген нейраминидазы вируса гриппа птиц H5N1, либо два вышеназванных гена одновременно. Полученный рекомбинантный аденовирус птиц используют в качестве вакцины для иммунизации животных к вирусу гриппа птиц H5N1.

Изобретение поясняется чертежами, где на Фиг.1 изображен полный геном аденовируса птиц CELO с уникальным сайтом рестрикции Swa I. На Фиг.2 изображен плазмидный вектор pCBEd13kb с одним правым концевым участком генома аденовируса птиц CELO, делетированным на 3620 н.п., и экспрессирующей кассетой в месте делеции, состоящей из эукариотического промотора, полилинкера для клонирования целевых генов и сигнала полиаденилировния. На Фиг.3 показана гомологичная рекомбинация в клетках LMH между геномом аденовируса птиц CELO, гидролизованным по уникальному сайту рестрикции Swa I и плазмидной конструкцией pCBEd13kb, содержащей в своем составе экспрессирующую кассету из эукариотического промотора, целевого гена (генов) для вакцинации и сигнала полиаденилирования. На Фиг.4 изображен полный геном рекомбинантного вируса CELO, содержащий в своем составе экспрессирующую кассету из эукариотического промотора, целевого гена (генов) для вакцинации и сигнала полиаденилирования. На Фиг.5 показано наличие экспрессии целевого гена гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N1 для вакцинации животных в клетках LMH, зараженных рекомбинантным вирусом CELO-HA, содержащим в своем составе экспрессирующую кассету из эукариотического промотора, целевого гена для вакцинации и сигнала полиаденилирования. При этом LMH-HA - лизат клеток линии LMH, инфицированных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, содержащим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц, LMH - лизат клеток линии LMH, инфицированных контрольным вирусом CELO-d13kb, не содержащим гена гемагглютинина, 1 - гемагглютинин вируса гриппа в количестве 3 нг на трек., 2 - гемагглютинин вируса гриппа в количестве 10 нг на трек, 3 - гемагглютинин вируса гриппа в количестве 30 нг на трек.

Геном аденовируса птиц CELO состоит из 43804 н.п., при этом правый концевой участок генома, который имеет размер 43685-43804 н.п. и находится после сайта рестрикции Swa I, содержит инвертированные повторы, необходимые для репликации вируса в клетках, отмечен на Фиг.1 цифрой I. Удаление данного участка обеспечивает эффективное получение рекомбинантного аденовируса птиц непосредственно в клетках LMH, где происходит сборка и размножение вируса.

Аналогичный участок 43685-43804 н.п. генома CELO содержится в составе плазмидной конструкции pCBEdl3kb, которая изображена на Фиг.2. Также данный вектор содержит участок генома аденовируса птиц CELO от 36278 н.п. до 40065 н.п., который обозначен цифрой II. Участки I и II являются нуклеотидными последовательностями, составляющими правый концевой участок генома CELO. Между участками генома CELO 40065 н.п. и 43685 н.п. имеется делеция в 3620 н.п., при этом ее размер больше на 1467 н.п., чем у известных прототипов. Это позволяет увеличить размер и количество целевых генов, необходимых для введения в геном аденовируса птиц CELO. По месту делеции в плазмидной конструкции pCBEd13kb клонирована экспрессионная кассета, которая обозначена на Фиг.2 цифрой III. При этом кассета состоит из эукариотического промотора (III-1), например промотора цитомегаловируса человека CMV, полилинкера с сайтами для клонирования целевых генов для вакцинации животных (III-2) и сигнала полиаденилирования, например гена бычьего гормона роста BGH p(A) (III-3).

Для получения рекомбинантного аденовируса птиц CELO, содержащего в своем составе экспрессирующую кассету с целевыми генами для вакцинации животных, проводят в необходимой для размножения вируса культуре клеток петуха леггорн LMH рекомбинацию, как показано на Фиг.3, между гомологичными участками II из гидролизованного генома CELO по уникальному сайту Swa I и участку II из плазмидной конструкции pCBEdl3kb.

