НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ОСЕТРОВЫХ РЫБ И ПРОДУКЦИИ ИЗ НИХ Российский патент 2008 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к рыбной промышленности и молекулярной биологии, в частности к способам индентификации видовой принадлежности осетровых и получаемой из них икры и другой продукции. К настоящему времени были предложены следующие методики определения видовой принадлежности осетровых и продуктов их переработки на основании анализа митохондриальной ДНК.

Сайт специфический ПЦР на основании полиморфизма по гену цитохромоксидазы субъединицы В (CytB). Метод впервые предложен ДеСале и Бирштейном (DeSalle и Birstein. 1996), US Patent No. 5766144. July 28, 1998. European Patent No. 087690. August 28, 2002. Метод основан на использовании видоспецифичных праймеров по гену CytB. Достоинство предложенного метода - охватывает все виды осетровых мира (27 видов).

Недостатки. Низкая сайтоспецифичность праймеров, что вызывает высокий процент ложных срабатываний.

Небольшая выборка особей каждого из видов (для некоторых видов праймеры составлялись на основании последовательности одного экземпляра) и связанная с этим высокий процент ложнопозитивного сигнала.

Не позволяет дифференцировать сибирского и русского осетров (несущего «baerii-like» гаплотип).

Сиквенирование участка гена CytB. Метод предложен Файном и коллегами (National Fish and Wildlife Forensics Laboratory, Ashland), опубликован только в Интернете. Предполагает дорогостоящее сиквенирование каждого изучаемого образца. В настоящее время не актуален.

Рестрикционный анализ амплифицированного участка мтДНК (метод PCR-RFLP) предложен Людвигом и соавторами (Ludwig и др., 2002). Включает последовательное применение рестрикционных ферментов для идентификации видоспецифичных участков ПЦР-продукта с гена CytB. Достоинство: высокая воспроизводимость результатов. Недостатки: требует трудоемкой и дорогостоящей процедуры, включающей до 4-х реакций рестрикции и соответствующее количество визуализации продуктов рестриции методом электрофореза. Не позволяет дифференцировать сибирского и русского осетров (несущего «baerii-like» гаплотип).

Технической задачей заявленного изобретения является расширение спектра видоспецифических праймеров, позволяющих детекцию наличия митохондриальной ДНК видов осетровых рыб, обитающих на территории РФ.

Поставленная задача достигается набором олигонуклеотидных праймеров для определения видовой принадлежности осетровых рыб и продукции из них, причем олигонуклеотидный праймер выбирают со следующими нуклеотидными последовательностями:

Набор олигонуклеотидных праймеров для определения видовой принадлежности осетровых рыб и продукции из них, причем олигонуклеотидный праймер выбирают со следующими нуклеотидными последовательностями: обратный праймер AHR (TATACACCATTATCTCTATGT) для определения видовой принадлежности к осетровым рыбам, и прямые праймеры:

AGF (GCACAGACTATGTGGTATCCAGAA) для определения видовой принадлежности к русскому осетру,

ABF (CAGATGCCAGTAACAGGCTGA) для определения видовой принадлежности к русскому ("baerii-like" мтДНА гаплотип) и сибирскому осетрам,

ABRM (TGTCTGTCTAGAACATAtG) для определения видовой принадлежности к сибирскому осетру, HusF (TATCTATTACCTGCGAGCAGGCTG) для определения видовой принадлежности к белуге,

DauF (CCTCTTATGTACGCGGTGT) для принадлежности к калуге,

SchF (TGTGGGGTCACGGACTTTACAG) для принадлежности к амурскому осетру

NudF (TGTCTTTTCTGAAGGAGCTTTGC) для определения видовой принадлежности к шипу,

RutF (GGGAATAACCGTTAATTTGG) для определения видовой принадлежности к стерляди,

SteF (GGGGTTCTTGGCATGTTGTGAGCG) для определения видовой принадлежности к севрюге.

