СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ КАРТОФЕЛЯ Российский патент 2008 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии, картофелеводству, семеноводству картофеля, а именно к ускоренному размножению семенного картофеля на безвирусной основе.

Известен способ микроклонального размножения картофеля, включающий культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro. Черенкование проводят на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы по Мурасиге-Скугу, сахарозу, Fe-хелата, глицерин, ИУК (гетероауксина), агар-агара, витамины по Уайту и коричную кислоту. Полученные растения высаживают в грунт (RU №2181942, МПК⁷ А01Н 4/00, С12N 5/02, опубл. 10.05.2002 г.).

Недостатками данного способа являются низкая скорость роста растений in vitro, небольшой выход растений-регенерантов и микроклубней из одного исходного растения in vitro, кроме того, приживаемость растений, выращенных на питательной среде in vitro при пересадке в грунт, составляет всего 70-80%.

Технический результат заключается в повышении жизнеспособности и ускорении роста эксплантов, увеличении коэффициента размножения растений-регенерантов и количества микроклубней in vitro, а также улучшении приживаемости растений-регенерантов при пересадки в грунт.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе микроклонального размножения картофеля, включающем культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, получение растений-регенерантов и высадку растений-регенерантов в грунт, в питательную среду дополнительно вводят 3 мг/л глицина, 1000-2000 мг/л активированного угля и 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты. Микрочеренкование исходных растений проводят на апикальную, среднюю и базальную части. Выращивание апикальной и средней частей осуществляют на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 20 г/л при температуре 23-25°С днем и 17-18°С ночью, с последующим высаживанием растений-регенерантов картофеля в грунт, а выращивание базальной части проводят на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 80 г/л в темноте при температуре 8-10°С, с последующим получением микроклубней картофеля in vitro.

Увеличение или уменьшение температуры выращивания растений-регенерантов от предлагаемой (23-25°С днем и 17-18°С ночью) и концентрации сахарозы в среде (20 г/л) приводит к снижению роста растений-регенерантов и уменьшению коэффициента их размножения.

Изменение пределов температуры получения микроклубней, предлагаемой по данному способу (8-10°С), и концентрации сахарозы в среде (80 г/л) приводит к уменьшению выхода микроклубней и их массы.

При добавлении в питательную среду 1000-2000 мг/л активированного угля и 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты происходят более быстрый рост стебля, формирование хорошо развитой корневой системы и образование большого числа междоузлий, что позволяет вести повторное микрочеренкование через 3-4 недели. В результате происходит повышение коэффициента размножения, в связи с чем увеличивается выход пробирочных растений через 3 месяца после посадки одного исходного до 1,5-2 тыс. штук, в зависимости от сорта. Корневая система растений-регенерантов картофеля in vitro, культивируемых на данной среде, более мощная, и такие растения лучше укореняют в грунте (процент выживания 90-98%).

Опыты проводились в лаборатории клеточной инженерии кафедры ботаники и физиологии растений ГОУВПО «Мордовский государственный университет имени Н.П.Огарева» с коллекционными безвирусными сортами картофеля. Питательная среда в контрольном варианте (табл.1) готовилась по прототипу, в опытном - с добавлением 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты и 1000-2000 мг/л активированного угля.

Таблица 1.Состав питательной среды, мг/лКонтроль (прототипя)Предлагаемое решениеАммоний азотнокислый16501650Калий азотнокислый19001900Кальций хлористый двухводный440440Магний сернокислый семиводный370370Калий фосфорнокислый однозамещенный170170Борная кислота6,26,2Марганец сернокислый четырехводный27,727,7Цинк сернокислый четырехводный8,68,6,Калий йодистый0,830,83Натрий молибденовокислый двухводный0,250,25Медь сернокислая пятиводная0,0250,025Кобальт хлористый шестиводный0,0250,025Трилон Б373373Железо сернокислое семиводное27,827,8Глицин33Коричная кислота0,5-1,0-Гетероауксин1-Тиамин1,00,5Пиридоксин0,20,5Пантотенат кальция0,2-Активированный уголь-1000-2000Аскорбиновая кислота-1-2Сахароза3000020000-80000Агар-агар7000,07000Водадо 1 лдо 1 л

Способ осуществляют следующим образом.

В вымытые и высушенные пробирки (19×210 мм) наливают по 7-10 мл агаризированной среды, закрывают ватно-марлевыми пробками, составляют в медицинские бюксы, автоклавируют 20 мин при давлении 1 атм и температуре 120°С. Используют 2 варианта питательных сред, которые различают по содержанию сахарозы. Для выращивания растений-регенерантов используют питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, сахарозу, глицин, агар-агар, витамины по Уайту, 20 г/л сахарозы и дополнительно 1000-2000 мг/л активированного угля и 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты, а для получения микроклубней аналогичную питательную среду, содержащую 80 мг/л сахарозы.

