СПОСОБ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ РАСТЕНИЙ Российский патент 1997 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для массового размножения растений в условиях культуры ткани.

Клональное микроразмножение растений это один из видов техники in vitro, используемый для быстрого неполового размножения растений. Преимуществами этого вида размножения в сравнении с традиционными методами являются значительно более высокие коэффициенты размножения, миниатюризация процесса, оздоровление посадочного материала от разного рода инфекций. В условиях in vitro можно размножать растения, которые трудно размножаются обычным способом, например древесные растения.

Области применения клонального микроразмножения разнообразны и имеют тенденцию к расширению. Наиболее широко оно используется для размножения вновь созданных и уже существующих хозяйственных сортов с целью массового получения оздоровленного посадочного материала.

Основными этапами при клональном микроразмножении растений являются получение регенерантов из эксплантов, которые выделяют из различных органов и тканей растений, и собственно размножение регенерантов, осуществляемое различными путями, например стимуляцией (развития пазушных почек экспланта, микрочеренкованием побега, индукцией) образования адвентивных почек тканями листа и стебля и другими путями.

В настоящее время для ряда сельскохозяйственных культур разработаны технологии размножения in vitro: на ячменно-ржаных и ячменно-пшеничных гибридах (Першина Л.А. Шумный В.К. "Особенности каллусной ткани и растений -регенератов ячменно-ржаных и ячменнно-пшеничных гибридов". Культура клеток растений и биотехнология. М. Наука, 1986, с. 176-178), на перспективных сортах винограда (Дорощенко Н.Н. "Микроклональное размножение перспективных сортов винограда". Тезисы докладов Всесоюзной научно-технической конференции "Применение биотехнологии в животноводстве, растениеводстве и ветеринарной медицине" 11-13 октября 1988 г. Л. с. 163-164) и других сельскохозяйственных культурах.

Наиболее близким способом является способ получения посадочного материала картофеля (Мелик-Саркисов О.С. Овчинникова В.Н. Ульянов Р.П. Получение безвирусного посадочного материала картофеля микроклубнями, индуцированными в культуре in vitro. Методические рекомендации. ВАСХНИЛ, ВНИИ прикладной молекулярной биологии и генетики. М. 1985), который заключается в следующем: глазки клубня картофеля, вырезанного вместе с частью паренхимы клубня, проращивают во влажном песке. Из верхушечной части выросших проростков изолируют апикальную меристему, которую помещают в пробирки на поверхность агаризованной питательной среды и культивируют в течение 60 дней до формирования в пробирках регенерантов. Пробирочные растения черенкуют. Черенки помещают на питательную среду и выращивают 3-4 недели до образования растений-регенерантов. Последние используют для получения миниклубней или в условиях in vitro, или в условиях защищенного грунта.

Культивирование эксплантов до образования регенерантов и укоренение микрочеренков осуществляют на агаризованных питательных средах. На основу сред используют среду по прописи Мурасиге и Скуга (Murashige T. Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue ciltures. Phisiol. Plant. 1962. V. 15. N13. P. 473-497), которая содержит, мг/л: макросоли: NH₄NO₃ 1650, KNO₃ 1900, MgSO₄ • 7H₂O 370, CaCl₂ • 2H₂O 440, KH₂PO₄ 170; микросоли: MnSO₄ • 4H₂O 22,3, H₃BO₃ - 6,2, ZnSO₄ • 4H₂O 8,6, CoCl₂ • 6H₂O - 0,025, CuSo₄ • 5H₂O 0,025, NaMoO₄ • 2H₂O 0,025, Kl 0,83; витамины: тиамин 0,1, миоинозитол 80, пиридоксин - 0,5, никотиновая кислота 0,5.

Источником углеродного питания служит сахароза в количестве 20000 мг/л. Для уплотнения в среду добавляют агар (7000 мг/л).

Для формирования регенерантов из эксплантов в среду добавляют гибберелловую кислоту (2,0 мг/л) и кинетин (1,0 мг/л).

На этапе укоренения микрочеренков среда содержит β -индолилуксусную кислоту или b индолилмасляную кислоту в количестве 0,05 или 0,1 мг/л соответственно.

Необходимым условием клонального микроразмножения растений является стабильное воспроизводство исходного генотипа.

