ПРОТОЧНО-АЭРОЗОЛЬНО-ЦИТОХИМИЧЕСКИЙ СПОСОБ УСЛОВНОЙ ГРУППОВОЙ ИНДИКАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ КОНТАМИНАНТОВ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к индикации микроорганизмов, в частности к экспресс-способам установления условной групповой принадлежности биологических контаминантов (дифференциация их на бактерии, отдельно вегетативная и споровая формы, риккетсии, вирусы, бактериальные токсины) с использованием проточно-оптических систем регистрации сигналов светорассеяния и люминесценции аэрозоля, образованного путем диспергирования люминесцентно маркированной пробы.

В настоящее время требуются быстрые способы детектирования и отнесения (идентификации) биологических контаминантов к бактериям (отдельно вегетативная и споровая формы), токсическим продуктам их жизнедеятельности, риккетсиям, вирусам (отдельно ДНК- и РНК-содержащим) не только при санитарно-эпидемиологическом и экологическом мониторинге окружающей среды, но и для оценки статуса биологически опасных объектов. Существуют различные способы для решения этой задачи: культивирование микроорганизмов на селективных питательных средах, в культуре клеток и в организме животных, использование микроскопии, различных иммунологических, молекулярно-генетических и токсинологических методов. Однако нет способов, которые позволяли бы проводить экспресс-дифференциацию низких концентраций биологических контаминантов в пробе с высокой чувствительностью и избирательностью в отношении фоновых примесей окружающей среды.

Известен способ обнаружения и идентификации микроорганизмов в биологических жидкостях (патент США №5366858, кл. НКИ 435-5). Способ основан на проведении реакции специфического связывания искомого микроорганизма с компонентами аналитической системы, облучении исследуемого образца возбуждающим источником света, измерении оптической реакции частиц в образце на облучение и сравнении статистических данных измеренных значений со статистическими данными контрольного образца без искомого микроорганизма, о наличии которого судят по превышению измеренных сигналов над контрольными. Измерение сигналов осуществляют методом проточной цитометрии, при этом на выходе измерительного устройства получают интегральный сигнал от совокупности клеток, составляющих пробу.

Недостатком указанного способа, основанного на использовании в качестве носителя в проточно-цитометрическом методе водных растворов, является невозможность обнаружения водорастворимых белков, включая факторы патогенности, обладающие токсической функцией, мелких бактерий и вирусов, малая помехозащищенность анализа в присутствии растворимых и нерастворимых мешающих примесей, которые могут присутствовать в пробе.

Известен способ быстрой идентификации микроорганизмов (а.с. СССР №1198952, кл. МКИ С12Q 1/04). Сущность изобретения сводится к измерению спектра фосфоресценции при возбуждении в видимой и(или) ультрафиолетовой областях спектра. Дифференциация микроорганизмов осуществляется по положению максимумов интенсивностей длительной люминесценции и их соотношения при различных длинах волн.

Способ не может быть использован для высокочувствительного обнаружения и условной групповой идентификации микроорганизмов, поскольку проведение анализа возможно только при наличии взвеси бактериальных культур с концентрацией порядка 10 млрд/мл.

Наиболее близкими по технической сущности и достигаемому результату являются способ и устройство для определения присутствия и/или количества микроорганизмов в газовой среде (патент Великобритания, США №5,918,259 МКИ С12Q 001/06, С12Q 001/24). Способ позволяет определять вероятность присутствия патогенного материала в реальном масштабе времени путем измерения АТФ или аденил-киназы в пробе, содержащей лизат клеток. Сущность способа заключается в том, что отобранный из воздуха аэрозоль респирабельной фракции переводится во взвешенное состояние. Из клеточного материала, содержащегося в пробе, выделяется АТФ путем добавления литического агента (детергента и/или фермента). Выделяющийся из клеточного материала АТФ индицируется люминесцентным методом в реакции с люциферазой. Для дифференциации бактерий от эукариотических клеток пробу делят на две части, в каждую из которых добавляют соответствующий литический агент. Например, для выделения АТФ из эукариотических клеток добавляют неионный детергент. Катионный детергент обеспечивает выделение АТФ как из про-, так и эукариотических клеток. Путем вычитания сигнала, зарегистрированного в потоке пробы, обработанной неионным детергентом, из сигнала от пробы, обработанной катионным детергентом, определяют количественное содержание бактерий в пробе.

