СПОСОБ МНОГОАНАЛИТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИКРОЧАСТИЦ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/58 G01N33/53 

Изобретение относится к иммуноанализу и может быть использовано для обнаружения и детектирования низких концентраций микроорганизмов, белков и других биологических аналитов в изолированной форме или в качестве контаминантов пищи или окружающей среды.

К методам скрининга специфических веществ, находящихся в низкой концентрации в окружающей среде (бактерии, микроорганизмы, токсины и т.п.), предъявляется ряд требований: способы должны быть простыми, быстрыми, давать однозначные результаты, быть работоспособными в жестких условиях окружающей среды, иметь необходимый уровень чувствительности и специфичности, быть пригодными для определения очень низких концентраций биологических аналитов, результаты анализа должны считываться быстро, визуально или при минимальном количестве простого оборудования. Существующие технологии бактериального детектирования нуждаются в большом количестве бактериальных клеток (10⁵-10⁸) на конечной стадии анализа перед детектированием. Увеличение количества клеток достигается лабораторными методами, включающими процедуру селективного обогащения и изолирования, и требует много времени. Для непрерывного мониторинга внешней среды (воздуха, воды, почвы) в случаях техногенных или биогенных аварий или биологического терроризма необходимо обеспечить быстрое и одновременное обнаружение низких концентраций нескольких биологических аналитов в месте контаминации.

Известны индикаторные реагенты и способы их использования (патент США №5252459, НКИ 435/6). В качестве индикаторных реагентов в изобретении используются латексные частицы со специфическими связывающими членами (биотин, авидин и др.), а в качестве иммунореагентов - различные антитела, гаптены, антигены и т.п. Способ заключается в контактировании исследуемого образца с индикаторным и связывающим реагентами, связывании индикаторного реагента с аналитом, искомым в тестируемом образце, детектировании индикаторного реагента и определении присутствия или количества аналита в образце. Способ может быть использован для визуального исследования результатов анализа клинических образцов.

Способ не может быть использован для определения низких концентраций искомых аналитов из-за недостаточной чувствительности.

Известен способ и композиции для одновременного детектирования множества аналитов в исследуемом образце (заявка РСТ №01/073443, МКИ G01N 33/58). Изобретение может быть использовано для детектирования патогенов, а также для диагностики и прогноза заболеваний. Искомые аналиты в образце детектируют и дифференцируют, используя множество флуоресцентных латексных частиц, связанных с различными связывающими молекулами, специфичными к антигенам; антигены метят вторыми флуоресцентными метками, флуоресценция которых отличается от флуоресценции латексных частиц, и детектируют образовавшиеся комплексы, содержащие флуоресцентные микрочастицы, связывающие молекулы и меченые антигены. Измерение флуоресценции частиц осуществляют путем определения отношения флуоресценции одного или более красителей. При определении множества аналитов каждая частица имеет свою отличную от других флуоресцентную ("адресную") метку, а каждый антиген метится одной и той же флуоресцентной меткой. Для детектирования антигенов предпочтительно используют проточную цитометрию. В качестве флуоресцентных меток для микрочастиц используют флуоресцеин, пикоэритрин, родамин и т.п.; для мечения антигенов используют флуоресцентные красители, отличающиеся от флуоресцентных красителей, используемых для частиц.

Недостатком способа является необходимость использования нескольких флуорохромов для мечения адресных частиц, что приводит к необходимости использования нескольких источников возбуждения люминесценции и нескольких детектирующих устройств для определения вида частиц, т.е. типа аналита, и для определения концентрации аналита. Для детектирования аналита используют методы проточной цитометрии, которые имеют низкое быстродействие из-за того, что в протоке каждая частица исследуется отдельно. Кроме того, методы проточной цитометрии осуществляются на дорогостоящем оборудовании и дополнительно требуют использования сложных устройств динамического фокусирования исследуемого потока.

Известен биоспецифический многоаналитный способ анализа биологических образцов (патент США №5028545, НКИ 435/501). При осуществлении способа для определения множества аналитов используют несколько категорий микрочастиц, каждая из которых отличается количеством связанного с ней флуоресцентного вещества с коротким временем затухания эмиссии флуоресценции, каждую категорию микрочастиц, соответствующую определенному аналиту, покрывают биоспецифическим реагентом, например антителами, различные категории частиц помещают в суспензию, в которую добавляют образец с искомыми аналитами и смесь биоспецифических реагентов, меченых люминесцентной меткой с длительным временем затухания, разводят суспензию с целью уменьшения концентрации меченых реагентов, не связавшихся с микрочастицами (для уменьшения фона), одновременно возбуждают флуоресценцию обоих флуоресцентных веществ, частицы идентифицируют по эмиссии флуоресценции с коротким временем затухания, а концентрацию аналитов - по эмиссии флуоресценции с длинным временем затухания. Суспензию анализируют способом быстрого сканирования под микроскопом в тонкой кювете, в которую суспензия закачивается из реакционной трубки.

Недостатком способа является длительность проведения анализа аналита под микроскопом, т.к. объем анализируемой пробы ограничен и требуется проанализировать множество микроучастков. Кроме того, чувствительность и быстродействие метода ограничены из-за необходимости использования операции разведения образца.

Известен биоспецифический многоаналитный способ исследования биологических образцов (патент США №5891738, НКИ 436/501). Способ основан на использовании различных категорий микрочастиц, покрытых различными первыми специфичными к аналиту реагентами и содержащих один или несколько флуоресцентных индикаторов в одной или нескольких концентрациях. В суспензию микрочастиц добавляют исследуемый образец с искомыми аналитами и вторые биоспецифические реагенты, меченые фотолюминесцентной меткой, инициируют биоспецифическую реакцию, разводят суспензию с целью уменьшения концентрации меченых реагентов, не связавшихся с микрочастицами, возбуждают и детектируют эмиссию люминесценции индикаторных и фотолюминесцентных меток, при этом категорию микрочастиц, соответственно вид аналитов, определяют по интенсивности двух коротко люминесцирующих флуорохромов-индикаторных меток, а концентрацию аналитов определяют по интенсивности антистоксовской флуоресценции фотолюминесцентных меток. В качестве индикаторных веществ используют тетрапиррольные (порфирин, хлорин, фталоцианин и др.) и цианиновые вещества, а в качестве фотолюминесцентной метки - пикоэритрин. Исследование пробы осуществляют на микрофлуориметре, использующем двухфотонный метод возбуждения люминесценции или конфокальный метод возбуждения и регистрации люминесценции, что позволяет существенно уменьшить фоновую флуоресценцию.

