СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ОБЕДНЕННОЙ НЕКОНЪЮГИРОВАННЫМИ ЛИПОФИЛЬНЫМИ СОЕДИНЕНИЯМИ ПРИРОДНОЙ СМЕСИ КОНЪЮГИРОВАННЫХ ЛОШАДИНЫХ ЭСТРОГЕНОВ Российский патент 2008 года по МПК A61K35/22 A61K38/22 A61P5/24 

Настоящее изобретение относится к способу выделения природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов, обедненной неконъюгированными липофильными соединениями из группы, включающей неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды, неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и сопоставимые с ними неконъюгированные соединения.

Эстрогены используются в медицине для заместительной гормонотерапии. Смеси эстрогенов применяют прежде всего в лечебных и профилактических целях при недомоганиях, возникающих у женщин в климактерический период после естественной или искусственно вызванной менопаузы. Для применения в подобных целях как особо эффективные и хорошо переносимые пациентами зарекомендовали себя природные смеси конъюгированных эстрогенов, содержащиеся в моче жеребых кобыл и ниже называемые природными смесями конъюгированных лошадиных эстрогенов.

Содержание твердого вещества, растворенного в моче жеребых кобыл (в последующем описании сокращенно обозначаемой как "МЖК"), может, как очевидно, колебаться в достаточно широких пределах и обычно составляет от 40 до 90 г сухого вещества на литр. Наряду с мочевиной и прочими обычными компонентами мочи в твердом веществе, содержащемся в МЖК, присутствуют также фенольные компоненты в количествах, составляющих от примерно 2 до 5 мас.% в пересчете на массу сухого вещества. К числу таких фенольных компонентов относятся крезолы и дигидро-3,4-бис[(3-гидроксифенил)метил]-2(3Н)-фуранон, сокращенно обозначаемый как ГФМФ. Эти вещества могут быть представлены в свободной или конъюгированной форме. В МЖК содержится далее природная смесь эстрогенов, которая преимущественно представлена в конъюгированной форме, например, в виде натриевой соли полуэфира серной кислоты (ниже кратко называемой как "сульфат"). Содержание конъюгированных эстрогенов (рассчитываемое для сульфата эстрогенов) может составлять от 0,1 до 1 мас.% в пересчете на массу сухого вещества. В твердом веществе, содержащемся в МЖК, дополнительно могут присутствовать и иные липофильные соединения, количества которых могут варьироваться в широких пределах и не поддаются прогнозированию. К таким липофильным соединениям, источником которых служат преимущественно потребляемые жеребыми кобылами в пищу растения, относятся главным образом различные флавоноидные, изофлавоноидные и норизопреноидные производные, а также сопоставимые с ними соединения, такие, например, как формононетин, генистеин, даидзеин, биоханин А, эквол и куместрол. Эти липофильные соединения изначально растительного происхождения могут присутствовать в моче в конъюгированной или в свободной (не конъюгированной) форме. К другим липофильным компонентам твердого вещества, содержащегося в МЖК, относятся также неконъюгированные стероидные производные, среди которых особо следует отметить андростановые и прегнановые стероиды, но также можно назвать неконъюгированные эстрогенные производные.

Экстракты, содержащие природные смеси конъюгированных эстрогенов, обычно получают либо методом твердофазной экстракции, либо методом, основанным на различных процессах жидкостно-жидкостной экстракции не смешивающимися или лишь плохо смешивающимися с водой органическими растворителями. В целом же выделенная из МЖК природная смесь конъюгированных эстрогенов для возможности ее использования в качестве действующего вещества в фармацевтических препаратах должна удовлетворять определенным фармацевтическим спецификациям, например, должна соответствовать спецификациям, изложенным в фармакопее США или в европейской фармакопее. Так, в частности, содержание конъюгированных эстрогенов в такой смеси в пересчете на массу сухого вещества должно быть не ниже определенных предельных значений.

В патентах US 2551205 и US 2429398 описан способ получения водорастворимого препарата эстрогенов из МЖК, в соответствии с которым сначала путем адсорбции на активированном угле или иных пригодных адсорбентах, элюирования смешивающимся с водой органическим растворителем, например, пиридином, и последующего удаления растворителя получают водный концентрат, который содержит преобладающую часть водорастворимых эстрогенных компонентов исходной МЖК. Если согласно патенту US 2429398 концентрат путем его экстракции бензолом и/или простым эфиром подвергают дальнейшей очистке, то согласно патенту US 2551205 концентрат подкисляют до значения рН в интервале от 2 до 6, предпочтительно от 4 до 5, и затем быстро экстрагируют практически не смешивающимся с водой органическим растворителем из группы алифатических, ароматических или алициклических углеводородов (например, гексаном, бензолом, толуолом, циклогексаном) или хлорированных углеводородов (например, хлороформом, этилендихлоридом, трихлорэтиленом, четыреххлористым углеродом, хлорбензолом) с целью отделения нежелательных веществ, таких как жиры, масла, свободные фенольные компоненты и неконъюгированные стероиды, за счет их перевода в органическую фазу. В завершение водную фазу стабилизируют путем ее нейтрализации. В патенте US 2551205 полученный экстракт рекомендуется подвергать дальнейшей очистке путем последующих стадий экстракции и осаждения. В целом же по завершении описанного в US 2551205 способа выход эстрогеновых компонентов используемого концентрата составляет лишь примерно 80% от всего их содержания в нем.