Способ предназначен для дифференциации бактерий, их спор и эукаритических клеток в дискретных пробах, не содержащих примеси, которые могут исказить результат анализа за счет тушения люминесценции или ингибирования ферментативного катализа, и не может быть использован для обнаружения единичных клеток микроорганизмов и вирионов и условной групповой индикации (дифференциации бактерий в вегетативной и споровой формах, их токсических продуктов жизнедеятельности, риккетсий, ДНК- и РНК-содержащих вирусов) в пробах, содержащих мешающие примеси.

Задачей является создание экспресс-способа условной групповой индикации единичных клеток бактерий (вегетативная и споровая формы), риккетсий и вирионов, а также токсинов белковой природы в образце в присутствии органических и неорганических мешающих примесей, содержащихся в пробе.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является увеличение аналитического эффекта за счет выявления двух и более мишеней (гетерополимеров белковой, нуклеиновой, полисахаридной и иной природы) биологических контаминантов и многопараметрической регистрации оптических параметров (рассеяние и люминесценция) при улучшенной разнице коэффициента преломления носителя (воздух вместо жидкости) и аналита (аэрозольная частица, содержащая биологический контаминант, вместо взвеси микроорганизмов), что позволяет обеспечить условную групповую индикацию бактерий (вегетативная и споровая формы), риккетсий, вирионов, а также водорастворимых белков при низких концентрациях и контролировать уровень биологической контаминации окружающей среды с пределом обнаружения 30-100 частиц.

Технический результат достигается предлагаемым изобретением.

Сущность изобретения заключается в том, что в проточно-аэрозольно-цитохимическом способе групповой экспресс-индикации биологических контаминантов, включающем деление отобранной из воздуха пробы на три части и внесение реагентов, при этом в первую часть вносят производное нафталино сульфонатного красителя в полярном растворителе, во вторую часть - бисбензимидазольное производное в полярном растворителе и в третью часть - производное фуранового ряда в неполярном органическом растворителе с последующей проточно-оптической регистрацией интенсивности светорассеяния и люминесценции частиц аэрозоля, образовавшегося после диспергирования каждой части пробы и определением условной групповой принадлежности биологических контаминантов путем вычисления и сравнения соотношений статистических значений, характеризующих координаты центра рассеяния совокупности зарегистрированных величин светорассеяния и люминесценции частиц аэрозоля, средние значения большой и малой осей эллипса рассеяния, а также угол ориентации большой оси эллипса рассеяния регистрируемых признаков, относительно ординаты.

Авторам не известны технические решения, имеющие совокупность признаков, аналогичную заявляемой. Следовательно, предлагаемое решение отвечает критерию новизны.

От прототипа предлагаемое изобретение отличается новыми признаками и новой их совокупностью. При низких концентрациях искомого аналита в пробе для его обнаружения и дифференциации большое значение имеет отношение сигнала к фону. При измерении сигнала люминесценции метки, связанной с аналитом, непосредственно после люминесцентного окрашивания на величину полезного сигнала оказывает разница коэффициента преломления аналита и носителя. Аэрозолирование флуорохромированной пробы с заменой растворителя (жидкость) на дисперсную среду (воздух) увеличивает показатель преломления аналита. Операция диспергирования позволяет удалить вместе с растворителем, высыхающим за время пролета аэрозоля до анализируемого объема проточной камеры, растворенные в нем мешающие примеси или уменьшить размеры частиц, не содержащих корпускулярные формы аналита, до неконтролируемых детектирующим устройством. Кроме того, образующийся при диспергировании белков аэрозоль дает возможность регистрировать оптические параметры частиц, образованных водорастворимыми токсическими продуктами жизнедеятельности бактерий (токсины). Фокусирование возбуждающего излучения высокой интенсивности в анализируемом объеме позволяет получить оптимальное соотношение сигнала к фону при регистрации светорассеяния и люминесценции аэрозольных частиц. Вся совокупность признаков позволяет получить такое соотношение сигнала к фону, что становятся возможными обнаружение и идентификация единичных микроорганизмов, вирионов и частиц, образованных водорастворимыми белками, и их количественная оценка в искомом материале. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию уровня техники.

Изобретение найдет широкое применение в санитарии, медицинской диагностике, пищевой и медицинской промышленности, а также в специальных лабораториях, расследующих террористические акты в случаях, когда возникает необходимость оценки уровня биологической контаминации объектов окружающей среды и т.п. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию промышленной применимости.