В результате в клетках LMH создается полный геном аденовируса птиц CELO (Фиг.4), в котором вместо участка 40065-43685 н.п. содержится экспрессионная кассета (III) с целевым геном (генами) для вакцинации животных, например генами гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа птиц H5N1, под контролем промотора и сигнала полиаденилирования.

Целевой ген (гены) экспрессируется под контролем эукариотического промотора в зараженных рекомбинантным аденовирусом птиц CELO клетках и белковый продукт трансгена, например гена гемагглютинина вируса гриппа птиц, обнаруживают в достаточном количестве для проведения вакцинации, как показано на Фиг.5.

Основной характеристикой, отличающей новый способ получения рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации животных от описанного прототипа, является получение рекомбинантного аденовируса птиц CELO, способного к репликации и упаковке при увеличенном размере вставки чужеродной ДНК в его геном непосредственно в культуре клеток LMH, минуя стадию с использованием клеток Е. coli.

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Создание плазмидной конструкции pCBEdl3kb с участками генома CELO и получение рекомбинантного аденовируса птиц CELO с большим размером вставки чужеродной ДНК к п.1 формулы изобретения.

Фрагмент генома аденовируса CELO, который изображен на Фиг.1, от 36278 н.п. до 40065 н.п. амплифицируют при помощи метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). Клонирование полученного фрагмента проводят в плазмидном векторе pBluescript II KS(+) («Fermentas», Латвия) по сайтам для рестриктаз ClaI и KpnI (№ ER 0141, ER 0521 «Fermentas», Латвия) (Т.Маниатис и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984). Наличие вставки подтверждают с помощью рестрикционного анализа, используя рестриктазы Xhol и Xbal. Из полученного плазмидного вектора pBS-CELO-R указанный фрагмент аденовирусного генома субклонируют в плазмиде pCBEdlRV (Мол. Генетика, микробиология и вирусология, 2002, №2, стр.30-35), несущей фрагмент генома аденовируса CELO 43685-43804 н.п. по сайтам для рестриктаз KpnI и Есо32I. Рестрикционный анализ проводят по сайтам XhoI, XbaI и Есо32I. В полученный челночный плазмидный вектор pCBEdlRVnew, который содержит правый фрагмент генома вируса CELO с делецией размером 3620 н.п., по сайту Есо32I клонируют экспрессирующую кассету из плазмиды pcDNA 3.1.Zeo + (Invitrogen, США), гидролизованной по сайтам Bg1II и PvuII (№ ER 0081, ER 0631 «Fermentas», Латвия) и обработанной фрагментом Кленова (Klenow fragment №ЕР0051 «Fermentas», Латвия). Рестрикционный анализ полученной плазмидной конструкции проводят по сайтам Есо32I и XbaI. Новая плазмидная конструкция pCBEdl3kb изображена на Фиг.2, содержит экспрессирующую кассету с промотором области Е1 цитомегаловируса человека CMV, полилинкером для клонирования целевых генов для вакцинации животных и сигналом полиаденилирования гена бычьего гормона роста BGH p(A), а также участки генома вируса CELO 36278-40065 н.п. и 43685-43804 н.п. с увеличенным объемом вставки чужеродной ДНК до 3620 н.п..

Геном аденовируса птиц CELO, показанный на Фиг.1, гидролизуют по уникальному сайту рестрикции Swa I с целью удаления участка с 43567 н.п. по 43804 н.п., содержащего инвертированные повторы, необходимые для репликации вируса CELO. Плазмидную конструкцию pCBEdl3kb совместно с ДНК вируса CELO, гидролизованной рестриктазой Swa I, котрансфецируют в клетки гепатомы петуха леггорна LMH методом кальциево-фосфатной преципитации (J. Gen. Virol., 1977). В результате гомологичной рекомбинации, которая показана на Фиг.3 между фрагментом гидролизованного вирусного генома CELO и фрагментом этого же генома 36278-40065 н.п., находящимся в плазмидной конструкции, в клетках LMH получают полный рекомбинантный вирус CELO (Фиг.4), рекомбинантность которого подтверждают с помощью метода ПЦР.