Недостатком способа является необходимость проведения исследования образца в суспензии без отделения не связавшихся маркированных лигандов, что приводит к появлению большого фонового люминесцентного сигнала, который устраняется устройствами со сложной оптической системой, что удорожает стоимость оборудования

Известно использование микрочастиц с множеством флуоресцентных меток для детектирования множества аналитов (заявка РСТ №01/13120, МКИ G01N 33/58). В изобретении предложены микрочастицы, имеющие на своей поверхности одну или более популяций флуоресцентно меченых наночастиц. Изменяя количество и отношение различных популяций наночастиц, можно установить и различить большое число дискретных популяций частиц-носителей и соответственно искомых аналитов с одинаковым спектром эмиссии. Способ может быть использован для исследования биологических жидкостей, а также образцов, взятых из окружающей среды, воды или воздуха, промышленных источников, сточных вод и т. Для детектирования аналитов в основном используют проточную цитометрию.

Недостатком способа является необходимость использования методов проточной цитометрии для детектирования искомых аналитов, недостатки которой проанализированы ранее.

Известен способ различения множества субпопуляций различных типов частиц в одном образце (патент США №4717655, класс МКИ G01N 33/58). Способ включает мечение чувствительных веществ двумя или более маркирующими агентами путем использования различных заранее выбранных их соотношений. Отношения могут находиться в диапазоне от 0% до 100% каждого агента, при этом каждый агент имеет различные и качественного устанавливаемые маркирующие характеристики. Способ также включает смешивание различных меченых веществ с частицами, имеющими специфические рецепторы к различно меченым веществам. В качестве маркирующих агентов используют флуоресцеин и родамин. Каждую частицу анализируют с целью определения отношения двух идентифицируемых маркирующих характеристик, связанных с каждой частицей. Исследования частиц проводят с использованием методов проточной цитометрии.

Недостатком способа является использование маркирующих агентов, имеющих частично перекрывающиеся спектры эмиссии, что ограничивает количество определяемых агентов и увеличивает фоновую флуоресценцию.

Наиболее близким является способ проведения иммуноанализа с использованием двух частиц (патент США №6096563, НКИ 436/523). Способ предназначен для детектирования широкого круга аналитов и может быть использован для анализа биологических образцов, а также для определения различных загрязнителей окружающей среды. Способ позволяет получить немедленные и надежные результаты о наличии остаточной контаминации на месте загрязнения, в поле, дома. Детектирование осуществляется невооруженным глазом или простыми устройствами при минимальном количестве операций, в жидкости и на твердой фазе. Сущность способа заключается в том, что на поверхность пористой мембраны наносят реакционную смесь, содержащую первые связывающие молекулы, специфичные к аналиту, исследуемый образец и частицы, покрытые вторыми связывающими молекулами, также специфичными к аналиту, но не способными пройти через поры мембраны. Затем на мембрану наносят детектирующие частицы, которые могут пройти через поры мембраны, эти частицы покрыты связывающим веществом, которое связывает детектирующие частицы с первыми связывающими молекулами, например вторыми антителами. В присутствии аналита в образце на поверхности мембраны образуется комплекс "детектирующие частицы - первые связывающие молекулы - аналит - вторые связывающие молекулы - покрытые частицы", который удерживается на поверхности мембраны и детектируется, например, невооруженным глазом, колориметром, рефрактометром и т.п., в зависимости от типа используемой метки. Покрытые и детектирующие частицы могут отличаться цветом и размером и выполнены из разных материалов; размер вторых покрытых молекул предпочтительно 3 мкм; размер первых покрытых молекул предпочтительно 0,3 мкм. В качестве мембраны используют инертный пористый фильтр, который может быть выполнен из пластика, керамики, стекла, металла. В качестве покрытых и детектирующих частиц коммерчески выгодно использовать латексы.

Недостатком способа является необходимость использования нескольких видов красителей для мечения детектирующих частиц, что влечет за собой усложнение способа как при визуальном, так и при инструментальном обнаружении аналита в образце.

Задачей является создание многоаналитного способа обнаружения и количественного детектирования концентраций биологических патогенов в пробах из объектов внешней среды, а также в других специально подготовленных материалах, например пищевых продуктах, клинических образцах.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является возможность одновременного измерения сигнала люминесценции по крайней мере двух люминесцентных метчиков, связанных с искомыми аналитами, на твердой поверхности, что позволяет исследовать множество аналитов при одном источнике возбуждения люминесценции и одном детекторе. Кроме того, все клетки искомых аналитов, связанные с твердой поверхностью, сканируются одновременно, что значительно сокращает время анализа.

Технический результат достигается предлагаемым изобретением.

Сущность изобретения заключается в том, что в многоаналитном способе проведения иммуноанализа, включающем нанесение на поверхность пористой мембраны реакционной смеси, содержащей аналит, первые связывающие молекулы, связанные с детектирующим веществом и специфичные к аналиту, исследуемый образец и частицы, не способные пройти через поры мембраны, покрытые вторыми связывающими молекулами, также специфичными к аналиту, инкубирование смеси для образования биоспецифического комплекса, отмывание реакционной смеси от несвязавшихся реагентов и детектирование аналита в образце по световому сигналу детектирующего вещества, связанного с биоспецифическим комплексом, используют по крайней мере по два вида специфичных к искомым аналитам первых и вторых связывающих молекул, при этом каждый вид тех и других молекул специфичен только к одному искомому аналиту, каждый вид первой связывающей молекулы связан по крайней мере с двумя детектирующими длительно люминесцирующими веществами, соотношение концентраций которых в каждой первой связывающей молекуле выбрано заранее и соответствует определенному искомому аналиту, регистрируют в режиме временного разрешения сигналы фосфоресценции в спектральных диапазонах эмиссии детектирующих веществ, соответствующих постоянной времени затухания этих веществ, и определяют искомый аналит по соотношению измеренных фосфоресцентных сигналов, при этом пространственное разрешение системы детектирования Δ(μ²) определяют из следующего соотношения

Δ≤S/10Nμ², где

S - площадь адсорбции частиц на мембране, μ²,

N - заданное число латексных частиц в анализируемой пробе.

