СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДНК-ДИАГНОСТИКИ НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ ЖИЗНЕННОГО ЦИКЛА ГЕЛЬМИНТОВ-ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ФАСЦИОЛЕЗА ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ Российский патент 2009 года по МПК C12Q1/68 

Настоящее изобретение относится к области молекулярной генетики, в частности к диагностике гельминтозов человека и животных, к генотипированию и видовой идентификации на разных стадиях жизненного цикла возбудителей фасциолеза животных и человека - печеночного сосальщика F.hepatica и F.gigantica (класс Tremanoda, отряд Fasciolata, семейство Fasciolidae), и диагностическим тестам и к наборам для них.

Фасциолез относится к числу наиболее опасных гельминтозов и вызывается двумя видами печеночного сосальщика - Fasciola hepatica и Fasciola gigantica, паразитирующих в желчных протоках печени домашних животных и человека. Обычно фасциолез поражает крупный и мелкий рогатый скот, однако, наблюдаемые в последние десятилетия изменения окружающей среды и вызванные этим изменения поведения человека резко повысили риск заражения человека фасциолезом. По сообщению ВОЗ, в 2006 году на земном шаре около 2.4 млн человек были инфицированы, а более 180 млн человек находились в стадии риска (Report of the WHO Informal meeting on use of triclabendazole in fasciolasis control, WHO head gasters, Geneva, Switzerland, 17-18 Oktober 2006). F. hepatica является видом-космополитом, распространившимся на территории всех пяти континентов и обитающим в районах с климатом, достаточно влажным для выживания его промежуточного хозяина - моллюска. В Европе, Америке и Океании обитает только F. hepatica, тогда как в Африке и Азии ареал этого вида перекрывается с ареалом близкого вида F. gigantica (Mas-Coma et al., 2003). Оба вида имеют ряд незначительных морфологических и анатомических различий, что затрудняет видовую диагностику паразита. Кроме того, видовая идентификация осложняется наличием переходных форм в зонах симпатрического обитания, например в Узбекистане, Туркменистане, Египте, Иране и странах и Юго-Восточной Азии (Adlard et al., 1993; Hashimoto et al., 1997; Itagaki et al., 1998, 2001; Itagaki and Tsutsumi, 1998).

Природные очаги фасциолеза поддерживаются за счет многочисленных диких копытных, грызунов и зайцеобразных. Промежуточными облигатными хозяевами печеночного сосальщика являются пресноводные моллюски из семейства Lymnaeidae, в основном малый прудовик Lymnaea truncatula (Скрябин, 1948, Т. 1, стр.135, Вогау 1978). В жизненном цикле печеночного сосальщика, как и большинства трематод, происходит чередование одного гермафродитного и двух партеногенетических поколений. При этом личиночные стадии - мирацидии и церкарии - осуществляют расселение паразита, а партеногенетические поколения во много раз увеличивают число потомков одного мирацидия. В позвоночном животном паразитируют продуцирующие яйца взрослые гермафродитные особи печеночного сосальщика - мариты. При попадании в воду из яиц выходят подвижные личинки (мирацидии), которые при попадании в тело второго обязательного промежуточного хозяина (моллюска) превращаются в материнскую спороцисту, отрождающую несколько партеногенетических поколений дочерних редий. В них созревает огромное число подвижных личинок - церкарии, которые покидают моллюска и инцистируются на различных подводных растениях и предметах, превращаясь в адолескарии. Окончательный хозяин заражается, заглатывая с водой церкарии или употребляя в пищу растения с адолескариями (Гинецинская и Добровольский, 1978, стр.64).