Пример 2. Получение и клонирование кДНК-копии гена гемагглютинина вируса гриппа птиц в плазмидной конструкции pCBEd13kb к п.2 формулы изобретения.

Ген гемагглютинина вируса гриппа птиц получают путем амплификации кДНК, синтезированной методом ОТ-ПЦР (Reverse Tpanscription System «Invitrogene» №12236014, USA) на матрице РНК, выделенной из вируса гриппа птиц штамма A/duck/Novosibirsk/56/2005(H5N1) с использованием TRIZOL («Invitrogene» №15596-018, USA). Для ПЦР используют олигонуклеотиды, фланкирующие полный ген гемагглютинина 5'-caatgatggagaaaatagtgcttct и 5'-gaccttaaatgcaaattctgcattgtaac, подобранные согласно последовательности гена гемагглютинина штамма (gene bank DQ234078.1). Реакцию амплификации проводят в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкг кДНК, 10 пкМ каждого праймера, 67 мМ трис-HCl (рН 8,8 при 25°С), 15 мМ сульфата аммония, 2,5 мМ хлористого магния, 0,01% Твин-20, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дТТФ и дГТФ, по 2,5 мМ) и 1 ед. Taq-ДНК-полимеразы под вазелиновым маслом при следующих условиях: 94°С - 5 мин; 5 циклов: 58°С - 2 мин, 72°С - 20 с и 94°С - 30 с; 20 циклов: 58°С - 30 с, 72°С - 20 с и 94°С - 30 с; затем 58°С - 5 мин и 72°С - 10 мин. Продукт амплификации обрабатывают хлороформом, переосаждают этиловым спиртом и растворяют в бидистиллированной воде. Фрагмент ДНК, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа птиц, клонируют в плазмидном векторе pGEM-T Easy («Promega» № A 1360). Клонирование проводят согласно протоколу, приложенному к набору для клонирования ПЦР-продуктов pGEM-T Easy.

Полученной лигированной смесью трансформируют клетки Е. coli DH5α C1Rb-методом. Трансформированные клетки отбирают на агаризованной среде LB с антибиотиком ампициллином (40 мкг/мл). Плазмидную ДНК выделяют методом щелочного лизиса, анализируют с помощью рестриктаз EcoRI, Eco32I, NcoI (№ ER 0271, ER 0301, ER 0571 «Fermentas», Латвия) и отбирают клоны, несущие плазмиду ожидаемого размера (4750 н.п.). Первичную структуру клонированного фрагмента в полученной плазмиде pGEM-HA подтверждают рестрикционным картированием по эндонуклеазам рестрикции Bg1I и Есо52I (№ER0071, ER0331 «Fermentas», Латвия) и секвенированием по методу Сэнгера.

Для получения плазмидной конструкции рСВЕd13kb/НА кДНК-копию гена гемагглютинина (НА) из плазмиды pGEM-HA, гидролизованной по сайту NotI (№ ЕР 0591 «Fermentas», Латвия) и обработанной фрагментом Кленова, клонируют в векторе pCBEd13kb по сайту для рестриктазы Eco32I под контроль CMV-промотора и сигнала полиаденилирования. Наличие гена гемагглютинина в полученной конструкции pCBEd13kb/HA подтверждают рестрикционным анализом при использовании эндонуклеазы KpnI и методом ПЦР.

Пример 3. Получение рекомбинантного аденовируса птиц CELO-HA, содержащего ген гемагглютинина вируса гриппа птиц к п.2 формулы изобретения.