В результате большого количества последовательностей регулярного участка митохондриальной ДНК восьми основных видов осетровых рыб (русский, сибирский, амурский осетры, белуга, калуга, шип, стерлядь и севрюга) был создан набор видоспецифических праймеров, позволяющих детекцию наличия митохондриальной ДНК. Анализироваться могут как образцы ткани осетровых рыб (образцы плавника, мускулатуры, печени и т.д.), так и икры и других продуктов, получаемых из осетровых рыб, например балычная продукция.

Метод ПЦР-индентификации осетровых рыб включает выделение ДНК, проведение ПЦР и визуализацию продуктов ПЦР на агарозном геле.

Выведение ДНК.

Выделение ДНК может проводится любым общепринятым методом. Нами в работе применялось главным образом метод солевой экстракции (Aljanabi S М & Martinez I 1997. Universal and rapid salt-extraction of high quality gnomic DNA for PCR-based techniques. Nucleic Acids Research. 25 (20): 4692-4693) и выделение с помощью фенольного метода (Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.), а также на сорбентсодержащих колонках (Sigma). При выделении ДНК из икры перед лизированием необходимо удалить оболочку икринки, чтобы избежать последующее ингибирование ПЦР реакции полисахаридами яйцевой оболочки.

Проведение ПЦР (полимеразной цепной реакции).

Все ПЦР-реакции проводились в объеме 25 мкл при следующих условиях:

1х Taq-буфер (Силекс, Москва, состав: (10х) 700 мM Трис-HCl, рН 8.6/25°С, 166 мM (NH₄)₂SO₄, 25 мM MgCl₂, 2.5 мМ каждого dNTP (Диалат, Москва), 2,5-5 пикоМ праймеров (праймеры согласно табл. 1 и разбираемым ниже примерам), 2,8 мкл Креазол-глицерин (3,5 мM крезоловый красный, 50% водный раствор глицерина), 2,5U Taq-полимеразы (Силекс-М) и 2 мкл экстракта ДНК, воды (milliQ) до 25 мкл).

ПЦР реакция проводилась при следующих параметрах:

Предварительный отжиг при 95°С - 2 мин.

Отжиг 92°С - 20 сек.

Отжиг 57°С - 30 сек.

Синтез 72°С - 30 сек.

Всего 35 циклов.

Окончательный синтез 72°С 10 мин.

Получаемые в ходе реакции видоспецифичные ампликоны (продукты ПЦР) имеют следующие размеры (Табл.1, чертеж).

Праймеры разработаны таким образом, что имеется возможность постановки мультиплекной ПЦР-реакции, т.е. с добавлением более двух праймеров в реакционную смесь. Однако подбор условий ПЦР реакции и концентрации каждого из праймеров должен проводиться нВ каждой лаборатории самостоятельно. Нами рутинно используется набор для мультиплексной реакции на определение русского и сибирского осетров (AGF, ABF, ABRM, AHR) в пропорции 1:2:1:1 и тех же параметрах амплификации, что и для одиночных реакций.

Визуализация продуктов ПЦР на агарозном геле.

Продукт ПЦР наносится на 2% агарозный гель (0,5^х ТВЕ) и разгоняется 30 мин при напряжении 15 В/см. Определение видового состава проводится по наличию амплификата в реакции с праймерами, специфичными для данного вида. В реакциях с другими праймерами ПЦР продукт должен отсутствовать. Допускается нанесение в одну лунку продукт всех реакций данной особи. В этом случае видовая принадлежность определяется по длине ПЦР продукта. Для удобства определения вида в процессе тестирования была составлена смесь из ПЦР-продуктов всех возможных длин, получаемых в процессе реакции (138, 190, 215, 253, 266, 329, 374, 420 и 429 п.н.). Смесь ПЦР-продуктов наносится на агарозный гель одновременно с тестируемыми образцами и является реперным маркером молекулярной массы, позволяющим визуально идентифицировать результаты тестирования (см. чертеж).

Примеры использования набора олигонуклеотидных праймеров для определения видовой принадлежности осетровых рыб и продукции из них.

Пример 1. Подтверждение видовой принадлежности образца ткани, заявленной как русский осетр.

