СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ СИМБИОЗА КЛЕТОК ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ С САПРОФИТОМ МУХОСОССUS XANTHUS Российский патент 2003 года по МПК C12Q1/02 G09B23/28 C12Q1/70 

Изобретение относится к микробиологии и экологии, в частности к способам моделирования симбиоза (биоценоза) возбудителя чумы с сапрофитными микроорганизмами и последующего выявления единичных клеток Y.pestis в этом симбиозе.

Чума относится к особо опасным инфекционным болезням человека. По современным представлениям грызуны (крысы, сурки, суслики и др.) являются естественной средой обитания возбудителя чумы в природе, а местности, где существуют эпизоотии чумы среди грызунов, - природными очагами этой инфекции. В передаче возбудителей среди грызунов и от них к человеку основную роль играют их эктопаразиты - блохи.

Однако зарегистрированы большие по площади участки или районы с проявлением очаговости чумы, в которых по каким-то причинам исчез основной носитель или отсутствует переносчик, но чума проявляется в форме эпизоотии или одиночных заражений случайных носителей (Прикаспийский Северо-западный очаг. Забайкальский очаг, отдельные участки в Закавказском высокогорном очаге). Проявление первичной чумы обычно привязано к мезофильным участкам в ксероморфном ландшафте с повышенным или избыточным увлажнением. Такие наблюдения свидетельствуют о возможности заражения животных после межэпидемического периода помимо эпизоотического процесса, что по-видимому позволяет утверждать об иной естественной среде обитания возбудителя чумы в неактивные периоды очага. Так, помимо эпизоотического процесса, существуют различные представления о механизмах энзоотии чумы, поддерживающих устойчивость:
1) теллурическая, эндогенная чума - переживание микроба в почве от нескольких месяцев до 3 лет (1, 2, 3);
2) сохранение возбудителя чумы в экскрементах блох в норах грызунов (4),
3) существование микроба рода Yersinia в растениях с рассмотрением эпидемиологических аспектов экологии (5),
4) внутриклеточное существование Y. pestis в почвенных простейших (амебах) при их совместном культивировании (6).

Известно, что патогенные почвенные микроорганизмы (возбудители сапронозов) находятся в симбиотических взаимоотношениях с различными сапрофитами, к которым относится и представитель скользящих бактерий Myxococcus xanthus. Этот убиквитарно распространенный микроорганизм подробно охарактеризован в "кратком определителе бактерий Берги" (7). M.xanthus формирует популяцию, состоящую из клеток с различными физиологическими функциями. При этом миксобактерии никогда не существуют как отдельные клетки, а формируют многоклеточные образования в виде плодовых тел. Клетки популяции миксококков секретируют тяжи слизи - "струи", которые направляют движение совокупности клеток. Такая колония (плодовое тело) окружает клетки гетерологичных микроорганизмов и заключает их в своеобразные складки, называемые "карманами". В них происходит как питание миксокков продуктами метаболизма захваченных клеток, так и сохранение последних.

Миксобактерии чаще всего встречаются в почве; они растут на разлагающемся растительном материале - траве, листьях, коре живых деревьев или помете животных.

В лабораторных условиях для культивирования миксококков и формирования плодовых тел с хорошей подвижностью необходимо использовать агар с кроличьим пометом - АТП по Mс Curdy или агаризованную среду СЭК - среда с Esoherichia coli.

Известно (8), что многие грызуны являются копрофагами, т.е. животными поедающими свой (первичный) помет. Этот факт позволяет считать, что большое количество помета грызунов в отнорках, которые обнаруживают зоологи при раскопках нор, нужно считать не "туалетами" зверьков, а своеобразными "запасниками продовольствия".

Убиквитарно распространенный M.xanthus, обнаруживаемый на помете грызунов, может иметь определенное значение в биоценозе M.xanthus и Y.pestis и в эпидемиологии заболевания чумой.

Для выявления единичных клеток Y.pestis в плодовых телах M.xanthus не пригодны обычные (традиционные) методы лабораторной диагностики возбудителя чумы из различного материала объектов: бактериоскопический, биологический, бактериологический, серологический.

Бактериоскопический метод не годится, поскольку морфологии клеток M. xanthus и Y. pestis могут совпадать и в мазке-препарате выявить клетки Y. pestis среди множества клеток M.xanthus не представляется возможным.

Биологический метод не пригоден для выявления клеток Y.pestis в биомассе плодового тела M. xanthus, поскольку единичные клетки Y.pestis, экранированные слизью плодового тела, приобретают свойства пониженной вирулентности и заражение биопробного животного таким материалом невозможно.

Бактериологический метод для выявления единичных клеток Y.pestis в плодовых телах M.xanthus не пригоден, поскольку культуральные свойства M.xanthus по сравнению с Y.pestis более высокие и очиститься от слизи плодовых тел M. xanthus даже на селективных средах не представляется возможным.