Ранее для изучения внутри - и межвидовой молекулярно-генетической изменчивости фасциол двух видов, а также промежуточных форм Fasciola sp.использовали полиморфизм отдельных генов мтДНК и участков рДНК. Эти исследования были направлены, главным образом, на видовую идентификацию марит печеночного сосальщика из японских и корейских популяций, так как в странах Азии обитают оба вида F. hepatica и F.gigantica, а также ряд промежуточных форм с неизвестным видовым статусом {F. sp.). Для сравнения в большинстве случаев использовали межвидовые различия в паттернах, полученных с помощью полимеразной цепной реакции с последующей обработкой продуктов амплификации рестриктазами (ПЦР-ПДРФ) или же определение первичной нуклеотидной последовательности двух митохондриальных генов nadl и coxl на немногочисленных образцах F. hepatica из Уругвая и Австралии и F. gigantica - из Замбии, Индонезии, Малайзии и Таиланда (Hashimoto et al., 1997, Agatsuma et al., 2000; Itagaki et al., 2001). Ограниченная внутривидовая вариабельность печеночных сосальщиков была установлена рядом авторов при изучении вариабельности второго внутреннего транскрибируемого спейсера рДНК - ITS2 (Adlard et al., 1993, Hashimoto et al., 1997; Itagaki and Tsutsumi, 1998, Semyenova et al., 2005).

В наиболее ранних исследованиях для детекции личинок фасциол на стадии моллюска использовали в блот-гибридизационных экспериментах в качестве проб повторяющиеся участки генома F. hepatica (Heussler et al, 1993). В более поздних исследованиях для этих же целей использовали различные варианты полимеразной цепной реакции с набором специфических олигонуклеотидных проб, комплементарных последовательностям участка гена малой субъединицы рРНК у представителей каждого из видов F. hepatica (Shubkin et al., 1992; Rognlie et al., 1994; Magalhaes et al., 2004) или F. gigantica (Velusamy et al., 2004), участка митохондриального гена coxl F. hepatica (Cucher et al., 2006).

Для диагностики фасциолеза использую копрологические и серологические тесты, которые зачастую выявляют неспецифическую картину, что значительно затруднено ввиду отсутствия специфической иммунной реакции.

Наиболее перспективным направлением оказались молекулярные тест-системы для диагностики фасциолеза и выявления его носителей на стадии обязательного промежуточного хозяина - моллюска, позволяющие выявлять природные очаги и изучать динамику переноса инвазий. Однако известные способы молекулярной диагностики фасциолеза разработаны лишь для каждого из видов в отдельности и являются малоэффективными и трудоемкими.

Наиболее близким к предлагаемому способу дифференциальной диагностики на разных стадиях жизненного цикла гельминтов-возбудителей фасциолеза человека и животных является молекулярная тест-система, разработанная в настоящее время только для обнаружения в биологических образцах ДНК различных видов возбудителей шистосоматоза (род Schistosoma) человека (патент США 6818402, 16 ноября 2004).

Недостатками известного способа является невозможность идентификации двух видов фасциол, и тем более на разных стадиях жизненного цикла.

Задачей предлагаемого изобретения является создание быстрого, простого и надежного способа для одновременной возможности детекции фасциол и их видовой идентификации на разных стадиях жизненного цикла, включая стадию моллюска и использовании в качестве генетического маркера ранее неизвестной для двух видов фасциол консервативной последовательности некодирующего участка митохондриальной ДНК.

В результате использования предлагаемого биологического маркера появляется возможность быстрой детекции и видовой идентификации возбудителей фасциолеза на разных стадиях жизненного цикла паразита, что значительно повышает эффективность санитарно-эпидемиологических мероприятий, направленных на выявление природных очагов фасциолеза и разработку методов борьбы с ними.