Способ осуществляется следующим образом.

Взвесь пробы делят на две или три части, в каждую из которых вносят один из индикаторных реактивов, содержащих люминесцентный маркер. В качестве индикаторных реактивов используют растворы люминесцентных зондов, взаимодействующих с гидрофобными группами белков и гидрофобными участками мембран, нуклеиновыми кислотами, и флуорохромы-метчики, ковалентно связывающиеся с концевыми аминогруппами белков, соответственно, 1,8-анилино-нафталиносульфонат (1,8 АНС), 2-[2-(4этоксифенил)6-бензимидазоил]-6-(4-метил-1-пиперазинил)-бензимидазол (бисбензимид Н 33342) и 4-фенилпиро-(фуран-2,1'-фталан)-3,3'-дион (флуорескамин, ФСК). При флуорохромировании проб используют индикаторные реактивы, содержащие 1,8 АНС, бисбензимид Н 33342 и ФСК концентрации 0,1; 0,02; 0,06 мг-мл^-1 соответственно. При этом соотношение проба/индикаторный реактив (по объему) составляет 9/1. Выбор указанных маркеров и их оптимальных концентраций осуществлен по наибольшему значению отношения интенсивности люминесценции пробы к фону. В табл. 1 и 2 представлены экспериментальные данные, подтверждающие выбор оптимального состава индикаторных реактивов.

Каждую пробу после добавления к ней соответствующего индикаторного реактива диспергируют с помощью генератора, обеспечивающего создание аэрозоля респирабельной фракции, и регистрируют рассеяние и люминесценцию каждой частицы, поступающей в проточную камеру регистрирующего устройства. Параметры интенсивностей люминесценции, регистрируемых на двух дискретных длинах волн, отображаются в виде областей распределения частиц в пространстве регистрируемых признаков, ограниченных двумерной системой координат I_λ1 и I_λ2, аппроксимируемых эллипсом рассеяния (фиг.1). Сканирование оптических параметров аэрозольных частиц осуществляют до набора статистически значимого количества откликов, позволяющего рассчитать параметры эллипса рассеяния с достоверностью не менее 0,95 (координаты центра рассеяния совокупности зарегистрированных откликов частиц m_x и m_y, средние значения большой и малой осей эллипса рассеяния b_x и b_y, а также угол ориентации большой оси эллипса рассеяния, относительно ординаты (ϕ)). Значения областей индикации для каждого маркера и условной таксономической группы биологических поражающих агентов приведены в табл.3 и в виде лепестковых диаграмм - на фиг.2-7 (1-5 луч диаграммы - характеристики эллипса рассеяния частиц, маркированных 1,8 АНС, 6-10 лучи диаграммы - характеристики эллипса рассеяния частиц, маркированных ФСК, 11-15 лучи диаграммы - характеристики эллипса рассеяния частиц, маркированных Н 33342). При соответствии полученных данных параметров эллипсов рассеяния проанализированных маркированных проб с индикационными признаками диаграмм содержащиеся в пробе микроорганизмы причисляют к одной из условных таксономических групп микроорганизмов.

Ниже приведены примеры условной групповой индикации клеток микроорганизмов и вирионов при анализе 100-1000 частиц.

Пример 1. Установление условной групповой принадлежности микроорганизмов и вирионов

Поступающую на анализ пробу в виде взвеси в 0,01 М солевом буферном растворе, рН 7,0-7,4 разделяют на три части. В одну часть пробы добавляют 0,1 мг·мл^-1 водного раствора 1,8 АНС, в другую - 0,02 мг·мл^-1 водного раствора бисбензимида Н 33342 и в третью 0,06 мг·мл⁴ ацетонового раствора ФСК до соотношения проба/индикаторный реактив (по объему) 9/1. Затем последовательно каждую часть маркированной пробы помещают в стакан аэрозольного генератора и диспергируют. Образующийся аэрозоль направляют в измерительную проточную камеру, в которой каждая частица пересекает область сфокусированного возбуждающего света с длиной волны 360 нм. Возникающая люминесценция регистрируется на двух длинах волн 460 и 540 нм. Результаты измерения оцифровываются и фиксируются в виде реализации регистрируемых признаков в двумерной системе координат, аппроксимируемых эллипсом рассеяния регистрируемых признаков. Данные эксперимента приведены в табл.4-6. В представленном примере видно, что параметрические характеристики эллипсов рассеяния регистрируемых признаков диспергированных маркированных проб позволяют определить принадлежность исследуемых микроорганизмов к одной из условных таксономических групп (бактерии вегетативная и споровая формы, риккетсии, вирусы, отдельно ДНК- и РНК-содержащие, бактериальные токсины).