Серологические методы, даже такие высокочувствительные, как РПГА и ИФА, также не пригодны для выявления единичных клеток Y.pestis в плодовых телах M. xanthus, поскольку с помощью этих реакций диагностируются только от n•10³ до 10⁵ клеток возбудителя.

Домарадским И.В. с соавт. (9) предложена методика выявления возбудителя чумы в исследуемом материале с помощью нарастания титра фага (РНФ).

По данным авторов, диагноз чумы этим методом можно поставить через 5-6 ч при условии, если в исследуемом объекте имеется не менее 1 млн микробных клеток в 1 мл.

При постановке РНФ в модификации Арутюнова Ю.И. (9) чувствительность метода - 500 тыс.- 1 млн микробных клеток в 1 мл.

Эти две методики РНФ могут служить аналогами методу нарастания титра фага, предлагаемому нами, однако у РНФ Домарадского И.В. с соавт. и у модифицированного метода Арутюнова Ю.И. слишком низкая чувствительность, не позволяющая выявлять единичные клетки Y.pestis в нашей модели.

Только современный метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) пригоден для выявления ДНК единичных бактериальных клеток в загрязненной среде, но для этого нужно располагать соответствующими праймерами и дорогостоящей аппаратурой. Этот метод может служить прототипом предлагаемому нами методу РНФ.

Целью настоящего изобретения является создание биологической модели симбиоза патогенного микроорганизма (Y.pestis) с убиквитарно распространенным сапрофитом (M. xanthus), позволяющей наиболее полно воспроизвести экологические закономерности биоценоза этих микроорганизмов в природе, при этом разработать метод выявления единичных клеток возбудителя чумы в биомассе этого сообщества.

Для достижения поставленной цели на поверхность плотной питательной среды в чашке Петри засевают штрихами культуру Y.pestis в виде подковы, a M. xanthus - в виде короткого штриха в центре подковы (см. схему - Пример 1). Засеянные культуры микроорганизмов предварительно подращивают в термостате при 28^oС в течение 48-72 ч до появления на поверхности агара роста культуры M. xanthus в виде струй и отдельных скоплений, называемых плодовыми телами. Струи с плодовыми телами M.xanthus пересекают штрихи биомассы Y.pestis, при этом в складки-карманы плодовых тел, оказываются включены клетки возбудителя чумы. Часть клеток Y.pestis лизируются внутри плодовых тел, а некоторые клетки возбудителя чумы адаптируются к новой среде обитания, персистируют в ней и даже размножаются, т.е. проявляют симбиоз.

Для выявления клеток Y.pestis в плодовых телах M.xanthus, бактериологическую петлю массы плодового тела M.xanthus, предположительно содержащей единичные клетки возбудителя чумы, засевают в питательный бульон и культивируют в термостатированном шейкере при 28^oC с 80-100 качаниями в минуту в течение 6 ч. Затем в бульонную культуру смеси клеток M.xanthus и предположительно Y.pestis добавляют оттитрованный специфический бактериофаг к клеткам возбудителя чумы в количестве n•10³ фаговых частиц в 1 мл смеси. Смесь, содержащую бактериальные клетки и бактериофаг, культивируют еще 6 ч в том же режиме. К 5 мл смеси добавляют 1 мл хлороформа, эмульгируя его до появления молочного цвета и оставляют на 5 ч для осаждения хлороформа и убитых хлороформом бактериальных клеток. В надосадочной жидкости определяют концентрацию фаговых частиц по Грациа. Возросшая концентрация фага в пробе в сто и более раз опосредованно свидетельствует о наличии клеток Y.pestis, в которых репродуцировался специфический фаг.

Предлагаемый нами метод выявления клеток Y.pestis в плодовых телах M. xanthus позволяет обнаружить единичные клетки возбудителя чумы за счет предварительного инкубирования в пермессивных условиях исследуемых проб до внесения в них специфического фага. Эта процедура аналогична способу амплификации ДНК в пробе при постановке ПЦР.

ПРИМЕР 1.

Для моделирования симбиоза клеток возбудителя чумы с сапрофитом M.xanthus на поверхности плотной питательной среды (агар Луриа) в чашке Петри посеяли штамм Y.pestis EV штрихами в виде подковы, a M.xanthus в виде короткого штриха в центре подковы (см. схему в конце описания).