В патенте US 2565115 описана экстракция конъюгированных эстрогенов из МЖК ацетоном. О чистоте полученной таким путем эстрогенной фракции в этом патенте, однако, не приводится никаких данных.

В патенте US 2696265 описан способ, в соответствии с которым сначала эстрогены экстрагируют алифатическим спиртом или кетоном, например, гексанолом, циклогексанолом или циклогексаноном. Эстрогены переходят при этом в органическую фазу, после чего их подвергают дальнейшей очистке и, в частности, содержащую эстрогены водную фазу подкисляют соляной кислотой до значения рН, равного 4, и экстрагируют этилендихлоридом.

В патенте US 2834712 описан способ получения смесей эстрогенов с высокой степенью чистоты и малой токсичностью, основанный на выполнении множества отдельных стадий экстракции различными растворителями при различных значениях рН. При этом используются большие объемы растворителей, например, гексана и бензола. Так, например, на одной из стадий в целях отделения фенольных компонентов уже очищенный концентрат растворяют в воде, полученный раствор подкисляют соляной кислотой до значения рН, равного примерно 5,0, и после этого экстрагируют бензолом, а затем простым эфиром.

В заявке WO 01/27134 описан сравнительно простой в осуществлении способ экстракции конъюгированных эстрогенов из МЖК. В соответствии с этим способом МЖК после добавления к ней соли, например, хлорида натрия, подвергают экстракции взятым по меньшей мере в таком же объеме органическим растворителем, например этилацетатом, что сопровождается переходом конъюгированных эстрогенов в органическую фазу. Эту органическую фазу отделяют и сушат, получая собственно экстракт. Однако в заявке WO 01/27134 не приведено никакой информации о чистоте полученного экстракта конъюгированных эстрогенов.

Однако при осуществлении описанных выше известных методов жидкостно-жидкостной экстракции приходится сталкиваться со множеством проблем, таких как интенсивное пенообразование, образование осадка, образование эмульсии и плохое разделение фаз. Обычно экстракцию требуется проводить в несколько стадий, что приводит к потере эстрогенных компонентов и лишь неполному их выделению из мочи. Помимо этого для проведения этих методов экстракции требуются большие объемы отчасти вредных для здоровья растворителей. Кроме того, в указанных выше патентных публикациях не содержится никакой информации ни о содержании в получаемых продуктах неконъюгированных липофильных компонентов, таких, например, как неконъюгированные флавоноидные, изофлавоноидные и норизопреноидные производные и сопоставимые с ними неконъюгированные соединения или же неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, ни об отделении этих компонентов. Эти известные способы не позволяют получить удовлетворительных результатов касательно выхода или касательно чистоты получаемых экстрактов, о чем свидетельствуют данные измерений на полученном общем количестве гормонов в пересчете на массу сухого вещества, или же основаны на проведении множества различных стадий и применении больших объемов органических и отчасти даже нежелательных с токсикологической точки зрения растворителей.

Из уровня техники известны далее различные методы твердофазной экстракции, предназначенные для получения значительно обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов. Так, в частности, в заявке WO 98/08526 описан способ, который позволяет путем твердофазной экстракции на семиполярной, прежде всего на неионогенной семиполярной, полимерной адсорбирующей смоле получать содержащую практически все количество присутствующих в МЖК природных эстрогенов смесь, обедненную фенольными компонентами мочи и практически не содержащую крезол и ГФМФ. В заявке WO 98/08525 описан аналогичный способ, в котором при твердофазной экстракции в качестве адсорбента используется силикагель. Аналогичный способ описан и в заявке CN 1308083, основанный на применении полярных адсорбирующих смол, содержащих цианогруппы. Получаемые этими способами экстракты могут использоваться в качестве исходного материала для получения фармацевтических препаратов, которые в качестве действующего вещества содержат природную смесь конъюгированных эстрогенов из МЖК.

Смеси конъюгированных эстрогенов, выделенные из МЖК описанным в WO 98/08526 способом или описанным в WO 98/08525 способом, обычно удовлетворяют установленным требованиям фармацевтических спецификаций, например, касательно соблюдения предельных значений содержания конъюгированных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества. Однако было установлено, что в сухом веществе наряду с требуемыми конъюгированными эстрогенами могут содержаться также неконъюгированные липофильные соединения. К таким неконъюгированным липофильным соединениям относятся, например, различные неконъюгированные флавоноидные, изофлавоноидные и норизопреноидные производные и сопоставимые с ними неконъюгированные соединения, такие как формононетин, генистеин, даидзеин, биоханин А, эквол и куместрол, но также неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и неконъюгированные эстрогены, при этом такой перечень неконъюгированных липофильных соединений не ограничен указанными выше. Присутствие неконъюгированных липофильных соединений в выделенной из МЖК смеси конъюгированных эстрогенов не представляется возможным стандартизировать, поскольку содержание и состав свободных и конъюгированных липофильных соединений варьируется, например, в зависимости от потребляемого жеребыми кобылами корма.

Хотя состав природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов и не изменяется из-за дополнительного присутствия в ней неконъюгированных липофильных соединений, тем не менее их наличие может снижать содержание конъюгированных лошадиных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества. Концентрацию действующих веществ, т.е. конъюгированных лошадиных эстрогенов, в полученном экстракте в принципе можно повысить путем целенаправленного отделения неконъюгированных липофильных компонентов. Отделение неконъюгированных липофильных соединений для обеспечения однородного состава отдельных партий экстракта может оказаться также целесообразным с точки зрения безопасности лекарственных средств, поскольку в этом случае благодаря удалению неконъюгированных липофильных компонентов, содержание и состав которых в МЖК может варьироваться в зависимости от сезонного изменения типа потребляемого жеребыми кобылами корма, все полученные экстракты имели бы сравнимое содержание в них конъюгированных лошадиных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества. Помимо этого отделение неконъюгированных липофильных соединений может оказаться предпочтительным для достижения однородного спектра физиологического действия. Так, например, может оказаться целесообразным отделять от природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов присутствующие в ней при определенных условиях неконъюгированные липофильные соединения, которые возможно сами могут обладать нежелательным физиологическим действием.