Однако соблюдение этого условия вызывает ряд трудностей, т.к. биологически активные компоненты питательных сред способны вызывать генетические изменения в клетках, что приводит к генетической вариабельности получаемых регенерантов. В процессе культивирования in vitro генетические изменения накапливаются, увеличивается количество регенерантов, отличающихся от исходного типа (Леонова Н.С. "Использование метода культуры ткани в селекции картофеля". Сибирский вестник с/х науки, 1986, N3, с. 18-26).

Такие изменения характерны и для известного способа. У растений-регенерантов отмечается большое количество нарушений хромосом, уменьшается количество клеток с нормальным кариотипом. Регенеранты характеризуются значительным морфофизиологическим разнообразием и утратой ценных хозяйственных признаков.

Таким образом, разработка приемом культивирования растений, направленных на снижение отрицательного воздействия компонентов питательных сред на клетки и на стабильное воспроизведение исходного (нормального) генотипа, является актуальной задачей.

Технический эффект от использования изобретения заключается в увеличении выхода регенерантов с исходным (нормальным) генотипом.

Технический эффект достигается с помощью способа клонального микроразмножения растений, включающего посадку экспланта на питательную среду для получения регенерантов, их микрочеренкование и укоренение микрочеренков на питательной среде, содержащей сахара в качестве источника углерода, отличающуюся тем, что в качестве источника углерода среда для укоренения содержит фруктозу в количестве 10000-20000 мг/л или смесь фруктозы и сахарозы в соотношении 0,5-1:1.

Фруктоза представляет собой моносахарид, относится к группе гексоз, сохраняет ряд особенностей, присущих карбонильной группе, и часто определяется как восстанавливающий сахар. Фруктоза легко проникает через клеточные мембраны и вступает в гликолитический путь дыхания (Калинин Ф.Л. Лобов В.П. Жидков В.А. Справочник по биохимии. Киев, Наукова Думка, 1971, с.500).

Использование ее в питательных средах для культивирования растений in vitro как отдельно, так и в смеси с сахарозой неизвестно.

Внесение в среду для укоренения фруктозы меньше 10000 мг/л не позволяет достичь необходимого результата, а выше 20000 мг/л существенным образом не изменяет достигаемый технический эффект.

Предлагаемый способ апробировали на растениях картофеля (сорт Янтарный), гибридах томатов (Союз-3, Верлиока и 855) и стахисе байкальском (Stachys baicalensis Fisch).

Эффективность предлагаемого и известного способов оценивали по количеству клеток у растений-регенерантов, имеющих нормальный (исходный) кариотип.

Растения-регенеранты сравнивали по биометрическим и цитогенетическим показателям, а также по продуктивности при высадке растений в грунт.

Цитогенетический анализ структурных и количественных изменений хромосом проводили на давленных ацетокарминовых препаратах по общепринятой методике.

Пример 1 (контроль). Для введения в культуру in vitro и получения оздоровленных регенерантов картофеля используют метод апикальной меристемы в культуре in vitro (Мелик-Саркисов О.С. Овчинникова В.Н. Ульянов Р.П. "Получение безвирусного посадочного материала картофеля микроклубнями, индуцированными в культуре in vitro". Методические указания, М. 1985).

Глазки клубня картофеля вырезают вместе с частью паренхимы клубня (1,5 x 1,5 см) и проращивают во влажном песке при 25-27^oС в темноте. Выросшие этиолированные проростки срезают, стерилизуют в 0,1%-ном растворе диацида 5-7 мин и трижды промывают стерильной водой. Из верхушечной части побега изолируют апикальную меристему размером 150-250 мк. Изолированную меристему помещают в пробирку на поверхность агаризованной питательной среды следующего состава, мг/л: макро- и микроэлементы по Мурасиге и Скугу, сахароза 20000, агар 7000, тиамин 1,0, пиридоксин 0,5, никотиновая кислота 0,5, аскорбиновая кислота 1,0, гибберелловая кислота 2,0, кинетин 1,0.

Культивирование апексов проводят в течение 60 дней при 16-часовой продолжительности светового дня, температуре 24-25^oC днем и 19-20^oC ночью и освещенности 5000-6000 лкс.

Сформированные пробирочные растения используют для дальнейшего размножения с помощью микрочеренкования.