Геном аденовируса птиц CELO, показанный на Фиг.1, гидролизуют по уникальному сайту рестрикции Swa I с целью удаления участка с 43567 н.п. по 43804 н.п., содержащего инвертированные повторы, необходимые для репликации вируса CELO. Плазмидную конструкцию с геном гемагглютинина вируса гриппа птиц pCBEd13kb/HA совместно с ДНК вируса CELO, гидролизованной рестриктазой Swa I, котрансфецируют в клетки гепатомы петуха леггорна LMH методом кальциево-фосфатной преципитации (J. Gen. Virol., 1977). В результате гомологичной рекомбинации, которая показана на Фиг.3 между фрагментом гидролизованного вирусного генома CELO и фрагментом этого же генома 36278-40065 н.п., находящимся в плазмидной конструкции, в клетках LMH получают полный рекомбинантный вирус CELO-HA, несущий экспрессирующую кассету челночного вектора с геном гемагглютинина вируса гриппа птиц под контролем промотора CMV и сигнала полиаденилирования BGH. Данный рекомбинантный вирус показан на Фиг.4. Анализ индивидуальных вирусных бляшек на наличие вставки гена гемагглютинина проводят методом ПЦР.

Пример 4. Определение уровня экспрессии гемагглютинина в клетках, трансфицированных рекомбинантным аденовирусом птиц CELO-HA к п.2 формулы изобретения.

Для определения функциональной активности экспрессирующей ген гемагглютинина кассеты в составе рекомбинантного генома аденовируса CELO-HA используют метод Вестерн-блоттинга. Клетки линии LMH инфицируют рекомбинантным вирусом CELO-HA, содержащим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц в дозе 5 БОЕ/кл. Через 2 суток клетки отмывают и приготавливают образцы лизатов, которые фракционируют электрофорезом в ПААГ-ДСН. По окончании электрофоретического разделения перенос белков на PVDF-мембрану проводят в полусухой буферной системе. Далее мембрану отмывают и блокируют 1% Twin 20, ночь при 4°С. Затем мембрану инкубируют в течение 2 часов при 37°С при покачивании в рабочем растворе моноклональных антител, конъюгированных с пероксидазой. Специфический комплекс антиген-антитело после отмывки детектируют окраской ECL (Amersham, США). На Фиг.5 показано, что в опытном образце LMH-HA по сравнению с отрицательным контрольным образцом LMH имеется продукт гена гемагглютинина. По результатам денситометрического анализа определяют уровень экспрессии гена гемагглютинина в клетках линии LMH, инфицированных рекомбинантным аденовирусом CELO-HA, содержащим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц. Уровень экспрессии составляет около 6 нг гемагглютинина на 20 мкг общего цитоплазматического белка.

Пример 5. Применение рекомбинантного аденовируса птиц, полученного по заявленному способу для вакцинации птиц, инфицированных CELO-HA к п.2 формулы изобретения.

Определение проводят на 45-ти однодневных цыплятах, разделенных на три группы по 15 голов в каждой: в 1 группе проводят интраназальную инфекцию вирусом CELO-HA в дозе 10⁸ БОЕ/птица; во 2 группе - интраназальную инфекцию вирусом CELO дикого типа в дозе 10⁸ БОЕ/птица; в 3 группе - интраназальное введение 1×PBS.

На 21 день после инфекции у всех цыплят берут кровь на анализ. Определение титра антител к вирусу гриппа птиц проводят согласно «Методическим рекомендации по определению титра антител к вирусу гриппа птиц в реакции торможения гемагглютинации», ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья», ФГУ «ВНИИЗЖ», Владимир - 2005. Титр гемагглютинирующих антител у инфицированных вирусом CELO-НА цыплят составил 1:8-1:16 (1 группа). В контрольных группах (№№2, 3) титр гемагглютинирующих антител составил 1:4-1:8. Это свидетельствует о том, что введение вируса CELO-HA, содержащего ген гемагглютинина вируса гриппа птиц, однодневным цыплятам вызывает образование высокого уровня антител к вирусу гриппа птиц H5N1, т.е. с помощью рекомбинантного аденовируса птиц CELO-HA осуществляется вакцинация.

Пример 6. Получение рекомбинантного аденовируса птиц CELO-NA, содержащего ген нейраминидазы вируса гриппа птиц к п.3 формулы изобретения.