Технический результат достигается также тем, что в качестве детектирующего вещества используют комплексоны с ионом европия.

Технический результат достигается также и тем, что в качестве детектирующего вещества используют комплексы копропорфирина, уропорфирина, протопорфирина, тетрафенилпорфирина с металлом Pt(II).

Технический результат достигается и тем, что в качестве первых связывающих молекул используют полимерные наночастицы диаметром от 40 до 150 нм, связанные с молекулами, обладающими высоким аффинитетом по отношению к искомым аналитам.

Технический результат достигается также и тем, что в качестве частиц, покрытых вторыми связывающими молекулами, используют латексные микрочастицы диаметром 0,5-10 микрон.

Кроме того, технический результат достигается также тем, что соотношение концентраций детектирующих веществ для одного вида первых связывающих молекул постоянно и отличается от соотношения концентраций для другого вида первых связывающих молекул по крайней мере в два раза.

Авторам не известен способ, обладающий заявляемой совокупностью признаков, следовательно, заявляемый способ соответствует критерию "новизна".

Известны способы проведения многоаналитного анализа с использованием микрочастиц. В патенте США №5028545, НКИ 435/501 описан способ, в котором для идентификации видов микрочастиц и соответственно, аналитов используют вещества с коротким временем затухания флуоресценции, а для детектирования концентрации аналита используют вещества с длительным временем затухания флуоресценции, в частности хелаты лантанидров редкоземельных элементов (европия, тербия и др.). Обнаружение и количественное измерение различных аналитов осуществляют путем исследования образца в тонкой кювете под микроскопом и детектирования каждой индивидуальной частицы. В патенте США №5891738, НКИ 436/501 описан способ проведения многоаналитного анализа для определения множества аналитов в образце с использованием микрочастиц. Для идентификации микрочастиц используют вещества с длительным временем затухания эмиссии флуоресценции, а для детектирования концентрации аналитов - вещества с коротким временем затухания флуоресценции. Измерения осуществляют путем использования проточной цитометрии. В заявке РСТ №01/13120, МКИ G01N 33/58 описан способ проведения многоаналитного детектирования с использованием множества видов окрашенных микрочастиц. При этом используют либо количество видов частиц, равное количеству детектируемых аналитов, либо различные концентрации одних и тех же частиц. Анализ осуществляют в проточном цитометре. В патенте США №4717655, МКИ G01N 33/58 описан способ использования соотношения маркирующих агентов с целью определения вида и концентрации определяемых частиц (аналитов), однако используемые маркирующие агенты имеют перекрывающиеся спектры эмиссии флуоресценции, что не дает возможности определять широкий спектр субпопуляций частиц. Кроме того, за счет короткого времени затухания флуоресценции используемых маркирующих агентов и частичного наложения спектров эмиссии флуоресценции в результаты измерений вносится значительная ошибка за счет влияния фоновой флуоресценции. Осуществление указанных выше способов требует либо сложных оптических устройств (спектрофлуориметры с двухфотонным возбуждением и измерением эмиссии флуоресценции, с использованием конфокальных оптических систем, микроскопы с CCD-камерами), либо дорогостоящих методов проточной цитометрии со сложной системой динамической фокусировки потока, несколькими источниками излучения и несколькими детекторами. По сравнению с известными техническими решениями в предлагаемом способе за счет использования множества соотношений маркирующих агентов с длительным временем затухания фосфоресценции и использования их временных характеристик затухания в совокупности с временным разрешением измерения сигналов от частиц и одновременным сканированием фосфоресценции всех частиц на твердой фазе, а также за счет снижения фоновой флуоресценции примесей стало возможным быстрое выявление большого количества аналитов (частиц) в образце при их низкой концентрации. При этом различное сочетание нескольких фосфоресцентных меток используется как для идентификации аналитов, так и для измерения их концентрации, что дополнительно удешевляет и упрощает способ. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию "уровень техники".

Изобретение может быть использовано для детектирования, идентификации и количественного определения материалов, которые способны связываться со специфическими связывающими агентами, в частности биологических материалов, таких как антигены, микроорганизмы и нуклеиновые кислоты. В частности способ может быть использован для детектирования низкой концентрации микроорганизмов специфических генов, видов или серотипов в изолированной форме или в качестве контаминантов пищи, окружающей среды или образцов судебной экспертизы. Способ позволяет проводить быстрый анализ в полевых условиях, на месте контаминации, на его основе могут быть созданы простые устройства, переносные, на простой элементной базе. Следовательно, заявляемое изобретение соответствует критерию "промышленная применимость".

Фиг.1А - распределение длительно люминесцирующих микрочастиц 1 на мембране площадью 1 мм² (фрагмент дна лунки микропланшета) при анализе пробы с возбудителем чумы в концентрации 4000 м.кл./мл и стафилококковым энтеротоксином типа В в концентрации 10 нг/мл при измерении интенсивности сигнала на длине волны 645 нм.

Фиг.1Б - фрагмент участка мембраны площадью 330×330 микрон: по оси ординат Z - интенсивность сигнала на длине волны 615 нм;

Фиг.1В - тот же фрагмент; по оси ординат Z - интенсивность сигнала на длине волны 645 нм; 2 - пики люминесценции, для которых выполняется соотношение 1/1 (615 нм/645 нм); 3 - пики люминесценции, для которых выполняется соотношение 2/1 (615 нм/645 нм).

Фиг.2А - распределение длительно люминесцирующих микрочастиц 4 на мембране площадью 1 мм² (фрагмент дна лунки микропланшета) при анализе пробы с возбудителем туляремии в концентрации 5000 м.кл./мл и стафилококковым энтеротоксином типа В в концентрации 50 нг/мл при измерении интенсивности сигнала на длине волны 645 нм.