Вышеуказанный результат достигается тем, что в предлагаемом способе дифференциальной ДНК-диагностики на разных стадиях жизненного цикла гельминтов-возбудителей фасциолеза человека и животных, включающем выделение ДНК возбудителя, амплификацию мишени с использованием видоспецифических праймеров, ПЦР и эдектрофоретическое разделение, генотипирование и видовую дифференциацию возбудителей фасциолеза животных и человека - печеночных сосальщиков Fasciola hepatica и Fasciola gigantica проводят путем амплификации участков последовательности митохондриальной ДНК в образцах половозрелых гельминтов, принадлежащих к двум видам, и/или на ДНК инфицированных фасциолами пресноводных моллюсков из семейства Lymnaeidae с помощью полимеразной цепной реакции и использованием нескольких олигонуклеотидных праймеров (Multiplex PCR), затем разделяют указанные амплифицированные последовательности мтДНК с помощью электрофореза с получением образцов видоспецифичного электрофоретического паттерна гельминта, при этом на каждой из выделенных ДНК осуществляют ПЦР с набором из трех предлагаемых праймеров, а именно NR11, NR14, NR16, а полученные амплификационные продукты визуализируют и дифференцируют путем электрофореза в агарозном геле, и после окрашивания гелей бромистым этидием идентифицируют по размеру (длине) выявляемые полиморфные маркеры, где один фрагмент длиной 327 п.н. характерен для F. hepatica, а два фрагмента длиной 327 п.н. и 376 п.н встречается только у F.gigantica.

Результат достигается также тем, что биологический маркер, содержащий полиморфную ДНК и характеризующий видовую принадлежность двух возможных возбудителей фасциолеза - печеночных сосальщиков F. hepatica и F.gigantica, и представляющий собой нуклеотидную последовательность из группы 3 праймеров следующего состава

NR11 5′-TGGTTTGGTTTTATTAGGGAGATT-3′ NR14 5′-ТССАААТСТССАСАААСААААА-3′ NR16 5′-TATACTACCGAAACCACTAAACAC-3′

Результат достигается также тем, что используют набор для диагностики и видовой идентификации возбудителей фасциолеза, содержащий биологический маркер, реакционную смесь, состоящую из 60 мМ трис-HCl, 10 мМ сульфата аммония, 0,1% TWEEN 20, по 100 мкМ каждого dNTP, 0,5 мкМ MgCl₂, 0,9 единиц Taq-полимеразы и эталонные ДНК для каждого вида фасциол (положительный контроль).

В предлагаемом способе детекции и видовой идентификации на разных стадиях жизненного цикла возбудителей фасциолеза, включающем сбор образцов марит или образцов моллюска с предполагаемыми личинками фасциол, выделение ДНК из них, исследование геномной ДНК с помощью ПНР, ПЦР-анализ проводят, используя предлагаемый набор, визуализируют эти маркерные ДНК с помощью электрофореза в акриламидном или агарозном геле, а затем по отсутствию или присутствию в исследуемых образцах маркерных ДНК определяют наличие или отсутствие паразита в исследуемом образце моллюска, и на основании состава ПЦР-спектра, содержащего один (для F.hepatica) или два (для F.gigantica) маркерных фрагмента ДНК разного размера, определяют видовую принадлежность паразита. Размер амплифицируемых продуктов определяют с помощью маркера молекулярных масс (100 bp Ladder).

Способ дифференциальной ДНК-диагностики и видовой идентификации на разных стадиях жизненного цикла возбудителей фасциолеза, в том числе печеночного сосальщика F. hepatica и F. gigantica с применением предлагаемых биологических маркеров и набора осуществляют следующим образом.

Осуществляют геномное типирование гельминтов с использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР). В предлагаемом способе получают молекулярно-генетические характеристики представителей двух видов сосальщиков: F.hepatica и F.gigantica, находящихся на разных стадиях жизненного цикла, в том числе у взрослых половозрелых особей (марит) и личинок, паразитирующих в пресноводных моллюсках из семейства Lymnaeidae, наиболее распространенных на территории России.

Для этого собирают образцы взрослых фасциол, паразитирующих в печени крупного или мелкого рогатого скота, а также образцы пресноводных моллюсков из семества Lymnaeidae, выделяют из них ДНК, проводят амплификацию определенных участков ДНК с определенными праймерами, визуализируют полученную изменчивость с помощью электрофоретического разделения амплификатов, проводят типирование полученной изменчивости. На заключительном этапе визуально по наличию или отсутствию маркерных фрагментов ДНК определяют отсутствие или присутствие в теле моллюска-хозяина личинок печеночного сосальщика, и в случае присутствия личинок фасциол у инфицированного моллюска определяют видовую принадлежность паразита по наличию в амплифицируемом спектре одного или двух маркерных фрагментов, эталонных для каждого из двух видов. Сбор материала и консервация (фиксация) проб.