Посев культур микроорганизмов предварительно подращивали в термостате при 28^oС в течение 48-72 ч до появления на поверхности агара роста культуры M.xanthus в виде струй и отдельных скоплений с биомассы, называемых плодовыми телами. Поскольку штамм Y.pestis EV обладает пестициногенностью (pst I), в первые 24 ч подращивания струи M.xanthus не могут пересечь штрих-посев Y. pestis, но в последующие 48 ч в популяции клеток M.xanthus появляются физиологически активные клетки, преодолевающие пестициногенность, и струи с плодовыми телами M. xanthus пересекают штрихи Y.pestis, при этом в складки-карманы плодовых тел оказываются включены клетки возбудителя чумы. Часть клеток Y.pestis лизируются внутри плодовых тел, а некоторые клетки возбудителя чумы, обладающие антилизоцимной активностью, адаптируются к новой среде обитания, персистируют в ней и даже размножаются, т.е. проявляют симбиоз.

ПРИМЕР 2.

Для выявления клеток Y.pestis EV в плодовых телах M.xanthus бактериологическую петлю массы плодового тела M.xanthus, предположительно содержащей единичные клетки Y. pestis EV (Пример 1), засеяли в питательный бульон BHI (фирмы "Difco") и культивировали в термостатированном шейкере при 28^oC с 80-100 качаниями в минуту в течение 6 ч. Затем в бульонную культуру смеси клеток M.xanthus и предположительно Y.pestis EV добавили оттитрованный специфический бактериофаг Л-413 5•10³ фаговых частиц в 1 мл смеси. Смесь, содержащую бактериальные клетки и бактериофаг, культивировали еще 6 ч в том же режиме. К 5 мл смеси добавили 1 мл хлороформа, эмульгируя его до появления молочного цвета, и оставили на 5 ч для осаждения хлороформа и убитых бактериальных клеток. В надосадочной жидкости определили концентрацию фаговых частиц по Грациа. Возросшая концентрация фага в пробе до 2,5•10⁶ фаговых частиц в 1 мл косвенно (опосредованно) свидетельствовала о наличии клеток Y. pestis EV, в которых репродуцировался фаг Л-413.

ПРИМЕР 3.

Для определения чувствительности метода РНФ при выявлении единичных клеток Y.pestis среди клеток бактериальной массы плодовых тел M.xanthus, клеток почвенных микроорганизмов, воздушной микрофлоры, кишечной палочки и палочек псевдотуберкулеза в 3 колбы с 50 мл среды BHI (фирмы "Difco") внесли по 1 бактериологической петле биомассы плодовых тел M.xanthus; по 2 мл смыва питательным бульоном с поверхности пола коридора лаборатории; по 1 бактериологической петле биомассы E.coli С и по 1 петле биомассы Y.pseudotuberculosis 36. В первую колбу добавили 5-10 клеток оттитрованной культуры Y.pestis EV; в другую - n•10² клеток Y.pestis EV, и в третью колбу внесли n•10³ клеток Y. pestis EV. Все три бактериальные смеси, содержащие различные количества клеток Y.pestis EV, культивировали в термостатированном шейкере при 28^oC с 80-100 качаниями в минуту в течение 6 ч. Затем в каждую из 3-х колб добавили оттитрованный специфический бактериофаг Л-413 до 5,5•10³ фаговых частиц в 1 мл смеси. Смеси культивировали еще 6 ч в том же режиме. После этого из каждой колбы взяли по 5 мл смеси и добавили по 1 мл хлороформа, эмульгируя его до появления молочного цвета. Пробы оставили на 18 ч для осаждения хлороформа и убитых бактериальных клеток. В надосадочных жидкостях каждой пробы определили концентрации фаговых частиц по Грациа. Концентрации фага оказались во всех пробах практически одинаковыми 4,8•10⁶; 1,2•10⁷; 6•10⁶ фаговых частиц в 1 мл, т.е. фаг репродуцировался в размножившихся клетках Y.pestis EV, а посторонняя микрофлора в смесях на эту репродукцию не повлияла.

Таким образом, созданная биологическая модель симбиоза патогенного микроорганизма (Y. pestis) с убиквитарно распространенным сапрофитом (M. xanthus), позволяющая наиболее полно воспроизвести экологические закономерности биоценоза этих микроорганизмов в природе, а также разработка метода выявления единичных клеток возбудителя чумы в биомассе этого сообщества могут служить способом для изучения экологических систем с определением экологической валентности компонентов, что важно для разрешения эпидемиологических проблем.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Baltazard M. La conservation de la peste en.foger invitere // Med. et Hyg., -1964-vol.22., P.172-174.

2. Mollaret H. Les causes de l'inveteration de la peste dans ses foyers naturels // Bull.Soc.pathol. exot.-1971-vol.64, 5.-Р.713-716.

3. Сорокин Ю.И., Найманов П.И., Иванова Д.П., Маевский М.П. К методике экспериментальных наблюдений за размножением патогенных микробов // Проблемы природных очагов чумы.- Иркутск, 1980-ч2-С.95-96.