Исходя из вышеизложенного, в основу настоящего изобретения была положена задача разработать технически и экономически оптимальный способ выделения природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов со значительно сниженным содержанием в ней неконъюгированных липофильных соединений, прежде всего неконъюгированных флавоноидных, изофлавоноидных и норизопреноидных производных. Задача настоящего изобретения состояла прежде всего в разработке такого способа, для осуществления которого требовалось бы использовать лишь небольшие количества безвредных растворителей. Еще одна задача изобретения состояла в разработке способа, который был бы основан на проведении лишь небольшого количества стадий и позволял бы при этом получать экстракт конъюгированных лошадиных эстрогенов со сравнительно высоким их содержанием в нем в пересчете на массу сухого вещества. Кроме того, подобный способ должен простым путем обеспечивать возможность такой переработки уже обедненной фенольными компонентами мочи смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл, которая может содержать неконъюгированные липофильные соединения в варьирующихся и при определенных условиях повышенных количествах, чтобы полученная этим способом природная смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов имела высокое содержание в ней действующих веществ и удовлетворяла бы установленным фармацевтическим спецификациям, прежде всего касательно соблюдения предельных значений содержания конъюгированных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества.

Для решения указанных задач согласно изобретению был разработан способ, который неожиданно простым путем позволяет выделять даже из МЖК, которая может содержать неконъюгированные липофильные соединения в варьирующихся и при определенных условиях повышенных количествах, смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов, в значительной степени обедненную неконъюгированными липофильными соединениями, прежде всего неконъюгированными флавоноидными, изофлавоноидными и норизопреноидными производными. Предлагаемый в изобретении способ может найти применение для переработки прежде всего уже обедненной фенольными компонентами мочи смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл и получения в результате смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов, которая в качестве получаемого этим способом продукта обладает высоким качеством и в полной мере удовлетворяет фармацевтическим спецификациям, в том числе и касательно главным образом соблюдения предельных значений содержания конъюгированных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества.

Предлагаемый в изобретении способ выделения природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов отличается тем, что получаемая им смесь обеднена неконъюгированными липофильными соединениями из группы, включающей неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды, неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и сопоставимые с ними неконъюгированные соединения, а также отличается тем, что

а) водную исходную фазу, выбранную из группы, включающей

(1) водный раствор уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл,

(2) водный концентрат уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл,

(3) концентрат жидкой мочи и

(4) концентрат мочи, необязательно подвергнутый предварительной очистке путем фильтрации,

подвергают жидкостно-жидкостной экстракции достаточным количеством экстрагента, который представляет собой пригодный для экстракции неконъюгированных липофильных соединений из указанной выше группы, не смешивающийся или практически не смешивающийся с водой органический растворитель, с последующим отделением водной фазы,

б) при необходимости повторяют стадию а), подвергая переработке на ней полученную водную фазу, и

в) получают содержащую природную смесь конъюгированных эстрогенов водную фазу, которую при необходимости концентрируют.

В качестве водной исходной фазы предлагаемым в изобретении способом можно, как указано выше, перерабатывать (1) водный раствор уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл или (2) водный концентрат уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл. Такой водный раствор или такой водный концентрат можно получать способом, который уже описан, например, в заявках WO 98/08526 и WO 98/08525 или в заявке CN 1308083 и который тем самым стал известен из указанных опубликованных заявок. В соответствии с этим содержание этих заявок WO 98/08526, WO 98/08525 и CN 1308083 включено в настоящее описание в качестве ссылки. Водный раствор или водный концентрат уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл может также представлять собой продукт, получаемый в процессе жидкостно-жидкостной экстракции, особенности которой описаны, например, в заявке WO 01/27134. Получаемые описанными в указанных выше заявках способами водные растворы или концентраты можно также перед их переработкой предлагаемым в изобретении способом подвергать дополнительному концентрированию известным методом, например, перегонкой, для получения таким путем концентрата, практически не содержащего органический растворитель.

Помимо этого в качестве водной исходной фазы предлагаемым в изобретении способом можно перерабатывать (3) концентрат, полученный сгущением МЖК, или (4) полученный из МЖК концентрат, который уже подвергнут предварительной очистке путем фильтрации или иными аналогичными методами. Собранную мочу (МЖК) сначала известным методом очищают от слизи и твердых примесей или веществ. В предпочтительном варианте таким твердым веществам и слизи сначала дают осесть, а затем отделяют от них остальную мочу известными методами разделения, например декантацией, сепарацией и/или фильтрацией. Так, например, МЖК можно пропускать через известное как таковое разделительное устройство, в частности сепаратор, фильтровальную установку или отстойник. Разделяющей средой может служить, например, песок, или же для разделения могут использоваться имеющиеся в продаже сепараторы, например, сопловые сепараторы либо сепараторы камерного типа. При необходимости можно также использовать установку для микрофильтрации или установку для ультрафильтрации, применение которых одновременно обеспечивает также практически полное отсутствие микробов и вирусов в профильтрованной МЖК.

