СПОСОБ МИКРОКЛОНАЛЬНОГО РАЗМНОЖЕНИЯ КАРТОФЕЛЯ IN VITRO СОРТА ХОЗЯЮШКА Российский патент 2023 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области сельского хозяйства, а именно, к технологии ускоренного размножения пробирочных растений картофеля в условиях in vitro. Изобретение может быть использовано для оздоровления пробирочных растений при производстве семенного посадочного материала свободного от вирусных и бактериальных инфекций из меристемных линий.

Картофель (Solanum tuberosum L.) является наиболее важным продуктом питания населения, выращивается в России повсеместно, практически во всех климатических зонах. Россия занимает одно из последних мест по урожайности культуры картофеля. Зараженность вирусными и бактериальными инфекциями семенного материала является одной из основных причин низкой урожайности картофеля. Картофель поражается бактериальными и вирусными инфекциями на всех этапах жизненного цикла: до появления всходов, во время вегетации, в период хранения. Возбудители инфекций способны накапливаться и длительно сохраняться в почве.

По данным ЗАО «Тепличный» г. Омска (2019 г), отечественный семенной картофель в промышленном картофелеводстве региона, практически на 100% поражен мозаичными вирусами (X, Y, S, L, М) и бактериальными инфекциями, приводящими к большим потерям урожая (до 50 %) и снижению качества. Сибирский сорт картофеля «Хозяюшка» высокоурожайный, крупноплодный, среднеспелый сорт картофеля столового назначения, отличается высокой товарностью и устойчивостью к температурным стрессам, однако сорт «Хозяюшка» находится на грани полного исчезновения за счет вырождения вирусами и вследствие этого в настоящее время в промышленном картофелеводстве Западной Сибири не используется. Сорт «Хозяюшка» рекомендован к выращиванию в двух регионах: Западно-Сибирском (Республика Алтай и Алтайский край, Кемеровская, Новосибирская, Омская, Томская, Тюменская области) и Восточно-Сибирском (Республики Бурятия, Якутия, Тыва, Хакасия, Иркутская область, Красноярский и Забайкальский края).

Перспективным направлением для производства картофеля, свободного от вирусных и бактериальных инфекции, является микроклональное размножение картофеля из меристемных линий. Картофельные вирусные заболевания чаще всего передаются через семенной материал. В процессе длительного культивирования оздоровленных от вирусных и бактериальных инфекций растений из меристемных линий в условиях in vitro, часто происходит контаминация материала бактериальной и грибной микрофлорой за счет инфицирования эксплантов, компонентов питательной среды, за счет внутрилабораторной передачи инфекции из воздуха, от персонала и от одной культуры к другим.

Известен способ микроклонального размножения картофеля, включающий стерилизацию питательной среды, культивирование растений картофеля in vitro путем микрочеренкования исходных растений. Используют питательную среду, содержащую макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, аскорбиновую кислоту. Метод, отличается тем, что предварительное оздоровление исходных растений картофеля от вирусной инфекции проводят стерилизацией в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут, с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной H₂O. Причем для культивирования оздоровленных растений и получения микроклубней картофеля используют питательную среду, содержащую дополнительно аденин 1-1,5 мг/л, кинетин 1-2 мг/л, индолилуксусную кислоту (ИУК) 0,5-1,5 мг/л, а тиамин, аскорбиновая кислота, Fe-хелат и сахароза берутся в следующей концентрации: 1-1,2 мг/л; 2,1-4 мг/л; 374-390 мг/л и 81000-85000 мг/л, получение микроклубней картофеля осуществляют при температуре 19-20°C при условии светового дня 8 часов (5000 лк) и полной темноты 16 часов и относительной влажности воздуха 70-80% [Патент РФ на изобретение №2637361, МПК А 01 Н 4/00, опубликован 04.12.2017 г.].

Недостатком этого способа микроклонального размножения картофеля применительно к генотипу сорта «Хозяюшка» является отсутствие компонента питательной среды для снижения контаминации вирусной и бактериальной микрофлоры в процессе длительного культивирования стерильных растений картофеля из меристемных линий в условиях in vitro.

Наиболее близким по технической сущности к заявленному изобретению является способ микроклонального размножения картофеля, включающий размножение пробирочных растений картофеля in vitro при использовании безгормональной питательной среды с рН 5,7-5,8, содержащей микросоли и макросоли по Мурасиге и Скуга, Fe₂SO₄, CaCl₂, мезо-инозит, тиамин, пиридоксин, никотиновую кислоту, сахарозу, глюкозу, агар, отличающийся тем, что дополнительно в питательную среду вводят биологически активные вещества мицелиального гриба Trichoderma lixii при следующем соотношении компонентов: макросоли - 50 мг/л, микросоли - 1 мг/л, Fe₂SO₄ 7H₂O - 5,0 мг/л, CaCl₂ H₂O - 440 мг/л, мезо-инозит - 100 мг/л, тиамин 1,0 мг/л, пиридоксин - 1,0 мг/л, никотиновая кислота - 0,5 мг/л, сахароза - 25 г/л, глюкоза - 25 г/л, агар - 6 г/л, биологически активные вещества - мицелиального гриба Trichoderma lixii - 0,5 мг/л [Патент РФ на изобретение №2702765, МПК А 01 Н 4/00, опубликован 11.10.2019 г.].

