ШТАММ BACILLUS SUBTILIS РАС, РЕЗИСТЕНТНЫЙ К РИФАМПИЦИНУ, АМПИЦИЛЛИНУ И СТРЕПТОМИЦИНУ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К ПАТОГЕННЫМ ВИДАМ МИКРООРГАНИЗМОВ Российский патент 1998 года по МПК C12N1/20 A61K35/66 A61K35/74 C12N1/20 C12R1/125 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и касается получения генетически измененных вариантов пробиотиков, с сохранением ингибирующих свойств к Bacillus anthracis, Vibrio cholerae, Yersinia pestis, Pseudomonas (Burkcholderia) pseudomallei. Штамму присвоен номер КМ-115 и он депонирован в Российской коллекции патогенных бактерий "Микроб".

В последние годы в терапии инфекционных заболеваний достаточно широко используют пробиотики - препараты, в состав которых входят живые микроорганизмы (естественные обитатели кишечного тракта человека) или сапрофиты, обитающие во внешней среде. В отличие от антибиотиков они совершенно безвредны, экологически чисты и не имеют противопоказаний для клинического применения.

Использование для конструирования пробиотиков микроорганизмов из рода Bacillus (чаще, B. subtilis) привело к созданию некоторых эффективных препаратов (бактисубтил, бактерин-СЛ, биоспорин, споробактерин, споролакт, бификол и др.), которые применяют в США, Италии, Югославии, Германии, Франции, Китае, Украине и сравнительно недавно в России (Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В. А. и др. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus, Микробиол. журнал, 1993, т. 55, N 4, с. 92 - 112; Резник С.Р., Вьюницкая В.А., Афонская С. В., Смирнов В.В. Серологический ответ микроорганизма на патогенные бактерии под влиянием пробиотиков из бацилл. Микробиол. журнал, 1993, т. 55, N 5, с. 81 - 83).

Возможность создания новых пробиотиков, совершенствование существующих, а также их более широкое использование для лечения и профилактики инфекционных заболеваний (в том числе, особо опасных), дисбактериоза и других нарушений деятельности желудочно-кишечного тракта представляют актуальную задачу.

В инструкциях по применению "Споробактерина", утвержденных решениями Комитета медицинских иммунобиологических препаратов Фармкомитета России от 15.10.92 и зам. начальника Главного управления ветеринарии от 31.07.92 имеется упоминание о том, что поскольку бактерии штамма сенной палочки высокочувствительны к антибиотикам, то "одновременное введение антибиотиков и других антибактериальных препаратов, особенно через рот, резко снижает эффективность споробактерина".

Целью изобретения является получение штамма B. subtilis, обладающего множественной лекарственной устойчивостью (Rif^r, Ap^r, Str^r) с сохранением ингибирующих свойств к B. anthracis (возбудителю сибирской язвы), V. cholerae (различным типам возбудителя холеры), Y. pestis (возбудителю чумы), P. pseudomallei (возбудителю мелиоидоза), а также культурально-морфологических и биохимических свойств, характерных для штамма прототипа B. subtilis 534, являющегося основой препарата "споробактерин" фирмы "Бакорен", г. Оренбурга.

Для получения антибиотикорезистентных вариантов B. subtilis с помощью методов селекции (Браун В. Генетика микроорганизмов. М.: Наука, 1968, с. 134 - 139) на градиентных пластинках и с помощью различных рекомбинационных процессов (Прозоров А.А. Генетическая трансформация и трансфекция. М.: Наука, 1980, с. 124 - 129; Battisti L., Green B.D., Thorne C.B. Mating system for transfer of plasmids among Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis. J. Bacteriology, 1985, v. 162, N 2, p. 543 - 550). В качестве исходного (реципиентного) был использован штамм B. subtilis 534 с антимикробным эффектом против патогенной микрофлоры. В качестве донорных культур для осуществления рекомбинационных процессов были использованы маркерные штаммы микроорганизмов (табл. 1).

Предварительно, на L-агаре (среда Луриа) с дозами 2,5; 5; 10 мкг/мл антибиотика у штамма B. subtilis 534 был определен уровень чувствительности (резистентности) к различным, наиболее употребляемым в настоящее время в клиниках, десяти антибиотикам: ампициллину (Ap); бензилпенициллину (Bp); тетрациклину (Tc); стрептомицину (Str); хлороамфениколу (Cm); эритромицину (Em); рифампицину (Rif); канамицину (Km); ристомицину (Ris); карбинициллину (Car).

У штамма B. subtilis 534 выявлены единичные клетки популяции бацилл, устойчивые к 10 мкг/мл Str. К остальным антибиотикам B. subtilis 534 была чувствительна.

С высокой частотой выявляются в популяции B. subtilis на градиентных пластинках и Rif^r варианты. При этом устойчивость 10 мкг/мл антибиотика в крови (ликворе) кумулируется крайне редко (Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. М.: Медицина, 1982, с. 495).