Для предотвращения деградации ДНК полученные образцы червей или образцы моллюска, освобожденного от раковины, замораживают при - 20°С, или помещают в 70% этиловый спирт (этиловый ректификованный, высшей очистки) и хранят в холодильнике в течение нескольких месяцев при низких плюсовых (+2-4°С) температурах. Для более продолжительного хранения пригодны кельвинаторы, поддерживающие температуру ниже - 50°С, а также жидкоазотные сосуды Дьюара.

Выделение ДНК

Для генотипирования взрослых половозрелых гельминтов выделяют ДНК из единичных особей, а для выделения ДНК из тела моллюска отсекают часть тела с панкреасом. Используют стандартные наборы для выделения ДНК из тканей, например, с помощью набора реагентов DIAtom™ Prep 200 (Москва) согласно инструкциям производителя. Набор реагентов Diatom™ DNA Ргер200 основан на использовании Лизирующего реагента с гуанидинтиоционатом, который предназначен для лизиса клеток, солюбилизации клеточного дебриса, а также для денатурации клеточных нуклеаз. В присутствии Лизирующего реагента ДНК эффективно сорбируется на NucleoS™-сорбенте, затем легко отмывается от белков и солей спиртовым раствором. ДНК, элюированная из сорбента раствором ЭкстраГеном Е™ или чистой водой, может напрямую использоваться по назначению.

Продолжительность выделения ДНК из тканей составляет 3-5 часов в зависимости от обрабатываемого материала.

Аналитический электрофорез

Для определения концентрации и качества выделенных образцов используют метод электрофореза в агарозном геле. Гель-электрофорез проводится в горизонтальной камере в 1^х трис-боратным буфере (ТВЕ), рН 7,5-7,8 (0,089 М трис-бората, 0,089 М борной кислоты и 0,002 М ЭДТА). При внесении ДНК в карманы геля используется буфер для нанесения (ксиленцианол, бромфеноловый синий и глицерин). После электрофореза гель окрашивают в растворе бромистого этидия в течение 5-10 минут или добавляют бромистый этидий непосредственно в гель. Вхождение ДНК в гель осуществляют при 20V в течение 15-20 минут, далее электрофорез ведут при 60V в течение 2-3 часов. В качестве маркера концентрации используется ДНК фага X, внесенная в разных количествах, например, 0,5; 1; 2 мкг.

Полимеразная цепная реакция (PCR).

1. Проведение PCR.

Выделенную ДНК используют в качестве матрицы в реакции амплификации.

Амплификацию со специфичными праймерами проводят по стандартной методике на термоциклере «MJ Research)) (USA), имеющем металлический нагревательный блок на 60 образцов. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержит 60 мМ трис-НС1, 10 мМ сульфата аммония, 0,1% TWEEN 20, по 100 мкМ каждого dNTP, 0,5 мкМ MgCl₂, 0,1 мкМ каждого праймера, 0,9 единиц Taq-полимеразы и 25-100 нг тотальной ДНК. Для проведения PCR используют три праймера следующего состава:

NR11 5′-TGGTTTGGTTTTATTAGGGAGATT-3′ NR14 5′-ТССАААТСТССАСАААСААААА-3′ NR16 5′-TATACTACCGAAACCACTAAACAC-3′

Для предотвращения испарения с поверхности раствора во время амплификации в каждую пробирку добавляют каплю (около 15 мкл) минерального масла. Каждый цикл полимеразной реакции состоит из следующих этапов денатурации (94°С, 2 мин), отжига (54°С, 1 мин) и элонгации (72°С, 2 мин). Циклы повторяются 35 раз. Первый цикл предваряли денатурацией в течение 5 минут при температуре 94°С. После окончательной достройки амплифицированной ДНК (72°С, 2 мин) температуру снижают до 4°С.