В стерильных условиях растений извлекают из пробирок. С помощью скальпеля растения разрезают на черенки, количество которых соответствует числу узлов на исходном пробирочном растении.

Укоренение черенков осуществляют на питательной среде (среда для укоренения) следующего состава, мг/л: макро- и микроэлементы по Мурасиге и Скугу, сахароза 20000, агар 7000, тиамин 1,0, пиридоксин 0,5, никотиновая кислота 0,5, аскорбиновая кислота 1,0.

Для ускорения добавляют b индолилмасляную кислоту или b - индолилуксусную кислоту в количестве 0,1 или 0,05 мг/л соответственно.

Культивирование черенков проводят в тех же условиях, что и апикальные меристемы. Время культивирования 3-4 недели.

Полученные растения регенеранты на среде для укоренения используют для получения микроклубней или в условиях in vitro или в закрытом грунте.

В первом случае пробирочные растения черенкуют и черенки высаживают в пробирки с питательной средой, которая содержит, мг/л: макро- и микроэлементы по Мурасиге и Скугу, сахарозу 40000-60000, агар 6000, тиамин 1,0, пиридоксин 0,5, никотиновую кислоту 0,5, аскорбиновую кислоту 1,0, кинетин 0,5.

Черенки инкубируют при 16-часовой продолжительности светового дня, температуре 24-25^oC днем и 19-20^oC ночью при освещенности 5000-6000 лкс.

После образования у пробирочных растений 5-6 листьев пробирки с растениями на 3 недели переносят в климатическую камеру с температурой 15^oC и продолжительностью светового дня 8 ч. В зависимости от сорта картофеля образование клубней происходит через 1-1,5 месяца после переноса растений в условия, индуцирующие клубнеобразование.

При получении миниклубней в защищенном грунте растения картофеля, полученные in vitro, высаживают в грунт и выращивают в заданных условиях до получения миниклубней кондиционных размеров (3-5 г).

Пример 2 (опыт). Ведение в культуру in vitro и получение регенерантов картофеля, а также их микрочеренкование, проводят согласно примеру 1. Укоренение микрочеренков осуществляют на питательной среде для укоренения, в которой в качестве источника углерода используют фруктозу в количестве 10000-20000 мг/л или смесь фруктозы и сахарозы в соотношении 0,5 1:1.

Время и условия культивирования пробирочных растений аналогичны примеру 1.

Из пробирочных растений, выросших на среде для укоренения, в условиях in vitro или в защищенном грунте получают миниклубни.

Миниклубни картофеля, полученные от растений-регенерантов, выращенных по примерам 1 и 2, высаживают в почву и наблюдают за развитием растений.

Проводят цитогенетический анализ корневых и стеблевых меристем. Развитие растений оценивают по биометрическим показателям и продуктивности.

В опыте по сравнению с контролем наблюдали более раннюю и дружную всхожесть растений (всходы появлялись на 5 дней раньше). Растения отличались однородностью, крепостью стебля и мощной, не измененной морфологически листовой поверхностью. Урожайность опытных растений значительно превышала урожайность контрольных растений.

Цитогенетический анализ показал, что количество нарушений хромосом в контроле в 1,5 2 раза больше, чем у опытных растений, а количество клеток с нормальным кариотипом (2n=48) в 1,5 1,64 раза меньше. Результаты представлены в табл. 1.

Пример 3 (контроль). Регенеранты стахиса, оздоровленные методом апикальной меристемы в условиях in vitro (см. пример 1), размножают микрочеренкованием. Для черенкования используют регенеранты с 8-10 листьями. Черенки высаживают в пробирки на питательную среду для черенкования (см. пример 1). Культивирование стахиса проводят при 16-часовой продолжительности светового дня, освещенности 5000 лкс, температуре 24 25^oC днем и 19-20^oC ночью. Через 4-5 недель культивирования выросшие пробирочные растения высаживают в грунт.

Пример 4 (опыт). Укоренение черенков стахиса проводят на среде для черенкования, в которой в качестве источника углерода используют фруктозу в количестве 10000 20000 мг/л или смесь фруктозы и сахарозы в соотношении 0,5 1:1 (см. пример 2).

Пробирочные растения стахиса, полученные по примерам 3 и 4, высаживают в открытый грунт и выращивают до окончания вегетационного периода (до полного увядания растений).