Пример 2. Установление условной групповой принадлежности микроорганизмов и вирионов в присутствии мешающих примесей

Учитывая возможное присутствие в реальных пробах, в том числе и отбираемых из воздуха, примесных включений, определена помехозащищенность анализа при индивидуальном и совместном присутствии в пробе мешающих примесей и индицируемого аналита. Из представленного примера видно (табл.7 и 8), что при индивидуальном присутствии мешающие примеси не вызывают ложного срабатывания, поскольку количество реализации в областях индикации практически соответствуют фону (табл.7). При совместном присутствии мешающие примеси не мешают анализу предлагаемым способом (табл.8).

Отсутствие значимого влияния мешающих примесей на аналитические характеристики маркированных микроорганизмов позволило установить пороговую чувствительность (УЕ - условные единицы биологических контаминантов, равные количеству регистрируемых частиц) предлагаемого способа, который составляет по:

вегетативным формам бактерий - 53 УЕ (время накопления информации не более 90 с);

риккетсиям - 51 УЕ (время накопления информации не более 90 с);

токсинам - 94 УЕ (время накопления информации не более 120 с);

споровым формам бактерий - 74 УЕ (время накопления информации не более 120 с);

ортопоксвирусам - 34 УЕ (время накопления информации не более 120 с);

РНК-содержащим вирусам - 31 УЕ (время накопления информации не более 120 с).

Следовательно, предлагаемый способ, базирующийся на использовании аналитических свойств индикаторных реактивов на основе 1,8 АНС, ФСК и Н 33342 и одноволновой технологии проточного анализа по совокупности данных, характеризующих эллипсы рассеяния регистрируемых признаков, позволяет осуществить групповую индикацию БПА на риккетсии и бактерии, отдельно вегетативные и споровые формы, бактериальные токсины, а также ДНК и РНК-содержащие вирусы за время не более 120 с с чувствительностью 5,1·10^-6...7,4·10^-5 мг·л^-1.

Способ найдет широкое применение в различных областях техники для экспресс-обнаружения и идентификации микроорганизмов вирионов и факторов патогенности, обладающих токсической функцией при их низкой концентрации в пробе.

Таблица 1. Зависимость отношения интенсивности люминесценции проб, содержащих взвесь регидратированной микробной массы Yersinia pestis EV, к холостой, при окрашивании люминесцентными маркерамиХимически реакционные группы и гетерополимеры микроорганизмовИндикаторные реактивы на основе*Интенсивность люминесценции, усл.ед.Отношение интенсивности люминесценции пробы к холостой (I_п/I_x)флуорохромированная проба (I_п±Δi)холостая проба (I_x±Δi)Гидрофобные группы белков и липиды1,8 АНС180±29±220,0±6,02,6 ТНС175±230±25,8±0,51,7 АНС170±240±14,3±0,2Нуклеиновые кислотыЭтидий бромид175±490±31,9±0,2Бисбензимид Н 33342195±315±213±3,3ДАФИ180±524±47,5±2,5Концевые аминогруппы белков и пептидовФлуорескамин185±417±210,8±2,2ФИТЦ190±6170±61,1±0,1ДХТАФ210±8200±71,0±0,1* 1,8 АНС - 1-анилинонафталин-8-сульфонат;
2,6 ТНС - 2-толуидинонафталин-6-сульфонат;
1,7 АНС - 1-анилинонафталин-7-сульфонат;
Этидий бромид - 2,7-диамидино-10-этил-9-фенилфенантридий бромид;
Бисбензимид Н33342 - 2-[2-(4-этоксифенил)6-бензимидазоил]-6-(4-метил-1-пиперазинил)-бензимидазол;
ДАФИ - 4,6-диамидино-2-фенилиндол;
Флуорескамин - 4-фенилпиро-(фуран-2,1'-фталан)-33'-дион;
ФИТЦ - флуоресцеинизотиоционат;
ДХТАФ - дихлортриазиниламинофлуоресцеин

