СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ЛАКТОФЕРРИНА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2008 года по МПК C12N15/12 C12P21/02 C07K14/79 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к использованию эукариотов в качестве хозяев для аденовирусных векторов, и может быть использовано для получения биологически активного рекомбинантного лактоферрина (далее - ЛФ) человека.

ЛФ - одноцепочечный металлсвязывающий гликопротеин. Большое количество ЛФ экспрессируется клетками эпителия молочной железы, слезных, слюнных желез. ЛФ также входит в состав желчи и панкреатической жидкости. Общеизвестно, что этот природный белок обладает рядом лечебных свойств, в том числе бактерицидной и бактериостатической активностью, принимает участие в регуляции гуморальных и клеточных иммунологических реакций, противовоспалительных и других процессов. В связи с этим актуальной является задача получения ЛФ в качестве основного ингредиента для промышленного производства лекарственного препарата.

Известны два основных направления в получении ЛФ.

Первое - выделение из природных источников. ЛФ человека получают из донорского женского молока (п-т РФ №1709606). Однако недостатками известного способа получения ЛФ, включающего использование донорского женского молока в качестве источника ЛФ, являются ограниченность доступности сырья и необходимость строгого контроля на присутствие инфекционных агентов.

Второе - синтез рекомбинантных белков в прокариотических и эукариотических системах. Для этой цели широко используются клетки бактерий, дрожжей, растений, млекопитающих и насекомых. Рекомбинантный ЛФ экспрессируют в различных прокариотических и эукариотических организмах, включая aspergillus (US Pat. No 6.080.559), крупном рогатом скоте (US Pat. No 5.919.913), рисе, кукурузе, дрожжах Sacharomcyes (US Pat. No 6.228.614) и Pichia pastoris (US Pat. No 6.455.687, 6.277.817, 6.066.469). Каждый из перечисленных способов синтеза рекомбинантных белков обладает рядом недостатков, а именно:

- в клетках прокариот, а также в клетках многих эукариот (дрожжи, насекомые, растения), за исключением позвоночных, правильная пост-трансляционная модификация и укладка (фолдинг) синтезированного белка человека не происходит вовсе либо осуществляется неправильно, что существенно снижает его биологическую активность;

- получение рекомбинантного белка человека в культуре клеток позвоночных животных либо посредством их трансгеноза является высокозатратной технологией.

Среди биоректоров на основе клеток позвоночных можно выделить три типа: культура клеток, соматический трансгеноз и генетический трансгеноз. В качестве генетического трансгеноза используют различные классы позвоночных, главным образом птиц и млекопитающих. Клетки птиц в отличие от клеток млекопитающих обладают тем преимуществом, что они не содержат в своем составе вирусов, патогенных для человека, а также прионов, вследствие чего могут служить безопасным источником рекомбинантных белков медицинского назначения. Однако производство белков в культуре клеток птиц в настоящее время используется ограниченно, что связано с проблемами доставки генетического материала.

Известен способ получения рекомбинантных белков человека из белка куриного яйца, полученного от трансгенной курицы, в геном которой с помощью лентивирусного вектора был встроен ген соответствующего рекомбинантного белка (U.S. Pat. No 6730822). Использование трансгенной птицы связано с длительностью сроков реализации (до 24 недель), высоким уровнем затрат не только на получение трансгенного стада, но и с его содержанием.

Наиболее близким к заявляемому изобретению по совокупности признаков является способ получения ЛФ, включающий трансформацию эукариотической клетки вектором, содержащим последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую вариант ЛФ, культивирование трансформированной эукариотической клетки в подходящей питательной среде до образования ЛФ и его выделение (U.S. Pat. No 6111081). Однако использование известного способа не позволяет достичь технических результатов, получаемых при использовании заявляемого изобретения, по следующим причинам:

1. Требует дополнительной очистки и тестирования получаемого препарата рекомбинантного ЛФ на присутствие примесей токсических веществ, в частности микотоксинов, являющихся продуктами жизнедеятельности грибов. Выделяемые родом Aspergillus афлотоксины - потенциальные канцерогены - оказывают токсическое действие на печень млекопитающих, птиц, рыб.

2. Невозможность использования ростовой среды, содержащей рекомбинантный ЛФ для каких-либо целей без стадии очистки, тогда как аллантоисная жидкость куриного эмбриона, содержащая рекомбинантный ЛФ, может быть использована в качестве биологически активной добавки без стадии очистки.

3. Получаемый рекомбинантный ЛФ по биологическим свойствам не является идентичным белку, получаемому из природного источника.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи получения препаративных количеств биологически активного рекомбинантного ЛФ человека.

Использование в клинической практике заявляемого способа позволяет достичь нескольких технических и экономических результатов:

- идентичность белка, получаемого в соответствии с заявляемым способом, по биологическим свойствам, в том числе по биологической активности, белку, получаемому из природного источника, за счет правильной пост-транскрипционной модификации и фолдинга белков;

- безопасность полученного продукта за счет того, что он не содержит патогенных для человека инфекционных агентов и других опасных примесей;

- короткие сроки организации производства - до 10 недель;

- невысокая себестоимость.