1. Выделяем ДНК из образца ткани солевым методом (Aljanabi and Martinez 1997) и ставим ПЦР 25 мкл при следующих условиях:

265 мкл 10^х Taq-буфер (состав: 10^х: 700 мM Трис-HCl, рН 8.6 / 25°С, 166 мM (NH₄)₂SO₄, 25 мM MgCl₂ Силекс, Москва), 2.5 мМ каждого dNTP (Диалат, Москва), 2,5 пМ праймеров AHR, AGF, и ABRM каждого, 10 пМ праймера ABF, 2,8 мкл Креазол-глицерин (3,5 мM крезоловый красный, 50% водный раствор глицерина), 2,5U Taq-полимеразы (Силекс-М) и 2 мкл экстракта ДНК, воды (milliQ) до 25 мкл).

ПЦР реакция проводилась при следующих параметрах:

Предварительный отжиг при 95°С - 2 мин.

Отжиг 92°С - 20 сек.

Отжиг 57°С - 30 сек.

Синтез 72°С - 30 сек.

Всего 35 циклов.

Окончательный синтез 72°С - 10 мин.

По окончании синтеза наносим на 2% агарозный гель 10 мкл реакционной смеси (0.5^хТВЕ), а также маркер молекулярной массы и проводим электрофорез при напряжении 15 В/см в течение 30 минут.

Присутствие на электрофореграмме одного ПЦР-продукта длиной 420 п.н. (как на дорожке 2 чертежа) свидетельствует, что изучаемый образец взят от особи русского осетра (A. gueldenstaedtii) с типичным гаплотипом. Присутствие продукта длиной только 215 п.н. (как на дорожке 3 чертежа) свидетельствует, что изучаемый образец взят от особи русского осетра (A. gueldenstaedtii) с гаплотипом "baeri-like". Присутствие на геле двух ПЦР-продуктов (215 и 138 п.н., дорожка 4 чертежа) говорит о том, что взятый образец принадлежит не русскому (A. gueldenstaedtii), а сибирскому осетру (А. baerii). Отсутствие ПЦР продукта может указывать как на то, что ДНК в образце деградирована (требуется проведение контроля чистоты, концентрации и фрагментной составляющей ДНК экстракта), так и на то, что образец принадлежит другим видам осетровых (проверка с другими праймерами из предлагаемого набора) или не принадлежит к осетровым.

Пример 2. Подтверждение видовой принадлежности образца ткани, заявленной как сибирский осетр (A. baerii).

Выделение ДНК, постановка ПЦР и визуализация продуктов ПЦР на агарозном геле проводится как в предыдущем примере. Два ПЦР-продукта длиной 138 и 213 п.н. (как на дорожке 4 чертежа) указывает на видовую принадлежность изученного образца к сибирскому осетру (A. baerii)

Пример 3. Подтверждение видовой принадлежности образца ткани, заявленной как шип (A. nudiventris).

Выделение ДНК, постановка ПЦР и визуализация продуктов ПЦР на агарозном геле проводится как в предыдущем примере, однако вместо указанных выше праймеров в реакционную смесь добавляется по 5 пМ праймеров AHR и NudF. Продукт длиной 331 п.н. (как на дорожке 8 чертежа) указывает на видовую принадлежность изученного образца к шипу (A. nudiventris).

Пример 4. Подтверждение видовой принадлежности образца ткани, заявленной как стерлядь (A. rutenus).

Выделение ДНК, постановка ПЦР и визуализация продуктов ПЦР на агарозном геле проводится как в предыдущем примере, однако вместо указанных выше праймеров в реакционную смесь добавляется по 5 пМ праймеров AHR и RutF. Продукт длиной 190 п.н. (как на дорожке 5 чертежа) указывает на видовую принадлежность изученного образца к стерляди (A. rutenus).

Пример 5. Подтверждение видовой принадлежности образца ткани, заявленной как калуга (Huso dauricus).

Выделение ДНК, постановка ПЦР и визуализация продуктов ПЦР на агарозном геле проводится как в предыдущем примере, однако вместо указанных выше праймеров в реакционную смесь добавляется по 5 пМ праймеров AHR и DauF. Продукт длиной 438 п.н. (как на дорожке 10 чертежа) указывает на видовую принадлежность изученного образца к калуге (Huso dauricus).