Таблица 2. Соотношение интенсивностей полезного и фонового сигналов от концентрации люминесцентных маркеров в индикаторном реактивеКонцентрации индикаторных реактивов на основе, мг/мл:Интенсивность люминесценции, усл.ед.Среднее отношение интенсивности люминесценции пробы к холостой (I_п/I_х)флуорохромированная проба (I_п±Δi)холостая проба (I_x±Δi)1,8 АНС0,02570±35±1140,05100±35±2250,075135±38±2170,1180±29±2200,125185±540±350,15200±6105±62Флуорескамин0,0250±210±250,0485±315±260,06185±417±2110,08200±540±340,1205±565±53Бисбензимид Н 333420,002570±37±2100,005110±39±2120,0075150±313±3120,01195±515±3130,0125201±550±540,015210±6105±72

Таблица 3. Параметрические характеристики эллипсов рассеяния условных таксономических групп микроорганизмовНаименование объекта индикацииПараметрические характеристики эллипсов рассеяния частиц диспергированных проб, окрашенных индикаторным реактивом на основеm_xm_уb_xb_yϕ1,8 АНСБактерии (вегетативная форма)165,7±0,16145,7±0,336,4±0,613,4±0,2143,0±1,46Бактерии (споровая форма)80,6±0,3972,8±0,416,0±0,563,4±0,1139,6±1,21Риккетсии164,2±0,53148,7±0,567,1±0,583,8±0,3144,8±1,14Бактериальные токсины-----ДНК-вирусы97,3±0,6494,4±0,296,8±0,823,7±0,4340,4±1,10РНК-вирусы95,8±0,5893,7±0,367,0±0,513,9±0,5640,9±1,21 ФСКБактерии (вегетативная форма)171,2±0,22165,2±0,8118,3±0,5413,0±0,2042,5±1,71Бактерии (споровая форма)69,6±0,7161,4±0,3621,2±0,2411,7±0,6840,0±1,74Риккетсии169,2±0,53160,7±0,5616,0±0,2812,8±0,3143,8±1,26Бактериальные токсины180,1±0,81170,1±0,4220,2±0,4216,4±0,5344,1±1,08ДНК-вирусы169,7±0,43158,8±0,4615,9±0,4812,7±0,4742,9±1,31РНК-вирусы168,8±0,29163,5±0,4817,2±0,1813,3±0,4242,7±1,43 Н 33342Бактерии (вегетативная форма)196,8±0,26190,7±0,4615,4±0,618,4±0,2143,0±1,60Бактерии (споровая форма)62,8±0,5860,1±0,4620,0±0,479,6±0,7140,0±1,74Риккетсии169,2±0,53162,7±0,5614,0±0,288,8±0,3143,8±1,26Бактериальные токсины-----ДНК-вирусы198,8±0,82188,7±0,4116,0±0,419,2±0,3641,9±1,21РНК-вирусы51,8±0,2950,1±0,6419,2±0,719,3±0,4938,0±1,70

Таблица 4. Характеристики эллипсов рассеяния частиц, полученных при диспергировании проб, маркированных 1,8 АНСНаименование объекта индикацииПараметрические характеристики эллипсов рассеяния частиц диспергированных проб, окрашенных индикаторным реактивом на основе 1,8 АНСm_xm_yb_xb_yϕYersinia pestis EV (регидратированная)165,7±0,16145,7±0,336,4±0,613,4±0,2143,0±1,46Yersinia pestis EV (двухсуточная культура)164,4±0,21144,8±0,516,5±0,623,5±0,2342,5±1,21Esherichia coli К-12162,9±0,18143,9±0,727,0±0,413,6±0,3742,5±1,10Francisella tularensis 15 НИИЭГ160,2±0,21144,8±0,396,2±0,213,2±0,2042,0±1,57Brucella abortus 19-BA164,4±0,41150,9±0,426,5±0,443,4±0,4842,8±1,21Bacillus anthracis СТИ-1
Staphylococcus aureus 50580,6±0,39
162,6±,7172,8±0,41
144,8±0,296,0±0,56
6,5±0,523,4±0,11
3,6±0,3439,6±1,21
42,7±1,02Coxiella burnetii M-44164,2±0,53148,7±0,567,1±0,583,8±0,3144,8±1,14Вакцина Variola vera97,3±0,6494,4±0,296,8±0,823,7±0,4340,4±1,10Вакцина ВЭЛ95,8±0,5893,7±0,367,0±0,513,9±0,5640,9±1,21Стафилококковый анатоксин-----Ботулинический анатоксин-----Имитатор, моделирующий жидкую вирусную рецептуру99,5±0,2693,0±0,406,5±0,343,0±0,2541,5±1,93Имитатор, моделирующий рецептуру на основе вегетативных форм бактерий168,6±0,81153,8±0,415,9±0,743,4±0,3241,9±1,23Имитатор, моделирующий рецептуру на основе споровых форм бактерий77,8±0,7270,7±0,475,8±0,473,6±0,4137,4±1,14Холостая проба25,5±0,1829,1±0,415,2±0,122,8±0,2021,5±1,0Примечание: ″-″ за вычетом холостой пробы