Указанные технические и экономические результаты при осуществлении изобретения достигаются за счет того, что так же как в известном способе рекомбинантный ЛФ человека получают путем введения вирусного вектора, несущего в составе генома ген ЛФ человека, в эукариотическую клеточную систему, культивирования и последующего выделения рекомбинантного белка.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что в качестве вирусного вектора используют рекомбинантный аденовирус птиц или млекопитающих, в качестве эукариотической клеточной системы используют куриное яйцо с эмбрионом, культивирование осуществляют путем инкубации при температуре 37°С в течение 60-90 часов.

Сущность заявляемого изобретения состоит во введении в аллантоисную полость куриного яйца с эмбрионом рекомбинантного аденовирусного вектора, несущего в составе генома экспрессирующую кассету с геном ЛФ человека.с последующей экспрессией гена данного белка и накопления его препаративных количеств в аллантоисной жидкости куриного эмбриона. Куриное яйцо с эмбрионом, инфицированное рекомбинантным аденовирусом, играет роль природного биореактора для получения рекомбинантного ЛФ.

По сравнению с известными вышеупомянутыми системами экспрессии получение рекомбинантных белков в аллантоисной жидкости куриного яйца с эмбрионом имеет ряд особенностей и преимуществ. Установлено, что в клетках птиц происходят гликозилирование и фолдинг белков, идентичные таковым в клетках млекопитающих. Вследствие этого синтезированный рекомбинантный белок человека обладает всеми свойствами природного белка, получаемого из женского молока.

С другой стороны, в случае использования в фармацевтической промышленности заявляемого изобретения возможно достижение высокого экономического эффекта. С одной стороны, стоимость выделения и очистки целевого белка из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов сопоставима со стоимостью выделения и очистки из других систем. С другой стороны, содержание эмбрионов не требует дорогостоящего оборудования, а сельскохозяйственные масштабы производства исходной продукции гарантируют возможность промышленного получения рекомбинантного препарата. В результате значительно снижается стоимость производства сырого материала.

Способ осуществляют следующим образом.

Ген ЛФ человека получают путем амплификации к ДНК, синтезированной методом ОТ-ПЦР (Reverse Tpanscrip'tion System «Invitrogene» №12236-014, USA), на матрице РНК, выделенной из генома клетки человека с использованием TRIZOL («Invitrogene» №15596-018, USA). Фрагмент ДНК, несущий ген ЛФ человека, клонируют в плазмидном векторе pGEM-T Easy («Promega» №А1360). Клонирование проводят согласно протоколу, приложенному к набору для клонирования ПЦР-продуктов pGEM-T Easy. Полученной лигированной смесью трансформируют клетки Е. coli DH5α ClRb-методом. Трансформированные клетки отбирают на агаризованной среде LB с антибиотиком ампициллином (40 мкг/мл). Плазмидную ДНК выделяют методом щелочного лизиса, анализируют с помощью рестриктаз EcoRI, Ncol (№ER0271, ER0571 «Fermentas», Латвия) и отбирают клоны, несущие плазмиду ожидаемого размера (5316 п.о.). Первичную структуру клонированного фрагмента в полученной плазмиде pGEM-Lf подтверждают рестрикционным картированием по эндонуклеазам рестрикции Bgll (№ ER0071 «Fermentas», Латвия) и секвенированием по методу Сэнгера.

Для получения рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа Ad5-Lf, содержащего ген ЛФ человека, производят клонирование гена ЛФ человека (Lf) из плазмиды pGEM-Lf, гидролизованной по сайту NotI, в коммерческий вектор pShuttle-CMV, входящий в набор к системе «AdEasy Adenoviral vector system», по сайту для рестриктазы NotI под контроль CMV-промотора и сигнала полиаденилирования. Наличие гена ЛФ в полученном челночном векторе pShuttle-CMV/Lf подтверждают рестрикционным анализом при использовании эндонуклеазы EcoRI, EcoRV и методом ПЦР. Получение рекомбинантного аденовируса Ad5-Lf проводят согласно методике «AdEasy Adenoviral vector system» («Stratagene» Cat. No 240009). Наличие гена ЛФ человека в составе генома рекомбинантного аденовируса Ad5-Lf подтверждают методом ПЦР.

Для получения рекомбинантного аденовируса птиц CELO-Lf, содержащего ген ЛФ человека, производят клонирование гена ЛФ человека (Lf) из плазмиды pGEM-Lf, гидролизованной по сайту NotI, в челночный плазмидный вектор по сайту для рестриктазы Есо321 под контроль CMV-промотора и сигнала полиаденилирования. Данный челночный плазмидный вектор является частью системы для получения рекомбинантного аденовируса птиц CELO по методу, описанному М. Cotten (Michou A.I., Lehrmann Н., Saltik М., Cotten М., Mutational Analysis of the Avian Adenovirus CELO, Which Provides a Basis for Gene Delivery Vectors, Journal of Virology, February, 1999, p.1399-1410, Vol.73, No. 2), согласно которому затем производится получение рекомбинантного аденовируса птиц CELO-Lf. Наличие гена ЛФ человека в составе генома рекомбинантного аденовируса CELO-Lf подтверждают методом ПЦР.