У растений проводят цитогенетический анализ корневых и стеблевых меристем. Развитие растений оценивают по биометрическим показателям и продуктивности.

Цитогенетические исследования показали, что у опытных растений в меристемах корня и стебля количество клеток с нормальным кариотипом более, чем в 3 раза больше по сравнению с контрольными растениями.

Опытные растения характеризовались многостебельностью и большей облиственностью. Общая площадь листовой поверхности в растете на один куст в 1,5 3 раза превышает таковую у контрольных растений. Урожайность клубней увеличивается в 1,5 раза.

Результаты представлены в табл.2.

Пример 5 (контроль). Для клонального микроразмножения гибридов томата используют семена этих растений.

Для введения в асептическую культуру семена в течение 5-7 мин стерилизуют в 0,1%-ном растворе диацида, трижды промывают стерильной водой. Подготовленные таким образом семена по одному помещают в пробирки с питательной средой следующего состава, мг/л: макро- и микроэлементы по Мурасиге и Скугу, сахароза 20000, агар 7000, тиамин 1,0, пиридоксин 0,5, никотиновая кислота - 0,5, аскорбиновая кислота 1,0, b индолилмасляная кислота 0,1.

Культивирование осуществляют при 24-25^oC днем и 19-20^oC ночью, 16-часовой продолжительности светового дня и освещенности 5000-6000 лкс. Время культивирования 3-4 недели. В течение этого срока формируются пробирочные растения с 4-5 листьями.

Полученные растения черенкуют и каждый черенок высаживают в пробирку на агаризованную питательную среду для черенкования. Среда, условия и время культивирования аналогичны примеру 1.

Пример 6 (опыт). Пробирочные растения томатов, полученные по примеру 5, черенкуют. Укоренение микрочеренков проводят на среде для черенкования, в которой в качестве источника углерода используют фруктозу в количестве 10000-20000 мг/л или смесь фруктозы и сахарозы в соотношении 0,5 1:1.

Время и условия культивирования по примеру 1.

Регенеранты, полученные после черенкования по примерам 5 и 6, высаживают в грунт и выращивают до полного созревания плодов.

До высадки в грунт у регенерантов проводят цитогенетический анализ корневых и стеблевых меристем.

Развитие растений оценивают по биометрическим показателям и продуктивности растений.

Анализ показал, что у опытных растений томатов клеток с нормальным кариотипом в 2 раза больше, чем у контрольных.

В условиях защищенного грунта опытные растения, развивающиеся из регенерантов, опережают в своем развитии контрольные растения.

Стадия бутонизации, начало цветения, завязывания плодов у опытных растений наступает на две недели раньше, чем у контрольных. Начало созревания плодов у опытных растений отмечается через 3 месяца после высадки в грунт, тогда как у контрольных через 3,5 месяца. В среднем, в зависимости от гибрида томатов, урожайность растений в 1,5 2,2 раза превышает урожайность контрольных растений (табл.3).

Таким образом, использование в качестве источника углерода в среде для укоренения фруктозы в количестве 10000-20000 мг/л или смеси фруктозы и сахарозы в соотношении 0,5 1:1 уменьшает структурные и количественные изменения хромосом. Число клеток с нормальным кариотипом возрастает. Растения-регенеранты, полученные по предлагаемому способу, в условиях защищенного грунта опережают в своем развитии контрольные растения и характеризуются повышенной продуктивностью.

Использование: сельское хозяйство и биотехнология. Сущность изобретения: клональное микроразмножение заключается в том, что экспланты высаживают на питательную среду для получения регенератов, проводят их микрочеренкование и укоренение микрочеренков на питательной среде, содержащей в качестве источников углерода фруктозу или смесь фруктозы с сахарозой в количестве 10000-20000 мг/л среды, причем в смеси соотношение фруктозы к сахарозе 0,2-1:1 соответственно. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

1. Способ клонального микроразмножения растений, включающий посадку экспланта на питательную среду для получения регенерантов, их микрочеренкование и укоренение микрочеренков на питательной среде, содержащей сахара в качестве источника углерода, отличающийся тем, что в качестве источника углерода в питательной среде для укоренения используют фруктозу или смесь фруктозы с сахарозой в количестве 10000 20000 мг/л среды. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют смесь фруктозы с сахарозой в соотношении 0,5 1 1 соответственно.