Таблица 5. Характеристики эллипсов рассеяния частиц, полученных при диспергировании проб, маркированных Н 33342Наименование объекта индикацииПараметрические характеристики эллипсов рассеяния частиц диспергированных проб, окрашенных индикаторным реактивом на основе Н 33342m_xm_уb_xb_yϕYersinia pestis EV (регидратированная)196,8±0,26190,7±0,4615,4±0,618,4±0,2143,0±1,60Yersinia pestis EV (двухсуточная культура)194,9±0,22189,9±0,8616,0±0,618,5±0,2342,5±1,81Esherichia coli К-12195,2±0,28189,8±0,5215,8±0,299,0±0,3242,8±1,12Francisella tularensis 15 НИИЭГ190,3±0,18183,8±0,4113,2±0,426,5±0,2244,0±1,43Bacillus anthracis СТИ-162,8±0,5860,1±0,4620,0±0,479,6±0,7140,0±1,74Brucella abortus 19-BA191,4±0,41179,9±0,7215,1±0,246,4±0,8742,8±1,32Staphylococcus aureus 505194,6±0,22189,8±0,3615,8±0,429,0±0,4542,4±1,32Coxiella burnetii M-44169,2±0,53162,7±0,5614,0±0,288,8±0,3143,8±1,26Вакцина Variola vera198,8±0,82188,7±0,4116,0±0,419,2±0,3641,9±1,21Вакцина ВЭЛ51,8±0,2950,1±0,6419,2±0,719,3±0,4938,0±1,70Стафилококковый анатоксин-----Ботулинический анатоксин-----Имитатор, моделирующий жидкую вирусную рецептуру49,8±0,4251,8±0,2618,5±0,4710,1±0,7437,9±1,25Имитатор, моделирующий рецептуру на основе вегетативных форм бактерий190,6±0,75187,8±0,7816,9±0,459,2±0,2541,7±1,31Имитатор, моделирующий рецептуру на основе споровых форм бактерий70,8±0,7867,7±0,4721,8±0,4210,6±0,1140,4±1,14Холостая проба17,2±0,8614,8±2,344,3±1,123,8±2,7018,9±2,80

Таблица 6. Характеристики эллипсов рассеяния частиц, полученных при диспергировании проб, маркированных ФСКНаименование объекта индикацииПараметрические характеристики эллипсов рассеяния частиц диспергированных проб, окрашенных индикаторным реактивом на основе ФСКm_xm_уb_xb_yϕYersinia pestis EV (регидратированная)170,8±0,26164,7±0,4618,4±0,6112,4±0,2143,0±1,60Yersinia pestis EV (двухсуточная культура) Esherichia coli К-12171,2±0,22165,2±0,8118,3±0,5413,0±0,2042,5±1,71172,0±0,34167,9±0,5719,2±0,5613,0±0,3842,8±1,24Francisella tularensis 15 НИИЭГ171,3±0,18163,8±0,4117,2±0,4211,5±0,2244,0±1,43Brucella abortus 19-BA171,4±0,41161,9±0,7215,1±0,2410,9±0,8742,8±1,32Bacillus anthracis СТИ-169,6±0,7161,4±0,3621,2±0,2411,7±0,6840,0±1,74Staphylococcus aureus 505170,6±0,53165,8±0,3617,8±0,4213,0±0,5442,4±1,24Coxiella burnetii M-44169,2±0,53160,7±0,5616,0±0,2812,8±0,3143,8±1,26Вакцина Variola vera169,7±0,43158,8±0,4615,9±0,4812,7±0,4742,9±1,31Вакцина ВЭЛ168,8±0,29163,5±0,4817,2±0,1813,3±0,4242,7±1,43Стафилококковый анатоксин180,1±0,81170,1±0,4220,2±0,4216,4±0,5344,1±1,08Ботулинический анатоксин179,7±0,75167,5±0,4721,4±0,1216,8±0,3244,0±1,17Имитатор, моделирующий жидкую вирусную рецептуру163,6±0,78159,7±0,5616,0±0,3812,2±0,4743,8±1,26Имитатор, моделирующий рецептуру на основе вегетативных форм бактерий172,6±0,57150,8±0,8216,3±0,7113,2±0,4842,4±1,31Имитатор, моделирующий рецептуру на основе споровых форм бактерий60,8±0,7257,7±0,4222,1±0,3811,1±0,4340,4±1,14Холостая проба10,2±0,869,8±2,344,1±1,123,6±2,7018,9±2,80