Электрофоретическое разделение продуктов и визуализация ПЦР-продуктов

Продукты амплификации подвергают электрофорезу в 1.5% агарозном геле толщиной 7-10 мм, содержащем бромистый этидий. В качестве маркеров молекулярного веса используется 100 bp Ladder (Fermentas). Вхождение в гель осуществляют при 20V в течение 20 минут, а разделение фрагментов - в течение 10-20 часов при 40-50V. Продукты амплификации фотографируют и определяют размер амплифицируемых продуктов с помощью маркера молекулярных масс (100 bp Ladder).

Отсутствие инфицированности личинками фасциол исследуемого образца моллюска подтверждается отсутствием в полученном амплификате фрагментов ДНК размером 327 п.н. или 376 п.н. При наличии амплифицируемого паттерна проводят определение видовой принадлежности гельминта, причем для спектра печеночного сосальщика F.hepatica характерен один фрагмент с размером в 327 п.н., а для вида F.gigantica - два фрагмента размером 327 п.н. и 376 п.н. По аналогичной схеме проводят проверку видовой принадлежности взрослых гельминтов.

Сущность предлагаемого способа поясняется фиг.1 и 2.

На фиг.1 представлен набор полиморфных ДНК, выявляемых с помощью трех предлагаемых праймеров на ДНК марит F.hepatica (дорожки 1, 2), F.gigantica (дорожки 3-6), а также из половозрелых гельминтов Parafasciolopsis cervi (дорожка 7), Opistirchis felineus (дорожка 8). М-маркер молекулярных масс (100bp Ladder).

На фиг.2 представлен набор полиморфных ДНК, выявляемых с помощью трех предлагаемых праймеров на ДНК марит F.hepatica (дорожка 1), F.gigantica (дорожка 2), а также на ДНК, выделенной из инфицированного личинками печеночного сосальщика моллюска L.truncatula (дорожки 3-7), и незараженных моллюсков L.truncatula (дорожка 8), L.auricularia (дорожка 9), L.stagnalis (дорожка 10). М-маркер молекулярных масс (100bp Ladder). Дорожки 3-7: разведение ДНК инфицированного моллюска (с исходной концентрацией ДНК 5γ /мкл, дорожка 3) в 5 (дорожка 4), 10 (дорожка 5), 20 (дорожка 6) и 100 раз (дорожка 7).

Примеры выполнения предлагаемого способа

Пример 1. Способ определения видовой принадлежности печеночного сосальщика

Из образцов гельминов двух видов выделяют ДНК способом, указанным выше. На каждой из выделенных ДНК осуществляют ПЦР с набором из трех предлагаемых праймеров, а именно NR11, NR14, NR16. Полученные амплификационные продукты визуализируют путем электрофореза в агарозном геле, и после окрашивания гелей бромистым этидием идентифицируют по размеру (длине) выявляемые полиморфные маркеры.

На фиг.1 представлен набор полиморфных ДНК, выявляемых с помощью трех предлагаемых праймеров на ДНК марит двух видов печеночного сосальщика F.hepatica (дорожки 1, 2), F.gigantica (дорожки 3-6), а также из половозрелых гельминтов, принадлежащих к двум другим видам трематод из семейства Fasciolidae (Parafasciolopsis cervi, дорожка 7) и сем. Opistorchidae (Opistirchis felineus, дорожка 8). Идентификацию двух видов фасциол осуществляют путем сравнения паттернов, причем у F. hepatica всегда детектируется только один фрагмент длиной 327 п.н., а у F.gigantica всегда амплифицируются два фрагмента - длиной 327 п.н. и 376 п.н. Родоспецифичный характер обнаруженной изменчивости подтверждается полным отсутствием продуктов амплификации при использовании в качестве мишеней ДНК двух других близкородственных видов трематод из семейства Fasciolidae (Parafasciolopsis cervi, дорожка 7) и сем. Opistorchidae (Opistirchis felineus, дорожка 8).