Фиг.2Б - фрагмент участка мембраны площадью 330×330 микрон; по оси ординат Z - интенсивность сигнала на длине волны 615 нм;

Фиг.2В - тот же фрагмент; по оси ординат Z - интенсивность сигнала на длине волны 645 нм; 5 - пики люминесценции, для которых выполняется соотношение 1/2 (615 нм/645 нм); 6 - пики люминесценции, для которых выполняется соотношение 2/1 (615 нм/645 нм).

Фиг.3А - распределение длительно люминесцирующих микрочастиц - 7 на мембране площадью 1 мм² (фрагмент дна лунки микропланшета) при анализе пробы с ботулиническим токсином типа А в концентрации 10 нг/мл, возбудителем сибирской язвы 5000 спор/мл, стафилококковым энтеротоксином типа В в концентрации 100 нг/мл при измерении интенсивности сигнала на длине волны 645 нм.

Фиг.3Б - фрагмент участка мембраны площадью 330×330 микрон; по оси ординат Z - интенсивность сигнала на длине волны 615 нм;

Фиг.3В - тот же фрагмент по оси ординат, Z - интенсивность сигнала на длине волны 645 нм; 8 - пики люминесценции, для которых выполняется соотношение 1/2 (615 нм/645 нм); 9 - пики люминесценции, для которых выполняется соотношение 1/4 (615 нм/645 нм); 10 - пики люминесценции, для которых выполняется соотношение 4/1 (615 нм/645 нм).

Для проведения иммуноанализа используют 96-ячеистые микротитровальные платы с дном ячеек площадью 30-36 мм², выполненным из фильтрующего мембранного материала с диаметром пор меньше, чем диаметр микрочастиц со вторыми связывающими молекулами. Для адсорбции выявляемых аналитов (антигенов) используют латексные микрочастицы с иммобилизованными антителами в концентрации 10² частиц диметром 2,5 микрона для каждого из аналитов. Для промывания и удаления несвязавшихся компонентов используют мембранную фильтрацию. В качестве проявляющего биоспецифического реагента используют вторые антитела (первые связывающие молекулы), маркированные по крайней мере двумя фосфоресцирующими (детектирующими) метками, например металлопорфирином и хелатирующим комплексом с ионом европия. Для обнаружения, например, четырех видов аналитов используют смесь, содержащую антитела ко всем четырем аналитам. Первые связывающие молекулы, специфичные к различным аналитам, отличаются разным заранее выбранным соотношением концентраций указанных детектирующих веществ на их поверхности, что позволяет идентифицировать адсорбированные иммунные комплексы на латексных частицах. Сканирование дна ячейки микротитровальной платы осуществляют с разрешением микроплощадок 30×30 мкм в режиме временного разрешения люминесценции, с выделением длительной люминесценции (фосфоресценции) в диапазоне от 50 до 300 мкс, при этом пространственное разрешение системы детектирования Δ(μ²)=900 μ², что обеспечивает выполнение соотношения

Δ≤S/10N=36×10⁶/10×4×10²=9000 μ²

Обнаружение и идентификацию искомого аналита осуществляют по уровню и соотношению сигналов фосфоресценции в двух спектральных диапазонах, 610-620 нм и 640-660 нм, которые соответствуют максимумам люминесценции иона европия (615 нм) в составе хелатного комплекса и Pt-копропорфирина (645 нм).

Аналиты, которые могут быть обнаружены предлагаемым способом, относятся к биологическим агентам, обнаруживаемым в окружающей среде (в воде, почве, сточных и промышленных водах), в пищевых продуктах, биологических образцах, и представляют собой вирусы, патогенные микроорганизмы, их антигены, токсины, низкомолекулярные биологически активные соединения.

В качестве первых (детектирующих) связывающих молекул могут быть использованы первые антитела, их фрагменты, другие биологические молекулы, обладающие способностью к биоспецифическому связыванию с искомым аналитом.

В качестве вторых связывающих молекул могут быть использованы вторые антитела, их фрагменты, другие биологические молекулы, обладающие способностью к биоспецифическому связыванию с искомым аналитом. Для искомых аналитов, содержащих несколько повторяющихся эпитопов в качестве первых (детектирующих) и вторых связывающих молекул, могут быть использованы одни и те же молекулы.

В качестве детектирующих веществ, связанных с первыми связывающими молекулами, могут быть использованы комплексоны ионов европия, комплексы копропорфирина, уропорфирина, протопорфирина, тетрафенилпорфирина с металлом Pt(II) и др. вещества, имеющие длительное время затухания люминесценции.

Дно ячеек микротитровальной платы выполнено в виде фильтра (мембраны) из полимерного материала с диаметром пор, позволяющим проходить несвязавшимся компонентам биоспецифической реакции и не пропускающим латексные частицы со связанным с ними комплексом аналита и первых связывающих молекул с детектирующими веществами.

Пример 1. Приготовление первых связывающих молекул, содержащих детектирующие вещества на основе ортосиликатных наночастиц.

Для определения в пробе одного из биопатогенов, возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии, стафилококкового энтеротоксина типа В готовят конъюгаты первых связывающих молекул в виде длительно люминесцирующих ортосиликатных наночастиц с моноклональными мышиными антителами к каждому из искомых биоагентов.

Получение наночастиц, связанных с Pt-копропорфирином и хелатными комплексами ионов Eu, осуществляется по методике Santra S. et al (Anal. Chem., 2001, 73, 4988-4993).

Наночастицы получают контролируемым гидролизом тетраэтилортосиликата (ТЭОС) в атоге-масляной эмульсии, атоге-масляную эмульсию готовят смешиванием на магнитной мешалке 0,94 г Тритона Х-100 (Serva, кат.№37240), 3,75 мл циклогексана (Sigma, кат. № С-8456), 0,9 мл н-гексанола (Aldrich, кат. № Н 1330-3).

В качестве фосфоресцентной метки использовали Pt-копропорфирин, полученный в соответствии с пат. РФ №1707539, класс МКИ G01N 33/532. В качестве хелатных комплексов ионов европия использовали соединения на основе бис-β-дикарбонильного производного карбазола (патент РФ №2296756, класс МКИ C07D 307/91). При получении наночастиц молярное соотношение молекул хелатного комплекса по отношению к молекулам Pt-порфирина в реакционной смеси устанавливали с учетом требуемого соотношения числа молекул европия и платинапорфирина в наночастице.