4. Величко Л.Н., Кодрашкина К.И. Свойства возбудителя чумы после длительного пребывания в сухих экскрементах и трупах блох. // Вопр.эпизоотолог. природно-очаговых инф. (Труды противочумн.учреждений СССР).-Саратов., 1984. -С.34-39.

5. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.Т. и др. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. -M., 1998.-80с.

6. Никульшин С.В., Онацкая Т.Г., Луканина Л.М. и др. Изучение ассоциаций почвенных амеб Hartmannella rhysodes... // Журн.микробиол.-1992 - 9-10.С. 2-4.

7. Хоулт Дж. Краткий определитель Берги. Скользящие бактерии. M.: Мир, 1980.-C.49-53.

8. Петровская В.Г., Марко О.П. Микрофлора человека в норме и патологии. M.: Медицина, 1976-С.8-22.

9. Тинкер И.С., Макаровская Л.Н., Алешина Е.Н. Чума.// Диагностика особо опасных и малоизвестных инфекций. -Ростов-н/Д.-1970.-С.56-58.

Изобретение относится к микробиологии и экологии, в частности к способам моделирования симбиоза (биоценоза) возбудителя чумы с сапрофитными микроорганизмами и последующего выявления клеток Yersinia pestis в этом симбиозе. На поверхность плотной питательной среды засевают штрихами культуры Y. pestis и Myxococcus xanthus в определенной аранжировке. После подращивания посевов при 28^oС в течение 48-72 ч в складках-карманах плодовых тел M. xanthus оказываются включены клетки возбудителя чумы. Часть клеток Y. pestis лизируется внутри плодовых тел, а некоторые клетки возбудителя чумы адаптируются к новой среде обитания, персестируя в ней, и даже размножаются, т.е. проявляют симбиоз. Для выявления клеток Y. pestis в плодовых телах M. xanthus используется метод нарастания титра фага (РНФ). Пробы бактериальной массы плодовых тел M. xanthus, предположительно содержащие единичные клетки возбудителя чумы, предварительно инкубируют в пермессивных условиях до внесения в них специфического фага определенной концентрации. Затем смесь, содержащую бактериальные клетки, и бактериофаг еще раз культивируют в том же режиме. После этого к смесям проб добавляют хлороформ. В надосадочной жидкости определяют концентрацию фазовых частиц по Грациа. Возросшая концентрация фага в пробе в сто и более раз опосредованно свидетельствует о наличии клеток Y. Pestis, в которых репродуцировался специфический фаг. Наличие в пробах посторонней микрофлоры: почвенных микроорганизмов, воздушной флоры, кишечной и псевдотуберкулезной палочек, не мешает учету результатов. Созданная биологическая модель симбиоза патогенного микроорганизма (Y. pestis) с убиквитарно распространенным сапрофитом (M. xanthus), а также разработка метода выявления единичных клеток возбудителя чумы в биомассе этого сообщества могут служить для изучения экологических систем с определением экологической валентности компонентов, что важно для разрешения эпидемиологических проблем. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ моделирования симбиоза клеток возбудителя чумы с сапрофитом Myxococcus xanthus, включающий посев на плотную питательную среду патогенного и сапрофитного микроорганизмов для их совместного роста, причем посев микроорганизмов на поверхность агара осуществляют штрихами в определенной аранжировке Yersinia pestis в виде подковы, а M. xanthus - в виде короткого штриха внутри подковы, инкубирование в термостате при температуре, типичной для роста, в течение 48-72 ч до появления на поверхности агара роста M. xanthus в виде струй с плодовыми телами, предположительно содержащими клетки Y. pestis, с последующим отбором проб биомассы плодовых тел M. xanthus для опосредованного выявления единичных клеток возбудителя чумы. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что опосредованное выявление единичных клеток возбудителя чумы в биомассе плодовых тел M. xanthus осуществляют путем высевания отобранных проб в питательный бульон и культивирования в шейкере при температуре, типичной для роста, с 80-100 кач/мин в течение 5-6 ч, с последующим добавлением в бульонную культуру смеси бактерий оттитрованного специфического бактериофага из расчета 1-5•10³ фаг. ч. /мл смеси и культивированием ее в течение 5-6 ч в том режиме, после чего к 5 мл смеси добавляют 1 мл хлороформа, эмульгируют до появления молочного цвета и оставляют пробы на 4-5 ч для осаждения хлороформа и убитых бактериальных клеток, определяют в надосадочной жидкости концентрацию фаговых частиц по Грациа и при увеличении концентрации репродуцированного фага в сто и более раз определяют наличие клеток возбудителя чумы в полученной биомассе плодовых тел M. xanthus, что свидетельствует о симбиозе клеток возбудителя чумы с M. xanthus.