При необходимости к моче, соответственно ее концентрату можно добавлять консерванты, гермициды, бактерициды и/или гельминтоциды.

В качестве предварительно очищенного концентрата мочи (4) можно также использовать концентрированный ретентат (вещество, не прошедшее через мембранный фильтр) МЖК, который можно получать из МЖК путем ее известной мембранной фильтрации. Содержание твердого вещества в ретентате и его состав могут варьироваться в зависимости от перерабатываемой МЖК и используемой для фильтрации мембраны, например, от размера ее пор, а также в зависимости от условий фильтрации. Так, в частности, использование мембранного фильтра с размерами пор, лежащими в нанометровом диапазоне, обеспечивает получение ретентата с повышенной концентрацией в нем содержащихся в МЖК эстрогенов практически без их потери при одновременном удалении до 50 мас.% низкомолекулярных компонентов МЖК. При осуществлении предлагаемого в изобретении способа можно использовать ретентаты МЖК, степень или коэффициент концентрации которых может достигать порядка 1:10, например, может составлять порядка 1:7, и объем которых тем самым может быть уменьшен до порядка 1/10, например, может составлять порядка 1/7, от первоначального объема МЖК.

Если используемый в качестве водной исходной фазы концентрат представляет собой сгущенный концентрат МЖК или уже предварительно очищенный, например, путем мембранной фильтрации, концентрат МЖК, то в этом случае получаемая смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов со сниженным предлагаемым в изобретении способом содержанием в ней неконъюгированных липофильных соединений уже может иметь достаточную степень чистоты, однако в ней возможно все еще могут присутствовать в значительных количествах фенольные компоненты мочи, которые необходимо отделять проведением дополнительных стадий. Так, в частности, полученную водную фазу можно перерабатывать, например, способом, описанным в заявках WO 98/08526 и WO 98/08525 или в заявке CN 1308083 и тем самым известным специалистам в данной области из этих публикаций, с получением продукта, который и по содержанию в нем фенольных компонентов мочи удовлетворяет требованиям, предъявляемым фармацевтическими спецификациями к конъюгированным эстрогенам.

Согласно настоящему изобретению в качестве водной исходной фазы наиболее предпочтительно использовать водный раствор уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл либо водный концентрат уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл.

Согласно изобретению более подробно рассмотренную выше водную исходную фазу подвергают на стадии (а) жидкостно-жидкостной экстракции достаточным количеством экстрагента, который представляет собой не смешивающийся или практически не смешивающийся с водой органический растворитель, пригодный для экстракции неконъюгированных липофильных соединений, прежде всего неконъюгированных флавоноидов, неконъюгированных изофлавоноидов, неконъюгированных норизопреноидов и неконъюгированных стероидов. Такой органический растворитель, кроме того, должен быть не смешивающимся или практически не смешивающимся с водной исходной фазой, при этом выражение "практически не смешивающийся" означает, что в водной фазе допускается наличие максимум 6 об.% растворенного в ней органического растворителя. Для проведения этой стадии жидкостно-жидкостной экстракции в принципе может использоваться любой не смешивающийся с водой органический растворитель, способный экстрагировать из водной фазы содержащиеся в ней неконъюгированные липофильные соединения. Для экстракции неконъюгированных липофильных соединений, прежде всего неконъюгированных флавоноидов, неконъюгированных изофлавоноидов, неконъюгированных норизопреноидом и неконъюгированных стероидов, пригодны, например, следующие органические растворители с 1-10 атомами углерода, которые могут быть расположены в виде прямой или разветвленной цепи либо в виде цикла: спирты с С₄-С₁₀ (как, например, бутанол, гексанол, циклогексанол и пентанол), эфиры кислот с С₂-С₁₀ (как, например, этилацетат (этиловый эфир уксусной кислоты), метилацетат, пропилацетат, изопропилацетат, бутилацетат, амилацетат, этилметилмалонат и диметилфосфонат), альдегиды с С₃-С₁₀ и кетоны с С₄-С₁₀ (как, например, бутанон, пентанон, гексан-2,4-дион, гександиал, циклогексанкарбальдегид, метилфенилкетон и аналогичные соединения), соответственно в целом С₃-С₁₀алкоксисоединения, простые эфиры с С₂-С₁₀ (диэтиловый эфир, метил-трет-бутиловый эфир), нитрилы с С₃-С₆ и галоалканы с C₁-С₃ (метиленхлорид), а также смеси вышеуказанных растворителей. При осуществлении предлагаемого в изобретении способа в качестве экстрагента прежде всего могут использоваться С₁-С₄алкиловые эфиры уксусной кислоты, гексанол, диэтиловый эфир, метиленхлорид, метил-трет-бутиловый эфир и смеси этих растворителей. Среди этих растворителей предпочтительными для применения при осуществлении предлагаемого в изобретении способа экстрагентами являются С₁-С₄алкиловые эфиры уксусной кислоты и прежде всего этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат).

При проведении жидкостно-жидкостной экстракции достаточным количеством экстрагента на стадии (а) предлагаемого в изобретении способа объемное соотношение между водной исходной фазой и экстрагентом не ограничено какими-либо конкретными пределами. В общем же случае органический растворитель используют в объеме, соответствующем объему водной исходной фазы, что, однако, не исключает возможности использования водной и органической фаз в соотношении между ними, составляющем от 10:1 до 1:10. В предпочтительном варианте объемное соотношение между водной исходной фазой и органическим растворителем, используемым в качестве экстрагента, выбирают в интервале от 5:1 до 1:3, прежде всего от 2:1 до 1:2.