Для получения набора наночастиц с заданным ориентировочным соотношением: 1/1, 1/2, 1/4, 2/1 уровней сигналов фосфоресценции на длинах волн 615 нм/645 нм в реакционные смеси вводили по 0,26 мл соответственно хелата Eu(III) и платинакопропорфирина. Для указанных выше соотношений сигналов фосфоресценции отношения концентраций хелата Eu(III) и водного раствора Pt-копропорфирина тетракалиевой соли составили соответственно: 1,5·10^-2M /1,15·10^-2М; 1,5·10^-2M /2,3·10^-2М; 1,5·10^-2M /4,6·10^-2М; 3,0·10^-2М /1,15·10^-2М; 6,0·10^-2М /1,15·10^-2М. Затем в каждую реакционную смесь прибавляли 50 мкл ТЭОС (Sigma, кат. № Т-3143) и инициировали процесс полимеризации добавлением 33 мкл 25% водного раствора аммиака. При непрерывном перемешивании процесс продолжался 24 часа при комнатной температуре.

Образовавшуюся суспензию наночастиц (со средним диаметром 60-70 нм и плотностью 1,96 г/см³) отмывали центрифугированием при 8000 об/мин, 15 мин: два раза в 50% этаноле и два раза - в бидистиллированной воде. Окончательно наночастицы ресуспендировали в 4 мл бидистиллата.

Люминесцентно-спектральные характеристики суспензии полученных наночастиц контролировали на спектрофлуориметре LS-5B при возбуждении на длине волны λ_возб - 380 нм, λ_эм платинакопропорфирина - 645 нм, λ_эм хелата Eu(III) - 615 нм. Все измерения проводились в присутствии О₂. Надосадочная жидкость в этих условиях даже в отсутствие O₂ давала сигнал, не превышающий 0.3% от уровня сигнала люминесценции наночастиц.

Наночастицы, содержащие в своем составе детектирующие вещества, после предварительной модификации цианогенбромидом затем ковалентно связывали с молекулами моноклональных антител. Каждый из видов наночастиц, отличающихся соотношением люминесцирующих меток, обрабатывали только одним видом связывающих молекул (антител) к одному из искомых аналитов путем инкубирования последних с наночастицами и последующей отмывкой диализом не связавшихся антител.

Для получения первых связывающих молекул для выявления возбудителя чумы, сибирской язвы, туляремии, стафилококкового энтеротоксина типа В, ботулинического токсина типа А использовали моноклональные антитела производства АО ВНЦ молекулярной диагностики и лечения, ООО «Импакт» (Свешников П.Г., Кисилев В.И., Северин Е.С., Пальцев М.А. Молекулярная медицина, 2004, №4, с.67-72).

Наночастицы из ортосиликата с включением платиновых комплексов уропорфирина, протопорфирина и тетрафенилпорфирина получали аналогично описанной выше процедуре.

Для проведения мультиплексного анализа используют смесь из конъюгатов первых связывающих молекул с детектирующими частицами в концентрации в смеси 10¹⁰ наночастиц для каждого из искомых патогенов. Количество видов первых связывающих молекул в смеси соответствует числу искомых патогенов.

Молярное соотношение люминесцирующих соединений в первых связывающих молекулах, наночастицах с ковалентно связанными антителами к различным патогенам представлено в таблице 1.

Пример 2. Приготовление первых связывающих молекул, содержащих детектирующие вещества на основе наночастиц из меламино-формальдегидной смолы.

Наночастицы получали по ТУ 2634-015-49941990-03 ЗАО «ИММУНОСКРИН» Москва. Для получения набора наночастиц с заданным ориентировочным соотношением: 1/1, 1/2, 1/4, 2/1 уровней сигналов фосфоресценции на длинах волн 615 нм/645 нм в 10 мл реакционной смеси вводят по 0,3 мл соответственно хелата Eu(III) и платинакопропорфирина. Для указанных выше соотношений сигналов фосфоресценции соотношения концентраций хелата Eu(III) и водного раствора Pt-копропорфирина тетракалиевой соли составили соответственно: 1,5·10^-2M /1,15·10^-2М; 1,5·10^-2M /2,3·10^-2М; 1,5·10^-2M /4,6·10^-2М; 3,0·10^-2М /1,15·10^-2М; 6,0·10^-2М /1,15·10^-2М. Наночастицы диаметром 100-120 нм представляют собой продукт поликонденсации моно-, ди- и триметилмольных производных меламина, образующихся при взаимодействии меламина с формальдегидом. Детектирующие вещества: хелат Eu(III) на основе бис-β-дикарбонильного производного карбазола и платинакопропорфирин вводились в реакционную смесь в момент начала процесса поликонденсации. Включение их в частицы контролировали по уровню сигнала фосфоресценции хелата европия (λ_возб - 380 нм, λ_эм, - 615 нм, τ ˜ 320 мкс) и платина-копропорфирина (λ_возб - 380 нм, λ_эм - 645 нм, τ ˜ 80 мкс). Фракцию наночастиц диаметром 120-150 нм получали фильтрованием общей реакционной смеси через мембранные фильтры Unipor фирмы Biorad диаметром 0,2 и 0,1 мкм.

Наночастицы, содержащие в своем составе детектирующие вещества, затем адсорбционно связывали с молекулами моноклональных антител добавлением к 1 мл суспензии наночастиц 30 мкг антител, специфичных к одному из биоагентов, в объеме 10 мкл. После 10 часов инкубации несвязавшиеся антитела удаляли центрифугированием, как описано в примере 1. Каждый из видов наночастиц, отличающихся соотношением люминесцирующих меток, обрабатывали только одним видом связывающих молекул (антител) к одному из искомых аналитов путем инкубирования последних с наночастицами и последующей отмывкой диализом несвязавшихся антител. Молярное соотношение люминесцирующих соединений в первых связывающих молекулах к различным аналитам в меламин-формальдегидных наночастицах представлено в таблице 2.

Наночастицы из меламин-формальдегидной смолы с включением платиновых комплексов уропорфирина, протопорфирина и тетрафенилпорфирина получали аналогично описанной выше процедуре.