Ген нейраминидазы вируса гриппа птиц H5N1 получают путем амплификации кДНК, синтезированной методом ОТ-ПЦР (Reverse Tpanscription System «Invitrogene» №12236-014, USA) на матрице РНК, выделенной из вируса гриппа птиц штамма A/duck/Novosibirsk/56/2005(H5N1) с использованием TRIZOL («Invitrogene» №15596-018, USA). Для ПЦР используют олигонуклеотиды, фланкирующие полный ген нейраминидазы, подобранные согласно последовательности гена нейраминидазы данного штамма (gene bank DQ234078.1). Фрагмент ДНК, несущий ген нейраминидазы вируса гриппа птиц, клонируют в плазмидный вектор pGEM-T Easy («Promega» № А 1360). Клонирование проводят согласно протоколу, приложенному к набору для клонирования ПЦР-продуктов pGEM-T Easy. Таким образом получают плазмиду pGEM-NA.

Для получения плазмидной конструкции pCBEd13kbNA ДНК-копия гена нейраминидазы (NA) из плазмиды pGEM-NA, гидролизованной по сайту NotI (№ЕК0591 «Fermentas», Латвия) и обработанной фрагментом Кленова, клонируют в векторе pCBEd13kb по сайту для рестриктазы Есо32I под контроль CMV-промотора и сигнала полиаденилирования. Наличие гена нейраминидазы в полученной конструкции pCBEd13kbNA подтверждают рестрикционным анализом и методом ПЦР.

Геном аденовируса птиц CELO (Фиг.1) гидролизуют по уникальному сайту рестрикции Swa I с целью удаления участка с 43567 н.п. по 43804 н.п., содержащего инвертированные повторы, необходимые для репликации вируса CELO. Плазмидную конструкцию с геном нейраминидазы вируса гриппа птиц pCBEd13kbNA совместно с ДНК вируса CELO, гидролизованной рестриктазой Swa I, котрансфецируют в клетки гепатомы петуха леггорна LMH методом кальциево-фосфатной преципитации (J. Gen. Virol., 1977). В результате гомологичной рекомбинации, которая показана на Фиг.3 между фрагментом гидролизованного вирусного генома CELO и фрагментом этого же генома 36278-40065 н.п., находящимся в плазмидной конструкции, в клетках LMH получают полный рекомбинантный вирус CELO-NA, несущий экспрессирующую кассету с геном нейраминидазы вируса гриппа птиц под контролем промотора CMV и сигнала полиаденилирования BGH. Анализ индивидуальных вирусных бляшек на наличие вставки гена нейраминидазы проводят методом ПЦР.

Пример 7. Получение рекомбинантного аденовируса птиц CELO-HA/NA с экспрессирующей кассетой, содержащей гены гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа птиц к п.4 формулы изобретения.

Ген гемагглютинина вируса гриппа птиц получают из плазмиды pGEM-HA (полученной согласно примеру 2), обработанной рестриктазой EcoRI. Ген НА клонируют в плазмидном векторе pIRES («Clontech», США), который для этого обрабатывают той же рестриктазой. Таким образом получают плазмиду pIRES-HA, несущую в своем составе ген гемагглютинина вируса гриппа птиц.

Ген нейраминидазы вируса гриппа птиц получают из плазмиды pGEM-NA (полученной согласно примеру 6), обработанной рестриктазой NotI. Данный ген клонируют в плазмидном векторе pIRES-HA, обработанном рестриктазой NotI. Таким образом получают плазмиду pIRES-HA/NA, несущую в своем составе ген гемагглютинина и ген нейраминидазы вируса гриппа птиц одновременно. Затем плазмидную конструкцию pIRES- HA/NA обрабатывают рестриктазой XbaI и фрагментом Кленова. Фрагмент, состоящий из IRES, гена гемагглютинина вируса гриппа птиц и гена нейраминидазы вируса гриппа клонируют в векторе pCBEd13kb по сайту для рестриктазы Есо32I под контроль CMV-промотора и сигнала полиаденилирования. Наличие целевых генов нейраминидазы и гемагглютинина в полученной конструкции pCBEd13kbHA/NA подтверждают рестрикционным анализом и методом ПЦР.