Ампициллинрезистентность (т. е. синтез β -лактамазы) у B. subtilis получена с помощью генетических рекомбинационных процессов и имеет ряд особенностей, характерных для резистентности к данному антибиотику - у варианта B. subtilis РАС синтез β -лактамазы носит явный индуктивный характер с выраженностью "эффекта массы", т. е. высев малого количества спор или вегетативных клеток этого варианта на среду, содержащую 5 - 10 мкг/мл ампициллина, из-за малого пула не могут расти на такой среде. В то же время высев свежей бактериальной массы (вегетативных клеток) этого варианта B. subtilis на среду, содержащую даже больше 10 мкг/мл ампициллина, дает прирост клеток с четким фенотипическим проявлением.

При конструировании пробиотиков с требуемыми свойствами перспективный штамм должен сочетать антагонистическую активность по отношению к заданному набору патогенных культур с достаточной устойчивостью к неблагоприятным условиям среды (в данном случае устойчивость к антибиотикам).

Пример 1. Испытание генетически маркированного штамма B. subtilis РАС по проявлению антибиотикорезистентности в сравнении с исходным штаммом - прототипом B. subtilis 534.

Предварительно обе культуры B. subtilis высеваются в пробирки с L-бульоном (фирма "Дифко"). Культуры бацилл подращиваются при 37^oC в течение ночи (12 - 18 ч). Затем бульонные культуры бактериологической петлей высевают бляшками (штрихами) на сектора L-агара с антибиотиками (Rif^r, Ap^r, Str^r) по 10 мкг/мл и без них. Культивирование посевов на L-агаре при 35 - 37^oC осуществляют в течение 3 сут. Учет результатов роста испытуемой и контрольных культур на средах с различными антибиотиками проводят через 48 - 72 ч.

На средах с антибиотиками Ap10 и Rif10 растет только культура B. subtilis РАС; на среде с St10 - также B.subtilis РАС и иногда единичные колонии B. subtilis 534, в то время как на L-агаре без антибиотика растут оба штамма: B. subtilis РАС и B. subtilis 534.

Пример 2. Определение антагонистической активности бацилл B. subtilis РАС и прототипа B. subtilis 534 по отношению к патогенным микроорганизмам (табл. 2) осуществляли с помощью теста "отсроченного антагонизма" (Константинов Г. Лизоцим. Определение активности лизоцима. Экспериментальная микробиология. Под ред. С. Бырдарова. София: Медицина и физкультура, 1965, с. 327), модифицированного нами.

Для определения антибактериальной активности бацилл B. subtilis РАС и B. subtilis 534 делали посев бляшками (3 - 4 мм в диаметре) взвеси спор испытуемых культур на сектора чашек с BHI (фирмы "Дифко") агаром (количество засеянных чашек должно соответствовать количеству индикаторных культур - т.е. 6). Бляшки подращивали при 37^oC в течение 48 - 72 ч (размеры их увеличиваются до 15 - 25 мм в диаметре). Чашки с выросшими бляшками подвергали обработке парами хлороформа - для этого в крышку каждой перевернутой чашки с бляшками добавляли 15 - 20 капель хлороформа и затем помещали их в эксикатор с крышкой (хлороформирование должно осуществляться не менее 2 ч, но можно сутки и более). Затем чашки вынимали из эксикатора, проветривали от паров хлороформа.

В расплавленный и остуженный до 45^oC 0,5% BHI агар (по 3 мл в пробирке) засевали 0,1 мл суточной бульонной культуры 1 - 6 (табл. 2) и наносили (раскатывали) на поверхности BHI агара с хлороформированными бляшками, но так, чтобы 0,5% BHI агар не попал на поверхность бляшек, а только соприкасался с их краями. Чашки с посевами культур B. anthracis, V. cholerae. P. pseudomallei помещали в термостат на 24 ч при 37^oC, а Y. pestis EV - при 28^oC.

Учет результатов "отсроченного антагонизма" B. subtilis РАС и B. subtilis 534 по отношению к культурам возбудителей особо опасных инфекций осуществляют в течение 2 сут. по зонам просветления (лизиса) газонов вокруг бляшек B. subtilis.

В данном примере антагонистическая активность B. subtilis РАС по отношению к патогенным видам микроорганизмов (табл. 2) в тесте "отсроченного антагонизма" проявляется так же, как и у B. subtilis 534.

Таким образом, представленный штамм B. subtilis РАС-КМ-115 проявляет ингибирующую активность по отношению к патогенным видам микроорганизмов и обладает множественной (Rif^r, Ap^r, Str^r) лекарственной устойчивостью, что позволяет конструировать на его основе антибиотикорезистентный пробиотик для лечения и профилактики инфекционных заболеваний при одновременной антибиотикотерапии.

Изобретение относится к микробиологии. Получен штамм Bacillus subtilis РАС КМ-115, резистентный к рифампицину, ампициллину и стрептомицину, обладающий антибактериальной активностью. Штамм проявляет ингибирующую активность по отношению к патогенным видам микроорганизмов и обладает множественной лекарственной устойчивостью. Это позволяет конструировать на его основе антибиотикорезистентный пробиотик для лечения и профилактики инфекционных заболеваний при одновременной антибиотикотерапии. 2 табл.

Штамм Bacillus subtilis РАС-КМ115 (Российская коллекция патогенных бактерий "Микроб"), резистентный к рифампицину, ампициллину и стрептомицину, обладающий антибактериальной активностью по отношению к патогенным видам микроорганизмов.