Методика проведения подобного процесса экстракции известна из уровня техники. Обычно для проведения жидкостно-жидкостной экстракции используют оборудование, обеспечивающее непрерывное перемешивание водной фазы и не смешивающейся с водой органической фазы. В качестве примера такого оборудования, пригодного для проведения подобного процесса экстракции, можно назвать смеситель-отстойник, в котором обе фазы смешивают путем их принудительного перемешивания.

Описанную выше жидкостно-жидкостную экстракцию в принципе можно проводить при любом значении рН водной исходной фазы. В одном из предпочтительных вариантов жидкостно-жидкостную экстракцию на стадии (а) предлагаемого в изобретении способа проводят при значении рН водной исходной фазы в интервале от 4 до 12. Более предпочтительно устанавливать значение рН на величину в интервале от 4,0 до 7,0, т.е. в интервале от слабокислого до нейтрального. Наиболее предпочтительно устанавливать значение рН на величину в интервале от 4,0 до 6,0, прежде всего от 4,7 до 5,3.

При установке значения рН раствор, предварительно загруженный в емкость достаточных размеров, изготовленную из инертного материала, например, в чан из высококачественной стали, целесообразно перемешивать мешалкой или аналогичным устройством для быстрой и равномерной установки таким путем значения рН на требуемое. Для регулирования значения рН можно использовать обычные основания или кислоты. Так, например, для снижения значения рН можно использовать одну из обычных неорганических или органических кислот, предпочтительно разбавленную кислоту. Согласно изобретению было установлено, что для снижения значения рН или для его установки на величину менее 7 наиболее целесообразно применять, например, разбавленную серную кислоту, предпочтительно 1 н. серную кислоту, разбавленную уксусную кислоту, разбавленную фосфорную кислоту или разбавленную соляную кислоту, предпочтительно 1 н. соляную кислоту.

Описанную выше жидкостно-жидкостную экстракцию не требуется проводить при какой-либо конкретной температуре, а можно проводить в достаточно широком интервале температур, которые могут составлять от 5°С до температуры кипения органического растворителя, соответственно максимум до 95°С. Предлагаемую в изобретении жидкостно-жидкостную экстракцию предпочтительно проводить при комнатной температуре, поскольку в этом случае потребность в дополнительной энергии минимальна. За комнатную температуру обычно принимается окружающая температура, например температура в интервале от 10 до 30°С.

Продолжительность подобной жидкостно-жидкостной экстракции не ограничена согласно изобретению какими-либо конкретными пределами и может составлять от 5 мин до нескольких часов, варьируясь в зависимости от количества используемой водной исходной фазы. Обычно водную фазу, используемую на стадии (а), и органический экстрагент перемешивают между собой в течение 5-60 мин, предпочтительно 10-20 мин, в целях обеспечить максимально полный переход неконъюгированных липофильных компонентов из водной фазы в органическую.

По окончании экстракции, проводимой при перемешивании, смесь фаз оставляют стоять для их разделения. Процесс разделения фаз может в зависимости от их используемого объема занимать от 10 мин до нескольких часов, предпочтительно, однако, оставлять фазы стоять на 30-120 мин. После разделения водной и органической фаз водную фазу отделяют и направляют на хранение для последующего применения или переработки, а органическую фазу направляют в отходы.

Описанную выше стадию (а) при необходимости можно повторять, и в этом случае за ней согласно изобретению следует необязательная стадия (б), на которой полученную на стадии (а) водную фазу вновь подвергают жидкостно-жидкостной экстракции достаточным количеством экстрагента, который представляет собой не смешивающийся или практически не смешивающийся с водой органический растворитель, пригодный для экстракции неконъюгированных липофильных соединений, прежде всего неконъюгированных флавоноидов, неконъюгированных изофлавоноидов, неконъюгированных норизопреноидов и неконъюгированных стероидов.

В отношении выбора экстрагента и в отношении условий и режимов проведения экстракции, т.е. применяемого оборудования, продолжительности процесса экстракции и поддерживаемой в процессе экстракции температуры, справедливы все рассмотренные выше в качестве примеров для стадии (а) возможные варианты.

При проведении стадий (а) и (б) на обеих этих стадиях можно согласно изобретению использовать различные экстрагенты или один и тот же экстрагент. Предпочтительно использовать на обеих стадиях экстракции один и тот же экстрагент. Наиболее целесообразно использовать на обеих стадиях экстракции в качестве экстрагента С₁-С₄алкиловый эфир уксусной кислоты, прежде всего этиловый эфир уксусной кислоты.

При проведении жидкостно-жидкостной экстракции достаточным количеством экстрагента на стадии (б) предлагаемого в изобретении способа объемное соотношение между уже один раз подвергнутой экстракции, содержащей конъюгированные лошадиные эстрогены водной фазой со стадии (а) и экстрагентом не ограничено какими-либо конкретными пределами. В общем же случае органический растворитель применяют в объеме, который существенно меньше объема полученной на стадии (а) водной фазы, что, однако, не исключает возможности использования водной и органической фаз в соотношении между ними, составляющем от 40:1 до 1:2. В предпочтительном варианте объемное соотношение между полученной на стадии (а) водной фазой и органическим растворителем, используемым в качестве экстрагента, выбирают в интервале от 20:1 до 1:1, прежде всего от 10:1 до 2:1.