Недостатками этого способа микроклонального размножения картофеля применительно к генотипу сорта «Хозяюшка» является ограничение использования тетрациклина для производства оздоровленных пробирочных растений ввиду того, что антибиотик активен в отношении лишь некоторых грамотрицательных бактерий. К антибиотику тетрациклину не устойчивы микроорганизмы большинства грибов, которые чаще всего вызывают контаминацию питательной среды при длительном культивировании стерильных растений в условиях in vitro. Недостаточно высокая скорость роста эксплантов и растений-регенерантов in vitro на безгормональной питательной среде.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является повышение эффективности размножения оздоровленных пробирочных растений картофеля сорта «Хозяюшка», полученных из меристемных линий, в условиях in vitro.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение в короткие сроки оздоровленных растений сибирского сорта картофеля «Хозяюшка», повышение коэффициента микроклонального размножения растений-регенерантов, ускорение роста эксплантов, снижение вирусной и бактериальной нагрузки при длительном культивировании стерильных растений in vitro.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе микроклонального размножения картофеля, включающем размножение пробирочных растений картофеля in vitro при использовании питательной среды Мурасиге и Скуга, содержащей макросоли, микросоли, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, глюкозу, агар, рН 5,7-5,8. Согласно заявленному изобретению осуществляют предварительное оздоровление исходных растений картофеля от вирусной инфекции стерилизацией в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной H₂O, причем для культивирования оздоровленных растений и эксплантов картофеля используют питательную среду с дополнительным внесением феруловой кислоты 0,5 мг/л, кинетина 1мг/л, PPT - 0,01 мг/л, при следующем соотношении компонентов: макросоли 50 мг/л, микросоли 1 мг/л, Fe₂SO₄·7H₂O - 5,0 мг/л, CaCl₂·2H₂O - 440 мг/л, мезо-инозит - 100 мг/л, тиамин - 1,0 мг/л, пиридоксин - 1,0 мг/л, сахароза - 20 000 мг/л, агар - 7000 мг/л, рН 5,7-5,8.

Отличительным признаком заявляемого способа является введение в состав питательной среды для размножения пробирочных растений картофеля PPT (фосфинотрицин, Баста) в концентрации 0,1 мг/л, который обеспечивает деконтаминацию от нежелательной вирусной и бактериальной микрофлоры культивируемого растительного материала и обогащение, введение биологически активного вещества - феруловой кислоты в концентрации 0,5 мг/л и фитогормона - кинетина в концентрации 1мг/л ускоряют ростовые факторы.

Комплексное использование в питательной среде феруловой кислоты, кинетина и взаимовлияние их друг на друга способствует более интенсивному стимулированию ростовых процессов, ризогенезу, морфогенезу и приживаемости эксплантов. Учитывая, что соотношение биологически активных веществ - феруловой кислоты и кинетина, является ключевым фактором деления клеток и дифференцировки тканей растения картофеля, экспериментальным путем установлено оптимальное соотношение и концентрации внесения в питательную среду. Введенная в состав питательной среды феруловая кислота обладает активным действием на ростовые процессы, выступая в качестве активатора ИУК-оксидазы, участвуя в ее биосинтезе. Феруловая кислота экономичнее, чем гетерауксины, что снижает себестоимость получения оздоровленных растений.

Доказано, что использование PPT (фосфинотрицин) в концентрации 0,01 мг/л для неустойчивых растений и выше 0,5 мг/л для устойчивых растений, снижает уровень контаминации в процессе культивирования in vitro, данный гербицид в низких концентрациях в питательной среде обладает бактерицидным и фунгицидным действием.

Опыты проводились в условиях лаборатории «Клеточная биотехнология» ООО «Элита» с оздоровленным сортом картофеля «Хозяюшка».

Способ микроклонального размножения картофеля осуществляют следующим образом.

Отбирают экспланты растений картофеля, регенерированные из апикальных меристем размером 0,1-0,5 мм с одним примордиальным листом, стерильные от вирусной и бактериальной инфекций. Растения картофеля должны иметь 8-10 междоузлий.

Для пересадки эксплантов растений картофеля готовят твердую питательную среду по прописи Мурасиге и Скуга, содержащую макросоли 50 мг/л, микросоли 1 мг/л, феруловой кислоты 0,5 мг/л, кинетина 1мг/л, РРТ 0,01 мг/л, Fe2SO4·7H2O - 5,0 мг/л, CaCl2·2H2O - 440 мг/л, мезо-инозит - 100 мг/л, тиамин - 1,0 мг/л, пиридоксин - 1,0 мг/л, сахароза - 20 000 мг/л, агар - 7000 мг/л. Уровень рН питательной среды перед автоклавированием - 5,8. Питательную среду автоклавируют в автоклаве под давлением 1,0 атм, температуре 110°С в течение 10 минут. РРТ в концентрации 0,01 мг/л вносят в стерильных условиях ламинар-бокса в питательную среду, остывшую до 55-60°С после автоклавирования, затем питательную среду разливают в пробирки и закрывают ватно-марлевыми пробками.