Таблица 7. Реализации откликов мешающих примесей, попавших в области индикацииНаименование мешающей примесиКонцентрация мешающей примеси, мг·л^-1Общее количество зарегистрированных частиц, шт.(х·10²)Количество частиц, попавших в области индикации при маркировании пробы, шт.1,8 АНСН 33342ФСКАммиак7·10^-3220±465446Водород хлористый5·10^-3219±586348Диметиламин1·10^-3220±469312Окислы азота2·10^-3219±517433Сернистый ангидрид1·10^-2223±611316Сероводород1·10^-2221±485245Триметиламин1·10^-3216±479534Пары метанола3·10^-2218±367434Двуокись углерода2·10^-2201±518122Пары дихлорэтана1,00210±486244Соляной (морской) туман0,10641±436534Почвенная пыль0,50
0,10
0,05754±386
687±326
411±42624
20
1413
11
545
46
18Продукты сгорания топлива дизельных двигателей внутреннего сгоранияНа расстоянии 10 м от среза выхлопной трубы522±846354Холостая проба (индикаторный реактив) 218±487243

Таблица 8. Индикационные характеристики способа в присутствии мешающих примесейАнализируемая пробаКонцентрации микроорганизмов и мешающих примесей, мг·л^-1Количество частиц, попавших в области индикации при маркировании, шт.1,8 АНСН 33342ФСКYersinia pestis EV0,8·10^-3776±65776±65776±65Yersinia pestis EV + аммиак0,8·10^-5
7,0·10^-3793±48702±27779±35Yersinia pestis EV1,1·10^-5833±50833±50833±50Yersinia pestis EV + водород хлористый1,1·10^-5
5,0·10^-3798±62811±28792±37Yersinia pestis EV0,9·10^-5811±80811±80811±80Yersinia pestis EV + диметиламин0,9·10^-1
5,0·10^-3823±43776±42783±41Yersinia pestis EV1,0·10^-5819±47819±47819±47Yersinia pestis EV + сернистый ангидрид1,0·10^-5
1,0·10^-2740±39781±35787±33Yersinia pestis EV1,2·10^-5887±45887±45887±45Yersinia pestis EV + окислы азота1,2·10^-5
2,1·10^-4782±41880±39871±62Yersinia pestis EV1,4·10^-5985±42985±42985±42Yersinia pestis EV + сероводород1,4·10^-5
1,0·10^-2901±27876±43880±37Yersinia pestis EV1,2·10^-5811±35811±35811±35Yersinia pestis EV + пары метанола1,2·10^-5
3,0·10^-2842±42819±53784±36Yersinia pestis EV1,5·10^-51114±251114±251114±25Yersinia pestis EV + двуокись углерода1,5·10^-5
2,0·10^-2996±46908±68965±72Yersinia pestis EV1,1·10^-5814±28814±28814±28Yersinia pestis EV + пары дихлорэтана1,1·10^-5
1,0·10^-1789±37846±53857±43Yersinia pestis EV1,3·10^-5887±35887±35887±35Yersinia pestis EV + соляной (морской) туман1,3·10^-5
5,4·10^-2982±45892±52901±65Yersinia pestis EV1,1·10^-5854±38854±38854±38Yersinia pestis EV + почвенная пыль1,1·10^-5
5,1·10^-11014±37920±581041±65