По окончании экстракции, проводимой при перемешивании на стадии (б), смесь фаз оставляют стоять для их разделения. Процесс разделения фаз может занимать от 10 мин до нескольких часов, предпочтительно, однако, оставлять фазы стоять на 20-90 мин. После разделения водной и органической фаз водную фазу отделяют и направляют на хранение для последующего применения или переработки, а органическую фазу направляют в отходы.

После отделения органической фазы от водной на стадии (в) получают содержащую природную смесь конъюгированных эстрогенов водную фазу. Эта водная фаза содержит входящую в состав МЖК природную смесь конъюгированных эстрогенов наряду с исключительно малым количеством неконъюгированных липофильных компонентов, исходно содержащихся в МЖК или в заранее подготовленных концентратах МЖК. Эту водную фазу можно при необходимости подвергать известным методом дальнейшему сгущению для получения концентрата, из которого практически полностью удален органический растворитель и который пригоден для последующей переработки. Так, например, из полученной водной фазы отгонкой можно удалять все еще присутствующие в ней остатки органического растворителя. Перегонка позволяет также довести содержание сухого вещества в водном экстракте до некоторого конкретного значения, предпочтительно до 5-15%, прежде всего до 9%. В завершение для стабилизации полученной природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов значение рН водного экстракта (раствора) можно установить на щелочное, предпочтительно на величину в интервале от 8 до 13, более предпочтительно от 9 до 12. Для подобного регулирования значения рН пригодны обычно применяемые в этих целях основания, например, 1 н. NaOH или Na₂СО₃.

Водную фазу, полученную на стадии (в) предлагаемого в изобретении способа и при необходимости дополнительно подвергнутую дальнейшей переработке или концентрированию, можно использовать в качестве исходного материала для получения лекарственных средств, содержащих природную смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов. При необходимости соответствующим методом сушки, например, распылительной сушкой, можно получать не содержащую элюент смесь твердых веществ. Если природная смесь конъюгированных эстрогенов должна использоваться для получения твердой лекарственной формы, может оказаться целесообразным примешивать к содержащей конъюгированные эстрогены водной фазе твердый носитель еще до ее концентрирования или сушки для получения таким путем содержащей конъюгированные эстрогены и носители смеси твердых веществ. Содержащую смесь эстрогенов водную фазу, равно как и полученный из нее концентрат или высушенный твердый продукт, можно по известной технологии перерабатывать в твердые или жидкие галеновы препараты, такие, например, как таблетки, драже, капсулы или эмульсии. Такие галеновы препараты можно изготавливать известными методами с применением обычных твердых или жидких носителей, таких, например, как крахмал, целлюлоза, лактоза или тальк либо жидкие парафины, и/или с применением обычных фармацевтических вспомогательных веществ, например, разрыхлителей для таблеток, гидротропных солюбилизаторов или консервантов. Так, в частности, содержащий конъюгированные эстрогены продукт можно известным методом смешивать с фармацевтическими носителями и вспомогательными веществами и переводить полученную смесь в требуемую лекарственную форму.

При предлагаемой в изобретении и описанной выше жидкостно-жидкостной экстракции из водной исходной фазы, которая может представлять собой либо водный раствор уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл, либо водный концентрат уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл, либо концентрат жидкой мочи, либо концентрат мочи, необязательно подвергнутый предварительной очистке путем фильтрации, простым путем удаляется большинство неконъюгированных липофильных соединений. К таким отделенным неконъюгированным липофильным соединениям относятся прежде всего неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды и неконъюгированные стероиды, а среди них - главным образом неконъюгированные андростановые и неконъюгированные прегнановые производные.

По сравнению с классическими методами жидкостно-жидкостной экстракции при осуществлении предлагаемого в изобретении способа органические растворители используются в меньших объемах, поскольку в качестве водной исходной фазы всегда применяется концентрат исходной МЖК. Если в качестве водной исходной фазы на предлагаемой в изобретении стадии жидкостно-жидкостной экстракции используют, например, водный концентрат, полученный описанным в заявке WO 98/08526 способом, то вместо 5000 л МЖК экстракции подвергают лишь около 35 л концентрата с использованием соответственно меньших количеств органических растворителей.

Использование в качестве водной исходной фазы на предлагаемой в изобретении стадии жидкостно-жидкостной экстракции водного раствора уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл или водного концентрата уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл позволяет получать в качестве экстрагированного действующего вещества обедненную неконъюгированными липофильными компонентами и фенольными компонентами мочи природную смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов, которая, как было установлено при создании изобретения, обладает оптимальным набором свойств, в гораздо большей степени отвечающих требованиям фармацевтических спецификаций. Так, в частности, жидкостно-жидкостная экстракция позволяет на 8-20% увеличить относительное содержание конъюгированных лошадиных эстрогенов в сухом веществе без сколько-нибудь существенной их потери в процессе экстракции. В соответствии с этим получаемая на стадии (в) водная фаза, которая содержит природную смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов, имеет по сравнению с получаемой известными из уровня техники методами смесью конъюгированных лошадиных эстрогенов оптимизированный состав и более высокое в пересчете на массу сухого вещества общее содержание гормонов. Тем самым предлагаемый в изобретении способ позволяет получать продукт гораздо более высокого качества с точки зрения, например, его состава и содержания в нем действующего вещества.