Пример 3. Получение латексных микрочастиц, покрытых вторыми связывающими молекулами на основе меламин-формальдегидной смолы.

Для приготовления латексных частиц, покрытых вторыми связывающими молекулами, специфичными к одному из множества определяемых патогенов, использовали метилметакриловые латексные частицы (производства ЗАО «ИММУНОСКРИН» Москва, ТУ 2634-015-49941990-03) с диаметром 2,5 микрона.

Иммобилизацию вторых связывающих молекул (антител к искомым патогенам) осуществляли путем инкубации латексных частиц в концентрации около 10¹⁰ частиц/мл в 20 мМ растворе фосфатного буфера с мышиными моноклональными антителами к каждому из искомых патогенов. Реакционная смесь содержала 50 мкг/мл антител и около 10¹⁰ латексных частиц/мл. Латексные частицы инкубировали 4 часа при комнатной температуре и освобождали от непрореагировавших (свободных) антител осаждением при центрифугировании (2000 об/мин) с последующим ресуспендированием в растворе 20 мМ фосфатного буфера с бычьим сывороточным альбумином в концентрации 0,1%.

Для проведения многоаналитного анализа готовили смесь из латексных частиц, покрытых вторыми связывающими молекулами ко всем искомым патогенам. С этой целью смешивали в равных долях латексные частицы, покрытые антителами к каждому из вышеперечисленных патогенов в концентрации 4000 частиц/мл.

Пример 4. Одновременное определение в пробах возбудителя чумы и стафилококкового энтеротоксина типа В.

В лунку микропланшета объемом 350 микролитров с дном, выполненным в виде мембраны из полимерного материала (полипропилена) толщиной 10 микрон с порами диаметром 1,5 микрона (мембраны производства НИИ кристаллографии РАН), вносят пробу воды объемом 100 микролитров, содержащую клетки возбудителя чумы (вакцина живая чумная производства Ставропольского НИПЧИ) в концентрации 4000 м.к./мл и стафилококковый энтеротоксин типа В (поставщик ООО «Импакт») в концентрации 10 нг/мл, затем добавляют 50 мкл смеси первых связывающих молекул, связанных с фосфоресцентными метками, приготовленными, как описано в примере 1, и 50 мкл смеси латексных частиц, покрытых вторыми связывающими молекулами. Мембрану предварительно обрабатывают в течение 30 минут 1% раствором бычьего сывороточного альбумина для исключения неспецифической адсорбции биологических молекул. Пробу инкубируют в течение 15 минут, фильтруют через мембрану и дополнительно промывают путем фильтрации 3-кратным объемом фосфатного буфера, а затем однократно промывают дистиллированной водой. Мембрану сушат продувкой через нее воздуха в течение 1 минуты. После этого дно лунки сканируют с помощью фосфоресцентного сканера ИФИ (разработка ФГУП ″ГосНИИ БП") при последовательном возбуждении лазерным диодом отдельных микрозон площадью до 900μ². Сканирование дна лунки осуществляют последовательно в двух спектральных и временных режимах: первый режим соответствует регистрации эмиссии люминесценции ионов европия - максимум длины волны регистрации 615 нм, время задержки между импульсом возбуждения и регистрацией эмиссии 300 микросекунд, время измерения от 300 до 700 микросекунд; второй режим соответствует регистрации эмиссии платинакопропорфирина - максимум длины волны регистрации 645 нм, время задержки - 40 микросекунд, время измерения от 40 до 200 микросекунд. При этом регистрируют пики фосфоресценции, превышающие уровень фоновой люминесценции мембраны не менее чем в 5 раз. Результаты сканирования участка мембраны дна лунки микропланшета площадью в 1 мм² на длине волны излучения 645 нм представлены на фиг.1А, где 1 - сигналы (пики) фосфоресценции от отдельных латексных микрочастиц, связавших на своей поверхности искомые аналиты. На фиг.1Б представлен фрагмент участка этой же мембраны площадью 330×330 микрон, выполненный в виде трехкоординатной сетки с указанием интенсивности сигнала на длине волны 645 нм по оси Z, где 2 - сигналы (пики) фосфоресценции, для которых соотношение 615 нм/645 нм близко к 1, а 3 - сигналы (пики) фосфоресценции, для которых соотношение 615 нм/645 нм близко к 2. На фиг.1В представлен фрагмент этого же участка, выполненный в виде трехкоординатной сетки с указанием интенсивности сигнала на длине волны 615 нм по оси Z.

Из данных, представленных на фиг.1А, 1Б, 1В, видно, что сигнал фосфоресценции в виде отдельных пиков регистрируется как на длине волны 645 нм, так и на длине волны 615 нм. При этом соотношение сигналов 615 нм/645 нм для каждой микрочастицы близко к 1 или 2, что указывает на наличие возбудителей чумы и стафилококкового энтеротоксина в пробе.

Аналогичные результаты получены при анализе проб, содержащих в смеси и другие концентрации возбудителя чумы и стафилококкового энтеротоксина В. Результаты проведения анализа представлены в таблице 3. Увеличение концентрации атогена сопровождается увеличением уровня сигнала микрочастиц, на которых адсорбируется искомый антиген в комплексе с первыми связывающими молекулами и детектирующими веществами.

Из данных таблицы 3 и фиг.1 следует, что в анализируемых пробах наблюдается длительная люминесценция в виде отдельных пиков люминесценции, соотношение сигналов для которых в двух спектральных диапазонах соответствует соотношению сигналов, характерному для первых детектирующих молекул к чумному микробу и стафилококковому энтеротоксину типа В. Причем число «пиков», характерных для люминесценции чумного микроба, возрастает пропорционально увеличению его концентрации, в то время как число «пиков», соответствующих токсину, остается постоянным. Это обусловлено тем, что токсин выявляется только на твердофазном носителе (вторых связывающих антителах), а чумной микроб задерживается на мембране как в связке со вторыми антителами, так и непосредственно в виде отдельных клеток или их ассоциатов. При этом больший разброс в диапазоне сигналов обусловлен адсорбцией на частицах нескольких клеток так же, как и образованием ассоциатов из нескольких клеток.