Микрочеренкование исходных растений производят в ламинар-боксе. Пробирочные растения, имеющие 12-15 листьев, извлекают из пробирки и черенкуют на чашке Петри. В пробирки высаживают с помощью пинцета по 2 однопочковых черенка из апикальной (верхушечной) и средней частей растения на питательную среду, содержащую 20 г/л сахарозы. Пробирки с черенками подписывают и выставляют в штативах на стеллажи с освещением 4-5 тыс. люкс люминесцентными лампами, фотопериод 16 ч и поддерживают температуру ночью 17-18°С, днем - 23-25°С для дальнейшего получения растений-регенерантов. Пробирки с черенками базальной части (2-3 черенка прикорневой зоны), высаженными на питательную среду, содержащую 80 г /л сахарозы, помещают в темноту при температуре 8-10°С для дальнейшего клубнеобразования.

В табл.2 представлена динамика развития растений-регенератов картофеля сорта Невский in vitro в зависимости от состава питательной среды по предлагаемому способу, (содержащей 20 г/л сахарозы).

Таблица 2.Питательная средаВозраст растения-регенеранта, сут.102030Длина корня, ммПрототип10,1±0,521,7±0,636,4±0,8Среда 111,7±0,424,6±0,540,1±0,7Среда 212,3±0,325,1±0,749,7±0,8Среда 314,3±0,425,7±0,548,3±0,7Среда 412,5±0,825,8±0,447,1±0,5Длина побега, смПрототип3,1±0,55,7±0,68,4±0,8Среда 13,7±0,36,6±0,29,1±0,7Среда 23,9±0,37,1±0,710,7±0,8Среда 34,3±0,77,7±0,311,3±0,7Среда 44,9±0,88,8±0,412,2±0,5Количество узлов/листьев, шт.Прототип3,0±0,15,7±0,68,1±1,7Среда 13,2±0,26,3±0,49,1±0,7Среда 23,4±0,36,6±0,89,7±0,6Среда 33,3±0,76,8±0,710,3±0,7Среда 44,1±0,88,8±0,411,2±0,5Примечания:Среда 1 - питательная среда, содержащая 1 мг/л аскорбиновой кислотыСреда 2 - питательная среда, содержащая 2 мг/л аскорбиновой кислотыСреда 3 - питательная среда, содержащая 1 мг/л аскорбиновой кислоты + 2 г/л активированного угляСреда 4 - питательная среда, содержащая 2 мг/л аскорбиновой кислоты + 2 г/л активированного угля

К концу первой недели растения-регенеранты из микрочеренков в варианте с активированным углем и аскорбиновой кислотой были на 0,5-1,5 см выше растений контрольного варианта и достигали 3,5-4,9 см. В условиях опытной среды растения раньше и быстрее формировали корневую систему: к концу второй недели длина корней растений-регенерантов достигла 1,1-1,5 см, а к концу третьей - 2,5-2,6 см, в то время как в контрольном варианте она составила лишь 0,5-1,0 см и 2,0-2,2 см. Интенсивное корнеобразование в дальнейшем обеспечивало более быстрый рост стебля у растений-регенерантов. В течение третьей недели максимальный ежедневный прирост у растений по предлагаемому способу составил 5-8 мм, у растений контрольной группы 3-6 мм. Растения контрольного варианта к концу третьей недели культивирования отставали в росте на 2,0-3,5 см. К повторному черенкованию в опытных вариантах растения были готовы к концу 3-й - началу 4-й недели. Количество черенков к этому сроку на опытных растениях было 8-11 против 6-8 на контрольных (табл.3).

Таблица 3СортКонтроль (прототип)Среда 1Среда 2Среда 3Среда 4Жуковский ранний10,3±0,412,3±0,412,2±0,113,5±0,215,2±0,1Удача11,3±0,412,3±0,412,2±0,113,5±0,215,2±0,1Невский9±0,79,1±0,29,7±0,610,3±0,711,2±0,5Никулинский7,2±0,77,5±0,28,7±0,69,3±0,39,7±0,1Примечания:Среда 1 - питательная среда, содержащая 1 мг/л аскорбиновой кислотыСреда 2 - питательная среда, содержащая 2 мг/л аскорбиновой кислотыСреда 3 - питательная среда, содержащая 1 мг/л аскорбиновой кислоты + 2 г/л активированного угляСреда 4 - питательная среда, содержащая 2 мг/л аскорбиновой кислоты + 2 г/л активированного угля

В табл.4 представлены результаты исследований по динамике развития растений-регенерантов, полученных из различных типов черенков картофеля сорта Невский in vitro, по предлагаемому способу на среде №4, содержащей 20 г/л сахарозы и дополнительно 2000 мг/л активированного угля, 2 мг/л аскорбиновой кислоты.