Геном аденовируса птиц CELO (Фиг.1) гидролизуют по уникальному сайту рестрикции Swa I с целью удаления участка с 43567 н.п. по 43804 н.п., содержащего инвертированные повторы, необходимые для репликации вируса CELO. Плазмидную конструкцию с генами гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа птиц pCBEd13kbHA/NA совместно с ДНК вируса CELO, гидролизованной рестриктазой Swa I, котрансфецируют в клетки гепатомы петуха леггорна LMH методом кальциево-фосфатной преципитации (J. Gen. ViroL, 1977). В результате гомологичной рекомбинации, которая показана на Фиг.3 между фрагментом гидролизованного вирусного генома CELO и фрагментом этого же генома 36278-40065 н.п., находящимся в плазмидной конструкции, в клетках LMH получают полный рекомбинантный вирус CELO-HA/NA, несущий экспрессирующую кассету с генами гемагглютинина и нейраминидазы вируса гриппа птиц и разделительной последовательностью IRES, обеспечивающей экспрессию двух генов, под контролем промотора CMV и сигнала полиаденилирования BGH. Анализ индивидуальных вирусных бляшек на наличие целевых генов проводят методом ПЦР.

Изобретение относится к молекулярной биологии, биотехнологии, генной инженерии вирусов. Способ заключается в том, что в клетках LMH проводят гомологичную рекомбинацию между геномной ДНК аденовируса птиц CELO с делетированным правым концевым фрагментом и плазмидной конструкцией, содержащей правый концевой фрагмент генома CELO с делецией в 3620 н.п., в области которой клонирована экспрессирующая кассета с геном гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N1, либо с геном нейраминидазы вируса гриппа птиц H5N1, либо с двумя вышеназванными генами. Изобретение может быть использовано в ветеринарии для создания генно-инженерных рекомбинантных вакцин нового поколения. 3 з.п. ф-лы, 5 ил.

1. Способ создания рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации животных, заключающийся в использовании генома аденовируса птиц CELO и специально сконструированной плазмидной конструкции, которая содержит участки, гомологичные геному CELO, и экспрессирующую кассету, с проведением последующей гомологичной рекомбинации, отличающийся тем, что выбирают геномную ДНК аденовируса птиц CELO с делетированным фрагментом, несущественным для репликации, конструируют плазмидную конструкцию с зонами, гомологичными нуклеотидной последовательности геномной ДНК аденовируса птиц CELO, между которыми образуют делецию в 3620 н.п. для увеличения пакующей емкости вируса CELO, в область которой клонируют как минимум одну экспрессирующую кассету, состоящую из промотора, обеспечивающего высокий уровень экспрессии в эукариотических клетках, из как минимум одного целевого гена и из сигнала полиаденилирования, при этом гомологичную рекомбинацию проводят в культуре клеток гепатомы петуха леггорна (LMH), обеспечивая получение генетической конструкции рекомбинантного аденовируса, состоящего из геномной ДНК аденовируса птиц CELO, из нуклеотидной последовательности плазмидной конструкции, включающей в свою последовательность как минимум одну экспрессирующую кассету, при этом в культуре клеток LMH происходит сборка рекомбинантного вируса CELO с как минимум одной экспрессирующей кассетой, полученный рекомбинантный аденовирус птиц используют в качестве вакцины для иммунизации животных.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве целевого гена в экспрессирующей кассете используют ген гемагглютинина вируса гриппа птиц Н5N1.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве целевого гена в экспрессирующей кассете используют ген нейраминидазы вируса гриппа птиц Н5N1.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве целевых генов в экспрессирующей кассете используют ген гемагглютинина и ген нейраминидазы вируса гриппа птиц H5N1.