Как особенно неожиданный следует отметить тот установленный согласно изобретению факт, что кажущийся простым метод жидкостно-жидкостной экстракции водного раствора или концентрата обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из содержащей неконъюгированные липофильные компоненты в различных и переменных количествах мочи жеребых кобыл способствует повышению качества получаемого экстрагированного действующего вещества. Наиболее неожиданным является прежде всего тот факт, что предлагаемый в изобретении подход позволяет эффективно снижать долю неконъюгированных липофильных соединений, содержание и состав которых могут колебаться в широких пределах в зависимости от используемой для переработки МЖК, и получать в результате на стадии (в) в качестве водной фазы смесь природных конъюгированных лошадиных эстрогенов, которая отвечает высоким требованиям фармацевтических спецификаций, например, требованиям фармакопеи США или европейской фармакопеи.

Как особенно неожиданный следует отметить и тот установленный согласно изобретению факт, что в процессе предлагаемой в изобретении экстракции происходит отделение даже тех неконъюгированных липофильных соединений, таких, например, как антивспениватели, которые ранее добавлялись к МЖК в качестве вспомогательных веществ на предшествующих технологических стадиях, например, при получении концентрата.

Еще одно преимущество предлагаемого в изобретении способа состоит в значительном упрощении и облегчении последующей переработки полученного экстрагированного концентрата в виде обедненной неконъюгированными липофильными соединениями природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов и его перевода в галенову форму. Полученное предлагаемым в изобретении способом экстрагированное действующее вещество неожиданно отличается исключительно хорошим поведением при сушке, получаемое в результате которой твердое вещество, в свою очередь, обладает исключительно высокой подвижностью (или сыпучестью). Так, например, полученный предлагаемым в изобретении способом экстрагированный концентрат гораздо легче наноситься на носитель, чем не экстрагированный раствор. Помимо этого упрощается и воспроизводимое регулирование концентрации действующего вещества.

Предлагаемый в изобретении способ обладает, как уже подробно описывалось выше, целым рядом преимуществ перед известными из уровня техники способами. Так, в частности, предлагаемым в изобретении способом можно перерабатывать также содержащую неконъюгированные липофильные компоненты в варьирующихся количествах МЖК, в которой допустимо, например, повышенное относительное содержание свободных флавоноидов, свободных изофлавоноидов, свободных норизопреноидов или свободных стероидных производных, в данном случае прежде всего свободных андростановых или прегнановых стероидов, без ущерба для обязательного соответствия получаемого продукта фармацевтическим спецификациям. Предлагаемый в изобретении способ обеспечивает сбалансированность состава отдельных партий экстракта благодаря неизменному удалению неконъюгированных липофильных компонентов, содержание и состав которых в МЖК может варьироваться в зависимости от типа потребляемого жеребыми кобылами корма, и получение экстрактов со сопоставимым во всех них содержанием конъюгированных лошадиных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества. Помимо этого обеспечиваемое предлагаемым в изобретении способом целенаправленное отделение неконъюгированных липофильных компонентов позволяет повысить концентрацию действующих веществ, т.е. конъюгированных лошадиных эстрогенов, в получаемом экстракте. Предлагаемый в изобретении способ дополнительно обладает и целым рядом экономических преимуществ, достигаемых благодаря значительному снижению опасности потери ценных действующих веществ из-за несоответствия получаемого продукта фармацевтическим спецификациям, например, из-за недостаточного содержания в нем конъюгированных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества. Предлагаемый в изобретении способ позволяет, кроме того, существенно повысить точность и воспроизводимость регулирования концентрации действующего вещества в получаемом экстракте. Предлагаемый в изобретении способ позволяет далее получать действующее вещество более высокого качества с повышенным в пересчете на содержание сухого вещества содержанием гормонов. Такое действующее вещество наиболее пригодно для получения на его основе фармацевтических препаратов, содержащих в качестве такового смесь природных конъюгированных лошадиных эстрогенов.

Ниже изобретение более подробно рассмотрено на примерах, которые, однако, не ограничивают его объем.

Примеры

В последующих примерах рассмотрена общая методика выделения экстрактов из МЖК, которые содержат в качестве действующего вещества природную смесь содержащихся в МЖК конъюгированных эстрогенов и которые в значительной степени обеднены неконъюгированными липофильными соединениями, такими, например, как неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды, неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и сопоставимые с ними неконъюгированные соединения. В этих примерах описывается, каким образом согласно изобретению даже из МЖК с возможно варьирующимся, соответственно повышенным относительным содержанием в ней неконъюгированных липофильных соединений можно получить качественный экстракт с высоким содержанием в нем действующего вещества.

Экстракция водного концентрата уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл

В качестве водной исходной фазы используют взятый в количестве 35,3 кг (пример 1) или 26,7 кг (пример 2) водный концентрат уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл, полученный описанным в WO 98/08526 способом из примерно 5000 л МЖК (содержание сухого вещества (СВ), а также определенное с помощью ЖХВР и ГХ содержание конъюгированных эстрогенов, например, сульфата эстрона, и неконъюгированных липофильных соединений, например, формононетина, в различных партиях подвергнутого переработке водного концентрата указаны в приведенной ниже таблице). Этот водный концентрат мешалкой перемешивают в чане из высококачественной стали при значении рН, которое устанавливают примерно на 5,0 с помощью 1 н. H₂SO₄. Полученный раствор смешивают в смесителе-отстойнике с этиловым эфиром уксусной кислоты (ЭА, данные о количестве см. в приведенной ниже таблице) в соотношении между водной фазой и органической фазой, равном 10:8, и интенсивно перемешивают в течение примерно 15 мин. После этого смесь оставляют стоять примерно на 90 мин для разделения фаз. Затем фазы отделяют одна от другой, после чего водную фазу вновь смешивают с этиловым эфиром уксусной кислоты (ЭА, данные о количестве см. в приведенной ниже таблице) в соотношении между водной фазой и органической фазой, равном 10:2, и перемешивают в течение 15 мин. По завершении процесса экстракции смесь оставляют стоять примерно на 30 мин для разделения фаз. После отделения органической фазы водную фазу помещают в реактор. Из водной фазы отгонкой при нормальном давлении удаляют все еще присутствующие в ней остатки этилового эфира уксусной кислоты. Путем такой перегонки содержание сухого вещества доводят примерно до 9%. После этого значение рН раствора устанавливают примерно на 11,0 добавлением 1 н. NaOH или Na₂CO₃. Содержание конъюгированных эстрогенов в полученной таким путем водной фазе-экстракте проверяют с помощью аналитической ЖХВР и ГХ (содержание сухого вещества (СВ), а также определенное с помощью ЖХВР и ГХ содержание конъюгированных эстрогенов, например сульфата эстрона, и неконъюгированных липофильных соединений, например формононетина, в различных партиях подвергнутого переработке водного концентрата указаны в приведенной ниже таблице). Соотношение между индивидуальными гормональными компонентами, т.е. относительное содержание сульфата эстрона, сульфата эквилина и сульфата 17-альфа-DH-эквилина в смеси конъюгированных эстрогенов, может варьироваться в отдельных партиях подвергаемого переработке концентрата из-за естественных колебаний количества этих гормонов в МЖК. Целенаправленным смешением между собой отдельных партий подвергаемого переработке концентрата в определенных пропорциях соотношение между индивидуальными гормональными компонентами можно отрегулировать на требуемое.

Таблица.

 Пример 1Пример 2Содержание [мг/г]Кол-во [г]Мас.% СВСодержание [мг/г]Кол-во [г]Мас.% СВВодный исходный концентрат 35300  26700 Сухое вещество (мас.%)(9,8)3495 (9,4)2510 Конъюгированные эстрогены (всего)26,292426,725,868827,4сульфат эстрона12,243112,416,945218,0сульфат эквилина9,33289,55,81566,2сульфат 17-альфа-DH-эквилина4,71664,83,0803,2Формононетин0,175,90,170,328,40,341-я экстракция ЭА (этилацетатом) 25400  19400 2-я экстракция ЭА (этилацетатом) 6400  4900 Полученная водная фаза-экстракт  34000  23500 Сухое вещество (мас.%)(8,9)3026 (8,9)2092 Конъюгированные эстрогены (всего)26,389629,627,965631,4сульфат эстрона12,442013,918,543420,8сульфат эквилина9,331710,56,31477,0сульфат 17-альфа-DH-эквилина4,61585,23,2753,6Формононетин000000

В качестве водной исходной фазы при экстракции этим методом можно аналогичным образом вместо водного концентрата уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл использовать либо концентрат жидкой мочи, либо концентрат мочи, необязательно подвергнутый предварительной очистке путем фильтрации, либо водный раствор уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл.

Изобретение относится к способу получения содержащего природную смесь конъюгированных лошадиных эстрогенов экстракта. Для этого водную исходную фазу выбирают из группы, включающей: водный раствор уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл; водный концентрат уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл; концентрат жидкой мочи, полученный путем сгущения; и концентрированный ретентат мочи. Любую из указанных водных фаз подвергают жидкостно-жидкостной экстракции. При этом используют экстрагент, который представляет собой пригодный для данной экстракции, не смешивающийся или практически не смешивающийся с водой органический растворитель. Изобретение позволяет получить экстракт со значительно высоким содержанием в нем указанных эстрогенов в пересчете на массу сухого вещества. При этом получаемая смесь обеднена неконъюгированными липофильными соединениями. 10 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ выделения природной смеси конъюгированных лошадиных эстрогенов из мочи жеребых кобыл, отличающийся тем, что получаемая им смесь обеднена неконъюгированными липофильными соединениями из группы, включающей неконъюгированные флавоноиды, неконъюгированные изофлавоноиды, неконъюгированные норизопреноиды, неконъюгированные стероиды, прежде всего андростановые и прегнановые стероиды, и сопоставимые с ними неконъюгированные соединения, а также тем, что

а) водную исходную фазу, выбранную из группы, включающей

(1) водный раствор уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл,

(2) водный концентрат уже обедненной фенольными компонентами мочи природной смеси конъюгированных эстрогенов из мочи жеребых кобыл,

(3) полученный путем сгущения концентрат жидкой мочи и

(4) очищенный от твердых примесей и слизи методами механического разделения концентрат мочи или полученный путем мембранной фильтрации концентрированный ретентат мочи, подвергают жидкостно-жидкостной экстракции достаточным количеством экстрагента, который представляет собой пригодный для экстракции неконъюгированных липофильных соединений из указанной выше группы, не смешивающийся или практически не смешивающийся с водой органический растворитель, выбранный из группы, включающей прямоцепные, разветвленные и циклические спирты с С₄-С₁₀, эфиры кислот с С₂-С₁₀, альдегиды с С₃-С₁₀, кетоны с С₄-С₁₀, простые эфиры с С₂-С₁₀, нитрилы с С₃-С₆ и галоалканы с C₁-С₃, а также смеси вышеуказанных растворителей, с последующим отделением водной фазы, и,

причем объемное соотношение между водной исходной фазой и экстрагентом лежит в интервале от 10:1 до 1:10, и,

в) получают содержащую природную смесь конъюгированных эстрогенов водную фазу.