Таблица 4Тип эксплантаВозраст растения-регенеранта, сут.102030Длина корня, ммапикальный14,3±0,125,7±0,549,7±0,8средний12,3±0,325,1±0,748,3±0,7базальный11,7±0,224,6±0,540,1±0,7Длина побега, смапикальный4,9±0,88,8±0,416,2±0,5средний3,9±0,37,1±0,712,7±0,8базальный3,1±0,55,7±0,610,4±0,8Количество узлов/листьев, шт.апикальный4,1±0,88,8±0,415,2±0,5средний3,4±0,36,6±0,812,7±0,6базальный3,3±0,46,8±0,710,3±0,7

К концу первой недели растения-регенеранты, полученные из микрочеренков апикальной (верхушечной) и средней частей растения, были на 0,5-1,0 см выше растений, полученных из базальной части. Они раньше и быстрее формировали корневую систему. Интенсивное корнеобразование в дальнейшем обеспечивало более быстрый рост стебля у растений-регенерантов. Растения, полученные из черенков базальной части (2-3 черенка прикорневой зоны), к концу третьей недели культивирования отставали в росте на 1,5-3 см. К повторному черенкованию в опытном варианте черенки, полученные из апикальной и средней части растений, были готовы к концу 3-й недели, а базальной части - к 4-5-й неделе.

Коэффициент размножения растений-регенерантов картофеля через 4 недели после черенкования представлен в табл.5.

Таблица 5СортАпикальныеСредниеБазальныеЖуковский ранний15,2±0,113,5±0,212,3±0,4Удача15,3±0,212,2±0,111,3±0,4Невский11,2±0,59,7±0,69,1±0,2Никулинский9,7±0,19,3±0,37,5±0,2

В то же время способность к клубнеобразованию у черенков различных ярусов растения различна. Черенки апикальной части растения образуют незначительное количество мелких клубней, причем значительно позже, чем черенки из базальной части растения, которые образовывают крупные микроклубни. В опытах выявлено, что масса микроклубней, полученных на однопочковых микрочеренках картофеля in vitro, выше при использовании черенков базальной части (табл.6).

Полученные предлагаемым способом микроклубни были физиологически зрелыми, хорошо хранились и при последующим выращивании in vivo формировали здоровые растения

Таблица 6СортМасса микроклубня, мгАпикальная частьСредняя частьБазальная частьЖуковский ранний12,8±1,536,8±2,181,6±6,7Удача19,8±1,446,8±5,895,8±5,7Невский17,2±2,725,2±2,690,3±3,4Никулинский25,2±2,646,3±3,5100,8±3,5

Полученные растения-регенеранты картофеля с хорошо развитыми механическими и проводящими тканями стебля, обширной корневой системой и хорошо развитыми листьями при пересадке в грунт легко адаптировались к условиям in vivo, что обеспечивало их высокую приживаемость (90-98%) по сравнению с прототипом (70-80%).

Отсюда следует, что предлагаемый способ позволяет повысить коэффициент размножения растений-регенерантов картофеля in vitro за 3 месяца последовательного черенкования на 0,2-1,5 тыс. штук от одного исходного за счет сокращения периода между повторными черенкованиями, увеличения выхода микрочеренков и пробирочных растений и их лучшей приживаемости в грунте, а также дополнительного получения микроклубней.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Культивируют оздоровленные растения картофеля in vitro путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу. Получают растения-регенеранты. Затем их высаживают в грунт. В питательную среду дополнительно вводят 3 мг/л глицина, 1000-2000 мг/л активированного угля и 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты. Проводят микрочеренкование исходных растений на апикальную, среднюю и базальную части. Выращивание апикальной и средней частей осуществляют на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 20 г/л при температуре 23-25°С днем и 17-18°С ночью, с последующим высаживанием растений-регенерантов картофеля в грунт. Выращивание базальной части проводят на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 80 г/л в темноте при температуре 8-10°С, с последующим получением микроклубней картофеля in vitro. Изобретение позволяет повысить жизнеспособность и ускорить рост эксплантантов, увеличить коэффициент размножения растений-регенерантов и количества микроклубней in vitro, а также улучшить приживаемость растений-регенерантов при пересадке в грунт. 6 табл.

Способ микроклонального размножения картофеля, включающий культивирование оздоровленных растений картофеля in vitro путем микрочеренкования на питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, получение растений-регенерантов и высадку растений-регенерантов в грунт, отличающийся тем, что в питательную среду дополнительно вводят 3 мг/л глицина, 1000-2000 мг/л активированного угля и 1-2 мг/л аскорбиновой кислоты, микрочеренкование исходных растений проводят на апикальную, среднюю и базальную части, причем выращивание апикальной и средней частей осуществляют на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 20 г/л при температуре 23-25°С днем и 17-18°С ночью с последующим высаживанием растений-регенерантов картофеля в грунт, а выращивание базальной части проводят на питательной среде с содержанием сахарозы в количестве 80 г/л в темноте при температуре 8-10°С с последующим получением микроклубней картофеля in vitro.