Таблица 9. Результаты определения порога чувствительностиНаименование объекта индикацииВремя накопления до выдачи индикационного сигнала, сПорог чувствительности (среднее количество аналита, приводящее к получению аналитического эффекта), УЕ1,8 АНСН 33342ФСКYersinia pestis EV-(120)+(120)-(120)53+(90)+(90)+(90)+(90)+(30)+(60)+(30)+(15)+(15)Coxiella burnetii M-44-(120)+(120)-(120)51+(90)+(75)+(90)+(90)+(60)+(60)+(30)+(15)+(15)Стафилококковый анатоксин-(120)-(120)-(120)97-(120)-(120)-(120)-(120)-(120)+(60)-(120)-(120)+(30)Ботулинический анатоксин-(120)-(120)-(120)91-(120)-(120)-(120)-(120)-(120)+(120)-(120)-(120)+(90)Bacillus anthracis СТИ-1-(120)-(120)-(120)74-(120)-(120)-(120)+(120)+(120)+(105)+(90)+(120)+(90)Вакцина Variola vera-(120)-(120)+(120)34-(120)-(120)-(120)+(120)+(90)+(105)+(90)+(30)+(15)Вакцина ВЭЛ-(120)-(120)-(120)31-(120)-(120)+(120)-(120)-(120)+(120)+(105)-(120)+(45)Имитатор, моделирующий рецептуру на основе споровых форм бактерий-(120)-(120)-(120)82-(120)-(120)-(120)+(120)+(120)+(105)+(90)+(120)+(90)Имитатор, моделирующий рецептуру на основе вегетативных форм бактерий-(120)+(120)-(120)53+(120)+(90)+(120)+(90)+(30)+(60)+(30)+(15)+(15)

Изобретение относится к индикации микроорганизмов, в частности к экспресс-способу установления условной групповой принадлежности биологических контаминантов. Способ проводят с использованием проточно-оптических систем регистрации сигналов светорассеяния и люминесценции аэрозоля, образованного путем диспергирования люминесцентно маркированной пробы. Способ предусматривает деление отобранной из воздуха пробы на три части. В первую часть вносят производное нафталино сульфонатного красителя в полярном растворителе, во вторую часть - бисбензимидазольное производное в полярном растворителе и в третью часть - производное фуранового ряда в неполярном органическом растворителе. Определяют условно групповую принадлежность биологических контаминантов путем вычисления и сравнения соотношений статистических значений, характеризующих координаты центра рассеяния совокупности зарегистрированных величин светорассеяния и люминесценции частиц аэрозоля, средние значения большой и малой осей эллипса рассеяния, а также угол ориентации большой оси эллипса рассеяния регистрируемых признаков относительно ординаты. Способ обладает высокой чувствительностью, позволяет выявлять две и более мишени в одном исследовании за короткое время. 4 з.п. ф-лы, 7 ил., 9 табл.

1. Проточно-аэрозольно-цитохимический способ групповой экспресс-индикации биологических контаминантов, включающий деление отобранной из воздуха пробы на три части и внесение реагентов, при этом в первую часть вносят производное нафталино-сульфонатного красителя в полярном растворителе, во вторую часть - бисбензимидазольное производное в полярном растворителе и в третью часть - производное фуранового ряда в неполярном органическом растворителе с последующей проточно-оптической регистрацией интенсивности светорассеяния и люминесценции частиц аэрозоля, образовавшегося после диспергирования каждой части пробы, и определением условной групповой принадлежности биологических контаминантов путем вычисления и сравнения соотношений статистических значений, характеризующих координаты центра рассеяния совокупности зарегистрированных величин светорассеяния и люминесценции частиц аэрозоля, средние значения большой и малой осей эллипса рассеяния, а также угол ориентации большой оси эллипса рассеяния регистрируемых признаков относительно ординаты.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве производного нафталино-сульфонатного красителя используют раствор 1,8-анилино-нафталиносульфоната (1,8 АНС).3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве бисбензимидазольного производного используют 2-[2-(4-этоксифенил)6-бензимидазоил]-6-(4-метил-1-пиперазинил)-бензимидазол.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве производного фуранового ряда используют 4-фенилпиро-(фуран-2,1'-фталан)-3,3'-дион.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что регистрацию интенсивности светорассеяния частиц аэрозоля осуществляют на длине волны возбуждения люминесценции реагентов.