Пример 5. Одновременное определение в пробах возбудителя туляремии и стафилококкового энтеротоксина типа В.

В лунку микропланшета объемом 350 мкл с дном, выполненным в виде мембраны из полимерного материала (полипропилена) толщиной 10 микрон с порами диаметром 1,5 микрона, вносят пробу воды объемом 100 мкл, содержащую клетки возбудителя туляремии (диагностикум туляремийный для кровяно-капельной реакции агглютинации Одесского предприятия по производству бактерийных препаратов) в концентрации 5000 м.к./мл и 50 нг/мл стафилококкового энтеротоксина В, затем добавляют 50 мкл смеси первых связывающих молекул, маркированных фосфоресцентными метками, приготовленными в соответствии с примером 2, и 50 мкл смеси латексных частиц, покрытых вторыми связывающими молекулами. Мембрану предварительно в течение 30 минут обрабатывают 1% раствором бычьего сывороточного альбумина для исключения неспецифической адсорбции биологических молекул. Пробу инкубируют в течение 10 минут, фильтруют через мембрану, дополнительно промывают путем фильтрации 3-кратным объемом фосфатного буфера и однократно промывают дистиллированной водой. Мембрану сушат продувкой через нее воздуха в течение 1 минуты. После этого дно лунки сканируют, как описано в примере 4. Результаты сканирования участка мембраны дна лунки микропланшета площадью в 1 мм² представлены на фиг.2А. На фиг.2Б представлен фрагмент участка этой же мембраны площадью 330×330 микрон, выполненный в виде трехкоординатной сетки с указанием интенсивности сигнала на длине волны 645 нм по оси Z. На фиг.2В представлен фрагмент этого же участка, выполненный в виде трехкоординатной сетки с указанием интенсивности сигнала на длине волны 615 нм по оси Z, где 5 - сигналы (пики) фосфоресценции, для которых соотношение 615 нм/645 нм близко к 1/2, а 6 - сигналы (пики) фосфоресценции, для которых соотношение 615 нм/645 нм близко к 2.

Из данных, представленных на фиг.2А, 2Б, 2В, видно, что сигнал фосфоресценции в виде отдельных пиков регистрируется как на длине волны 645 нм, так и 615 нм. При этом соотношение сигналов 615 нм/645 нм для каждой микрочастицы близко к 1/2 или к 2, что указывает на наличие возбудителей туляремии и энтеротоксина в пробе.

Аналогичные результаты получены при анализе проб, содержащих в смеси и другие концентрации возбудителя туляремии и стафилококкового энтеротоксина В. Результаты проведения анализа представлены в таблице 4. Увеличение концентрации атогена сопровождается увеличением уровня сигнала микрочастиц, на которых адсорбируется искомый антиген в комплексе с первыми связывающими молекулами и детектирующими веществами.

Число «пиков», характерных для люминесценции туляремийного микроба, возрастает с увеличением его концентрации, в то время как число «пиков», соответствующих токсину, остается постоянным. Это обусловлено тем, что токсин выявляется только на твердофазном носителе (вторых связывающих антителах), а туляремийный микроб частично задерживается на мембране как в связке со вторыми антителами, так и непосредственно в виде отдельных клеток или их ассоциатов. При этом больший разброс в диапазоне сигналов обусловлен адсорбцией на частицах нескольких клеток так же, как и образованием ассоциатов из нескольких клеток.

Пример 6. Одновременное определение в пробах ботулинического анатоксина типа А, спор возбудителя сибирской язвы и стафилококкового энтеротоксина типа В.

В лунку микропланшета объемом 350 микролитров, описанного в предыдущих примерах, вносят пробу воды объемом 100 микролитров, содержащую стафилококковый энтеротоксин типа В в концентрации 100 нг/мл, ботулинический анатоксин типа А в концентрации 10 нг/мл (производства Уфимского НИИВС), споры сибиреязвенного микроба (вакцина СТИ производства Ставропольского НИПЧИ) в концентрации 5000/мл; затем добавляют 50 мкл смеси первых связывающих молекул, маркированных фосфоресцентными метками, и 50 мкл смеси латексных частиц, покрытых вторыми связывающими молекулами. Далее способ осуществляют так, как описано в предыдущих примерах. Результаты сканирования участка мембраны дна лунки микропланшета площадью в 1 мм² представлены на фиг.3А. На фиг.3Б представлен фрагмент участка этой же мембраны площадью 330×330 микрон, выполненный в виде трехкоординатной сетки с указанием интенсивности сигнала на длине волны 645 нм по оси Z. На фиг.3В представлен фрагмент этого же участка, выполненный в виде трехкоординатной сетки с указанием интенсивности сигнала на длине волны 615 нм по оси Z, где 7 - сигналы (пики) фосфоресценции, для которых соотношение 615 нм/645 нм близко к 1/4, а 8 - сигналы (пики) фосфоресценции, для которых соотношение 615 нм/645 нм близко к 2/1, 9 - сигналы (пики) фосфоресценции, для которых соотношение 615 нм/645 нм близко к 4/1. В таблице 5 представлены результаты определения нескольких аналитов в исследуемой пробе.

Из данных, представленных на фиг.3А, 3Б, 3В, видно, что сигнал фосфоресценции в виде отдельных пиков регистрируется как на длине волны 645 нм, так и на длине волны 615 нм. При этом соотношение сигналов 615 нм/645 нм для каждой микрочастицы близко к 1/4, 2/1 или 4/1, что указывает на наличие спор сибирской язвы, стафилококкового энтеротоксина В и ботулинического токсина типа А в пробе.