Далее определяют титр препаратов рекомбинантных аденовирусов Ad5-Lf и CELO-Lf методом бляшкообразования на культуре клеток 293 (клетки эмбриональной почки человека) и LMH (Leghorn male hepatoma - клетки гепатомы петуха леггорн).

Вирусами CELO-Lf или Ad5-Lf инфицируют 9-10-дневные SPF куриные яйца с эмбрионами. В результате проведенных ранее экспериментов выяснено, что при инфекции эмбриона именно на этой стадии развития происходит наиболее эффективное накопление рекомбинантного белка в аллантоисной жидкости. Инфекцию производят через отверстие диаметром 1-2 мм в яичной скорлупе со стороны воздушной камеры, вводя иглу шприца на 1,5-2,0 см под скорлупу с целью инъекции инфекционного материала под хориоаллантоисную мембрану в аллантоис эмбриона.

Куриные эмбрионы инфицируют рекомбинантными аденовирусами CELO-Lf или Ad5-Lf в дозах 1×10⁶-1×10⁷ БОЕ/эмбрион и 1×10⁷-1×10⁹ БОЕ/эмбрион соответственно. Оптимальность указанной дозы была установлена в ранее произведенных экспериментах, где было показано, что снижение дозы приводит к снижению выхода продукта (рекомбинантного белка), а увеличение дозы - к преждевременной гибели куриного эмбриона, вследствие чего выход продукта также снижается.

Инфицированные куриные эмбрионы инкубируют при температуре 37°С в течение 60-90 часов. Установлено,, что в течение данного периода инкубации в аллантоисной жидкости накапливается максимальное количество рекомбинантного ЛФ человека.

Контроль уровня экспрессии рекомбинантного ЛФ человека проводят путем отбора аликвот (0,5 - 1 мл) аллантоисной жидкости через произведенные ранее отверстия в яичной скорлупе у небольшой части инфицированных эмбрионов в течение всего срока инкубации. Уровень экспрессии рекомбинантного ЛФ человека в отобранных аликвотах аллантоисной жидкости производят методом ИФА. После завершения периода инкубации в аллантоисной жидкости уровни рекомбинантного белка ЛФ человека составляют 0,9±0,07 мг/эмбрион при инфекции вирусом CELO-Lf и 0,2±0,08 мг/эмбрион при инфекции вирусом Ad5-Lf.

На следующем этапе производят выделение и очистку рекомбинантного ЛФ человека из аллантоисной жидкости методом аффинной хроматографии на сорбенте антитела к лактоферрину человека (Ат) - сефароза 4 В. Выход продукта составляет 64±4% и 60±3% в случае использования рекомбинантного аденовируса птиц CELO-Lf и человека Ad5-Lf соответственно.

Часть выделенного рекомбинантного ЛФ человека исследуют на предмет его биологической (антиоксидантной) активности in vitro и in vivo. Эти методы основаны на способности рекомбинантного ЛФ ингибировать перекисное окисление липидов (ПОЛ) в печени мышей. Проведенный анализ биологической активности (in vitro и in vivo) рекомбинантного белка, полученного в соответствии с заявляемым способом, показал его идентичность природному ЛФ человека, выделенному из донорского женского молока.

Заявляемый способ обладает значительными преимуществами и отвечает критериям патентоспособности.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантного лактоферрина человека. Аденовирусный вектор, несущий в составе генома ген лактоферрина человека, вводят в аллантоис 9-10-дневного куриного эмбриона. Последующее культивирование осуществляют путем инкубации яйца при температуре 37°С в течение 70-75 часов. Затем выделяют рекомбинантный белок из аллантоисной жидкости куриного эмбриона. Изобретение позволяет снизить затраты и упростить получение рекомбинантного лактоферрина человека.

Способ получения рекомбинантного лактоферрина человека, путем введения вирусного вектора, несущего в составе генома ген лактоферрина человека, в эукариотические клетки, культивирование и последующее выделение рекомбинантного белка, отличающийся тем, что в качестве вирусного вектора используют рекомбинантный аденовирус птиц или млекопитающих, в качестве эукариотических клеток используют 9-10-дневное куриное яйцо с эмбрионом, которое инфицируют рекомбинантными аденовирусами CELO-Lf или Ad5-Lf путем инъекции в аллантоис эмбриона в дозах 1×10⁶-1×10⁷ БОЕ/эмбрион или 11×0⁷-1×10⁹ БОЕ/эмбрион соответственно, культивирование осуществляют путем инкубации при температуре 37°С в течение 70-75 ч.