Пример 2. Способ определения видовой принадлежности печеночного сосальщика F.hepatica и F.gigantica на разных стадиях жизненного цикла

ДНК выделяют указанным выше способом из марит двух видов печеночного сосальщика (F.hepatica - дорожка 1), F.gigantica (дорожка 2), а также из моллюска L.truncatula (дорожки 3-7), зараженного личинками F.gigantica, и незараженных моллюсков L.truncatula (дорожка 8), L.auricularia (дорожка 9), L.stagnalis (дорожка 10).

На каждой из выделенных ДНК осуществляют ПЦР с набором из трех предлагаемых праймеров, а именно NR11, NR14, NR16. Полученные амплификационные продукты визуализируют путем электрофореза в агарозном геле, и после окрашивания гелей бромистым этидием идентифицируют по размеру (длине) выявляемые полиморфные маркеры. Отсутствие амплификатов в спектрах трех неинфицированных моллюсков, принадлежащих к трем видам семейства Lymnaeidae и наличие двух фрагментов в спектре одного моллюска L.truncatula, инфицированного личинками F.gigantica, подтверждает диагностическую ценность предлагаемых примеров для детектирования фасциолеза на разных стадиях жизненного цикла, а именно диагностики на стадии моллюска. Разведение ДНК инфицированного моллюска (с исходной концентрацией ДНК 5γ/мкл, дорожка 3) в 5 (дорожка 4), 10 (дорожка 5), 20 (дорожка 6) и 100 раз (дорожка 7) не снижает чувствительности предлагаемого способа детекции личинок фасциол. По наличию в спектре инфицированного моллюска двух фрагментов длиной 327 п.н. и 376 п.н. определяется принадлежность личинок паразита к виду F.gigantica.

Настоящее изобретение относится к области молекулярной генетики и паразитологии. Способ включает выделение ДНК гельминтов или ДНК инфицированного моллюска из семейства Lymnaeidae, амплификацию участков митохондриальной ДНК с использованием трех видоспецифичных праймеров. Далее проводят разделение и визуализацию амплифицированных фрагментов и идентификацию видовой принадлежности гельминтов по числу и размеру (длине) выявляемых полиморфных маркеров. Способ позволяет осуществлять видовую идентификацию на разных стадиях жизненного цикла возбудителей фасциолеза животных и человека - печеночного сосальщика F.hepatica и F.gigantica. Изобретение может быть использовано в области ветеринарии и медицины. 2 ил.

Способ дифференциальной ДНК-диагностики на разных стадиях жизненного цикла гельминтов-возбудителей фасциолеза человека и животных, включающий выделение ДНК возбудителя, амплификацию мишени с использованием видоспецифических праймеров, ПЦР и электрофоретическое разделение, отличающийся тем, что генотипирование и видовую дифференциацию возбудителей фасциолеза животных и человека - печеночных сосальщиков Fasciola hepatica и Fasciola gigantica проводят путем амплификации участков последовательности митохондриальной ДНК в образцах половозрелых гельминтов, принадлежащих к двум видам, и/или на ДНК инфицированных фасциолами пресноводных моллюсков из семейства Lymnaeidae с помощью полимеразной цепной реакции и использованием нескольких олигонуклеотидных праймеров (Multiplex PCR), затем разделяют указанные амплифицированные последовательности мтДНК с помощью электрофореза с получением образцов видоспецифичного электрофоретического паттерна гельминта, при этом на каждой из выделенных ДНК осуществляют ПЦР с набором из трех предлагаемых праймеров, а именно NR11 (5'-TGGTTTGGTTTTATTAGGGAGATT-3'), NR14 (5'-TCCAAATCTCCACAAACAAAAA-3'), NR16 (5'-TATACTACCGAAACCACTAAACAC-3'), а полученные амплификационные продукты визуализируют и дифференцируют путем электрофореза в агарозном геле, и после окрашивания гелей бромистым этидием идентифицируют по размеру (длине) выявляемые полиморфные маркеры, где один фрагмент длиной 327 п.н. характерен для F.hepatica, a два фрагмента длиной 327 п.н. и 376 п.н. - присутствуют у вида F.gigantica.