Соотношение уровней сигналов фосфоресценции 615 нм / 645 нм для первых связывающих молекул (ортосиликатных наночастиц с моноклональными антителами к различным патогенам)

Таблица 1Заданное соотношение уровней сигналов 615 нм/645 нм1/11|21|42|14/1Полученное соотношение уровней сигналов для первых связывающих молекул1,1±0,10,5±0,040,27±0,032,1±0,144,3±0,4Выявляемый аналит (патоген)Возбудитель чумыВозбудитель сибирской язвыВозбудитель туляремииТоксин стафилококковый типа ВТоксин ботулинический типа А

Соотношение уровней сигналов фосфоресценции 615 нм / 645 нм для первых связывающих молекул (меламин-формальдегидных наночастиц с моноклональными антителами к различным патогенам)

Таблица 2Заданное соотношение уровней сигналов 615 нм/645 нм1/11|21|42|14/1Полученное соотношение уровней сигналов для первых связывающих молекул0,97±0,080,47±0,050,24±0,032,0±0,174,1±0,38Выявляемый патогенВозбудитель чумыВозбудитель сибирской язвыВозбудитель туляремииТоксин стафилококковый типа ВТоксин ботулинический типа А

Результаты анализа исследуемых проб, содержащих возбудитель чумы и стафилококковый энтеротоксин В в пробе

Таблица 3№ пробыКонцентрация чумного микроба в пробе (м.к./мл)Концентрация токсина в пробе (нг/ мл)Соотношение уровней сигналов от частиц в двух спектрально-временных интервалахЧастицы с соотношением 615 нм (7·10^-4 с)/ 645 нм (10^-4 с), близким к 1/1, отн. ед.Частицы с соотношением 615 нм (7·10^-4 с)/ 645 нм (10^-4 с), близким к 2/1, отн.ед.Наличие частиц на площадке 1 мм² с другим соотношением сигналовДиапазон уровней сигналовЧисло частиц (пиков) на площадке 1 мм²Диапазон уровней сигналовЧисло частиц (пиков) на площадке 1 мм²120005040-80391120±70/550±4228-240001042-11051170±14/82±929-3800010041-230761840±96/890±5827141000020044-650913100±120/1530±87283

Результаты анализа исследуемых проб, содержащих возбудитель туляремии и стафилококковый энтеротоксин В в различных концентрациях.

Таблица 4№ пробыКонцентрация клеток туляремийного диагностикума в пробе (м.к./мл)Концентрация токсина в пробе (нг/ мл)Соотношение уровней сигнала от частиц в двух спектрально-временных интервалахЧастицы с соотношением 615 нм (7·10^-4 с)/ 645 нм (10^-4 с), близким к 1/2, отн.ед.Частицы с соотношением сигналов 615 нм (7·10^-4 с)/ 645 нм (10^-4 с), близким к 2/1, отн.ед.Наличие частиц на площадке 1 мм² с другим соотношением сигналовДиапазон уровней сигналов на длине волны 645 нмЧисло «пиков» на лошадке 1 мм²Диапазон уровней сигналовЧисло «пиков» на лошадке 1 мм²150005055-270471010±80/510±4727-2100001053-39074165±13/80±1028-3200010053-205351745±92/862±6827-4200020054-211363100±120/1530±87283

Одновременное определение в пробах ботулинического анатоксина типа А, спор возбудителя сибирской язвы и стафилококкового энтеротоксина типа В.

Таблица 5№п/пСоотношение уровней сигнала от частиц в двух спектрально-временных интервалах 615 нм (7·10^-4 с) /645 нм (10^-4 с), отн.ед.Выявляемый патогенЗаданная концентрацияЧисло люминесцирующих микрочастиц на площади 1 мм²Диапазон уровней сигналов люминесценции на длине волны 645 нм, отн.ед.11/4Споры сибирской язвы5000 спор/мл4560-21022/1Стафилококковый энтеротоксин типа В100 нг/мл24800-93034/1Ботулинический токсин типа А10 нг/мл2875-904иное--142

Изобретение относится к медицинской диагностике, а именно к иммуноанализу. Сущность способа: на поверхность пористой мембраны наносят реакционную смесь, содержащую аналит, первые связывающие молекулы, связанные с детектирующим веществом и специфичные к аналиту, исследуемый образец и частицы, не способные пройти через поры мембраны, покрытые вторыми связывающими молекулами, также специфичными к аналиту, инкубируют смесь для образования биоспецифического комплекса, отмывают смесь от несвязавшихся реагентов и регистрируют в режиме временного разрешения сигналы фосфоресценции в спектральных диапазонах детектирующих веществ, соответствующих постоянной времени затухания этих веществ. Искомый аналит определяют по соотношению измеренных фосфоресцентных сигналов, при этом используют по крайней мере по два вида первых и вторых связывающих молекул, каждый вид первой связывающей молекулы связан по крайней мере с двумя детектирующими длительно люминесцирующими веществами, например хелатом европия и платинапорфирином, соотношение концентраций которых в каждой первой связывающей молекуле выбрано заранее и соответствует определенному аналиту. Способ позволяет обнаружить и количественно детектировать низкие концентрации биологических аналитов в пробах при проведении исследований на твердой поверхности. 4 з.п. ф-лы, 5 табл., 3 ил.

1. Способ многоаналитного иммуноанализа с использованием микрочастиц, включающий нанесение на поверхность пористой мембраны реакционной смеси, содержащей аналит, первые связывающие молекулы, связанные с детектирующим веществом и специфичные к аналиту, исследуемый образец и частицы, не способные пройти через поры мембраны, покрытые вторыми связывающими молекулами, также специфичными к аналиту, инкубирование смеси для образования биоспецифического комплекса, отмывание реакционной смеси от не связавшихся реагентов и детектирование аналита в образце по световому сигналу детектирующего вещества, связанного с биоспецифическим комплексом, отличающийся тем, что используют по крайней мере два вида специфичных к искомым аналитам первых и вторых связывающих молекул, при этом каждый вид тех и других молекул специфичен только к одному искомому аналиту, каждый вид первой связывающей молекулы связан по крайней мере с двумя длительно люминесцирующими детектирующими веществами, соотношение концентраций которых в каждой первой связывающей молекуле выбрано заранее и соответствует определенному искомому аналиту, регистрируют в режиме временного разрешения сигналы фосфоресценции в спектральных диапазонах эмиссии детектирующих веществ, соответствующих постоянной времени затухания этих веществ, и определяют искомый аналит по соотношению фосфоресцентных сигналов, при этом пространственное разрешение системы детектирования Δ(μ²) определяют из следующего соотношения:

Δ≤S/10Nμ²,

где S - площадь адсорбции частиц на мембране, μ²;

N - заданное число латексных частиц в анализируемой пробе.