Пример 6. Подтверждение видовой принадлежности образца ткани, заявленной как амурский осетр (A. schrenkii).

Выделение ДНК, постановка ПЦР и визуализация продуктов ПЦР на агарозном геле проводится как в предыдущем примере, однако вместо указанных выше праймеров в реакционную смесь добавляется по 5 пМ праймеров AHR и SchF. Продукт длиной 246 п.н. (как на дорожке 10 чертежа) указывает на видовую принадлежность изученного образца к амурскому осетру (A. schrenkii).

Пример 7. Подтверждение видовой принадлежности образца пищевой икры, заявленной как икра севрюги (A. stellatus).

Выделение ДНК проводится согласно протоколу выделения солевым методом (Aljanabi and Martmez 1997) со следующей модификацией: икринка помещается в лизирующий буфер, раздавливается стерильным наконечником, и оболочка икринки извлекается из лизирующего р-ра. Постановка ПЦР и визуализация продуктов ПЦР на агарозном геле проводится как в предыдущем примере, однако вместо указанных выше праймеров в реакционную смесь добавляется по 5 пМ праймеров AHR и SteF. Продукт длиной 266 п.н. (как на дорожке 7 чертежа) указывает на видовую принадлежность изученного образца к севрюге (A. stellatus).

Пример 8. Подтверждение видовой принадлежности образца продукта переработки осетровых, заявленной как балык из филе белуги (Huso huso)

Выделение ДНК, постановка ПЦР и визуализация продуктов ПЦР на агарозном геле проводится как в предыдущем примере, однако вместо указанных выше праймеров в реакционную смесь добавляется по 5 пМ праймеров AHR и HusF. Продукт длиной 375 п.н. (как на дорожке 8 чертежа) указывает на видовую принадлежность изученного образца к белуге (Huso huso)

Пример 9. Определение видовой принадлежности образца ткани осетровых рыб неизвестного вида.

Выделение ДНК как в предыдущем примере. Выделенная ДНК служит матрицей для 6 ПЦР реакций: на определение русского и сибирского осетров (праймеры AHR, ABF, AGF, ABRM), амурского осетра (праймеры AHR и SchF), стерляди (праймеры AHR и RutF), севрюги (праймеры AHR и SteF), шипа (праймеры AHR и NudF), Калуги (праймеры AHR и DauF), белуги (праймеры AHR и HusF). Продукты всех ПЦР наносятся на смежные дорожки агарозного геля. В зависимости от того, в какой из реакций образовался ПЦР продукт, делается заключение о видовой принадлежности изучаемого образца. При использовании маркера молекулярных масс (в диапазоне 100-500 п.н.) возможно нанесение смеси всех ПЦР продуктов в одну дорожку геля. В этом случае определяется длина ПЦР продукта и в соответствии с табл.1 делается заключение о видовой принадлежности изучаемого образца.

Пример 10. Определение видовой принадлежности образца ткани осетровых рыб неизвестного вида, хранившегося не в оптимальных условиях и содержащего сильно деградированную ДНК (с использованием метода «гнездового ПЦР»).

Выделение ДНК как в предыдущем примере. ПЦР-диагностика проводится в два этапа методом «гнездового ПЦР» (nested PCR). На первом этапе проводиться амплификация участка митохондриальной ДНК большего размера, чем используется в тесте (с «наружных» праймеров). На втором этапе используется предлагаемый набор диагностических праймеров. Первый ПЦР проводится как в предыдущем примере, однако вместо указанных выше праймеров в реакционную смесь добавляется по 5 пМ праймеров DL651 (ATCTTAACATCTTCAGTG) и AHR3 (CATACCATAATGTTTCATCTACC).

ПЦР реакция проводилась при следующих параметрах:

Предварительный отжиг при 95°С - 2 мин.

Отжиг 92°С - 20 сек.

Отжиг 52°С - 30 сек.

Синтез 72°С - 30 сек.

Всего 35 циклов.