Затем в условиях ламинар-бокса растения картофеля, регенерированные из апикальных меристем, извлекают из пробирки пинцетом и кладут на стерильную крафт-бумагу (100*100 мм). Стерильными инструментами растения извлекают из пробирок и скальпелем разрезают на черенки, которые содержат кусочек стебля с листочком и пазушной почкой. Длина микрочеренка составляет 10-15 мм, 2 мм над глазком, остальные под глазком. Затем черенки с помощью пинцета переносят в пробирки с твердой питательной средой по прописи Мурасиге и Скуга, содержащую макросоли 50 мг/л, микросоли 1 мг/л, феруловой кислоты 0,5 мг/л, кинетина 1мг/л, РРТ 0,01 мг/л. Культивирование растений (эксплантов) осуществляют в культуральной комнате при освещенности 5000 люкс, фотопериоде - 16 часов, температуре 25°С и влажности воздуха 70-80%. В процессе роста (интервал 14 суток) проводят оценку морфометрических показателей и наличие контаминантов в выросших растениях с 5-6 черенками. В таблице 1 представлены результаты исследований по размножению оздоровленных пробирочных растений картофеля сорта «Хозяюшка», полученных из меристемных линий, в условиях in vitro.

Таблица 1. Морфологические показатели регенерации Корневая система,
шт. Листья,
шт. Высота растений,
см. Количество междоузлий, шт. Кол-во дней 1 7 14 1 7 14 1 7 14 1 7 14 Предлагаемая
питательная среда 0 4,1 11,2 1,0 9,3 11,5 2,1 5,7 12,1 1,0 5,1 8,2 Контрольная питательная среда (прототип) 0 3,6 7,1 1,0 7,1 9,1 2,2 5,1 10,2 1,0 4,1 7,1

Использование заявляемого способа микроклонального размножения картофеля in vitro позволяет получить безвирусные растения-регенеранты отечественного сорта картофеля «Хозяюшка», полученных из меристемных линий, с повышенной жизнеспособностью, приживаемостью, высокими морфометрическими показателями, отсутствием контаминации при культивировании вирусной и бактериальной инфекциями.

Предлагаемый способ прост в использовании, экологически безопасен и может быть использован на предприятиях для получения стерильного семенного картофеля.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии ускоренного размножения пробирочных растений картофеля в условиях in vitro. Изобретение представляет собой способ микроклонального размножения картофеля, включающий размножение пробирочных растений картофеля in vitro при использовании питательной среды Мурасиге и Скуга, содержащей макросоли, микросоли, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, глюкозу, агар. При этом осуществляют предварительное оздоровление исходных растений картофеля от вирусной инфекции стерилизацией апикальных меристем (0,2-0,5 мм) в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной H₂O. Для культивирования оздоровленных растений (эксплантов) картофеля в питательную среду вносят феруловую кислоту 0,5 мг/л, кинетин 1мг/л, РРТ 0,01 мг/л при следующем соотношении компонентов: макросоли 50 мг/л, микросоли 1 мг/л, Fe₂SO₄·7H₂O - 5,0 мг/л, CaCl₂·2H₂O - 440 мг/л, мезо-инозит - 100 мг/л, тиамин - 1,0 мг/л, пиридоксин - 1,0 мг/л, сахароза - 20 000 мг/л, агар - 7000 мг/л, рН 5,7-5,8. Культивирование растений (эксплантов) осуществляют в культуральной комнате при освещенности 5000 люкс, фотопериоде - 16 часов, температуре 25°С и влажности воздуха 70-80%. Способ позволяет повысить эффективность размножения пробирочных растений картофеля свободных от вирусных и бактериальных инфекций в условиях in vitro, прост в использовании и может быть использован на предприятиях для получения стерильного семенного картофеля. 1 табл.

Способ микроклонального размножения картофеля, включающий размножение пробирочных растений картофеля in vitro при использовании питательной среды Мурасиге и Скуга, содержащей макросоли, микросоли, Fe-хелат, агар-агар, витамины по Уайту и сахарозу, глюкозу, агар, рН 5,7-5,8, отличающийся тем, что осуществляют предварительное оздоровление исходных растений картофеля от вирусной инфекции стерилизацией апикальных меристем размером 0,2-0,5 мм в 0,3%-ном растворе диацида в течение 3-5 минут с последующей трехкратной промывкой стерильной дистиллированной Н₂О, оздоровленные растения и экспланты картофеля культивируют с использованием питательной среды Мурасиге и Скуга с дополнительным внесением феруловой кислоты 0,5 мг/л, кинетина 1 мг/л, РРТ 0,01 мг/л при следующем соотношении компонентов: макросоли 50 мг/л, микросоли 1 мг/л, Fe₂SO₄⋅7Н₂О - 5,0 мг/л, CaCl₂⋅2H₂O - 440 мг/л, мезоинозит - 100 мг/л, тиамин - 1,0 мг/л, пиридоксин - 1,0 мг/л, сахароза - 20 000 мг/л, агар - 7000 мг/л, рН 5,7-5,8.