Окончательный синтез 72°С 10 мин.

Второй цикл ПЦР реакций проводится как в примере 9, но вместо экстракта ДНК в качестве матрицы используется 1 мкл продукта первой ПЦР реакции. Визуализация и заключение о видовом составе проводиться как в примере 9.

Таблица 1.Последовательности праймеров используемые для видовой идентификации и характеристика получаемого ПЦР-продуктаНазваниеПоследовательностьИспользуется сДлина продуктаВидоспецифичностьAHRTATACACCATTATCTCTATGTAHR Все видыAGFGCACAGACTATGTGGTATCCAGAAAHR420русскийABFCAGATGCCAGTAACAGGCTGAAHR215Русский (baerii-like) и сибирскийABRMTGTCTGTCTAGAACATATGABF138сибирскийHusFTATCTATTACCTGCGAGCAGGCTGAHR374белугаDauFCCTCTTATGTACGCGGTGTAHR439калугаNudFTGTCTTTTCTGAAGGAGCTTTGCAHR329шипRutFGGGAATAACCGTTAATTTGGAHR190стерлядьSteFGGGGTTCTTGGCATGTTGTGAGCGAHR266севрюгаSchFTGTGGGGTCACGGACTTTACAGAHR254амурский осетр

Изобретение относится к области молекулярной биологии. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров для определения видовой принадлежности осетровых рыб со следующими нуклеотидными последовательностями:

обратный праймер AHR (TATACACCATTATCTCTATGT) для определения видовой принадлежности к осетровым рыбам и прямые праймеры:

AGF (GCACAGACTATGTGGTATCCAGAA) для определения видовой принадлежности к русскому осетру,

ABF (CAGATGCCAGTAACAGGCTGA) для определения видовой принадлежности к русскому и сибирскому осетрам,

ABRM (TGTCTGTCTAGAACATAtG) для определения видовой принадлежности к сибирскому осетру, HusF (TATCTATTACCTGCGAGCAGGCTG) для определения видовой принадлежности к белуге,

DauF (CCTCTTATGTACGCGGTGT) для определения видовой принадлежности к калуге,

SchF (TGTGGGGTCACGGACTTTACAG) для определения видовой принадлежности к амурскому осетру

NudF (TGTCTTTTCTGAAGGAGCTTTGC) для определения видовой принадлежности к шипу,

RutF (GGGAATAACCGTTAATTTGG) для определения видовой принадлежности к стерляди,

и SteF (GGGGTTCTTGGCATGTTGTGAGCG) для определения видовой принадлежности к севрюге.

Изобретение может быть использовано для детекции наличия митохондриальной ДНК одного из восьми видов осетровых рыб. 1 ил., 1 табл.

Набор олигонуклеотидных праймеров для определения видовой принадлежности восьми видов осетровых рыб и продукции из них, причем олигонуклеотидный праймер выбирают со следующими нуклеотидными последовательностями:

обратный праймер AHR (TATACACCATTATCTCTATGT) для определения видовой принадлежности к осетровым рыбам и прямые праймеры:

AGF (GCACAGACTATGTGGTATCCAGAA) для определения видовой принадлежности к русскому осетру,

ABF (CAGATGCCAGTAACAGGCTGA) для определения видовой принадлежности к русскому ("baerii-like" мтДНА гаплотип) и сибирскому осетрам,

ABRM (TGTCTGTCTAGAACATAtG) для определения видовой принадлежности к сибирскому осетру, HusF (TATCTATTACCTGCGAGCAGGCTG) для определения видовой принадлежности к белуге,

DauF (CCTCTTATGTACGCGGTGT) для определения видовой принадлежности к калуге,

SchF (TGTGGGGTCACGGACTTTACAG) для определения видовой принадлежности к амурскому осетру,

NudF (TGTCTTTTCTGAAGGAGCTTTGC) для определения видовой

принадлежности к шипу,

RutF (GGGAATAACCGTTAATTTGG) для определения видовой принадлежности к стерляди и

SteF (GGGGTTCTTGGCATGTTGTGAGCG) для определения видовой принадлежности к севрюге.