СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАННИХ ПОСЛЕОПЕРАЦИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ У БОЛЬНЫХ С РЕВМАТИЧЕСКИМИ ПОРОКАМИ СЕРДЦА Российский патент 2008 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к кардиохирургия, в частности к способам прогнозирования ранних послеоперационных осложнений у больных с пороками сердца.

Ранние послеоперационные осложнения являются актуальной проблемой любого хирургического отделения, в том числе кардиохирургического. К ним относятся в основном гнойные осложнения, такие как нагноение операционной раны, лигатурные свищи, гнойный медиастинит, остеомиелит грудины и ребер, острый протезный эндокардит и другие. Данные осложнения связаны со снижением иммунитета на фоне основного заболевания и тяжелой операции на сердце в условиях экстракорпорального кровообращения. Тем не менее, не все больные с ревматическими пороками сердца имеют послеоперационные осложнения. Эти осложнения пытались прогнозировать путем определения активности ревматизма, так как известно, что больные с активным ревматизмом тяжелее переносят оперативное вмешательство и послеоперационный период [Aggosino L. et al, 1992, Angelini A. et al, 1994]. С этой целью до операции особенно внимательно анализируются клиническая картина заболевания (наличие субфебрилитета, развитие повышенной утомляемости и слабости, потливость, артралгии, неприятные ощущения в области сердца, сердцебиения, перебои), лабораторные показатели (нарастание грубодисперсных белков в крови - увеличение СОЭ, повышение α2-глобулинов (в острой и подострой фазе), увеличение γ-глобулинов (в фазе стихания обострения), увеличение сиаловых кислот, гликопротеидов, серомукоида и ДФА, появление С-реактивного белка, увеличение титров анти-O-стрептолизина и антигиалуронидазы, рост содержания иммуноглобулинов, особенно IgM, и антикардиальных антител) [Маколкин В.И., 1987], а также изменения сердца при инструментальном обследовании: при аускультации, фоно-, электро- и эхокардиографическом исследовании. Однако в последние 30 лет многие исследователи отмечают изменение клинического течения ревматизма с преобладанием форм с вялым течением заболевания и минимальной активностью [Насонова В.А., 1975, Нуштаева Н.Н., 1986, Ольбинская Л., Привалова Е., 2004. Ayoub E.M., Dajani A.S., 1994]. Трудности диагностики возвратного ревмокардита (активного ревматизма) могут быть обусловлены тем, что на первый план выступают признаки недостаточности кровообращения. Более существенную роль оказывают лабораторные показатели (биохимические и иммунологические тесты), хотя и они могут быть не слишком информативны. При затяжном и вялом течении ревматизма все упомянутые показатели только незначительно превышают нормальные пределы. В таких случаях ориентируются на наиболее благоприятные значения их в процессе динамического наблюдения, рассматривая индивидуальную норму [Данилов А.А. 1991]. Более точным способом определения активности ревматизма является анализ морфологических маркеров, определяемых при гистологическом исследовании клапанов сердца, удаляемых во время операции. К таким маркерам относятся: пролиферация и набухание эндотелия выстилки створок и новообразованных сосудов, дезорганизация соединительной ткани, васкулит, клеточная инфильтрация, гранулемы Ашоффа-Талалаева [Струков А.И., Бегларян А.Г., 1963, Пальцев М.А., Аничков Н.М., 2001]. Однако этот способ тоже не является достаточно точным для клиники, поскольку ревматизм является полиорганным заболеванием, и отсутствие признаков активности в одном пораженном клапане не исключает активность процесса в другом клапане, миокарде и других органах, например в почках и в суставах [Митрофанова Л.Б. и др., 2006].

Известен способ прогнозирования ранних послеоперационных осложнений у больных с ревматическими пороками сердца, выбранный нами в качестве прототипа, который включает в себя исследование маркеров активности Т-клеточного (CD3, CD4, CD8, CD4/ CD8, CD25, CD56, HLA-DR) и В-клеточного иммунитета (CD19, CD20, IgG, IgM, IgA), а также противовоспалительных цитокинов (ФНО-α, интерлейкина-1) и комплемента С3, С5 [Фрейдлин И.С., Тоталян А.А., 2001]. Эти показатели оцениваются в крови больного до операции. В случае, если значения всех этих показателей отклоняются от нормы на 2 SD (стандартное отклонение), то у обследованных больных возможны, но необязательны, послеоперационные осложнения.

Недостатками метода считаются невысокая точность прогнозирования гнойных послеоперационных осложнений, около 40% [Каплина Э.Н., Вайнберг Ю.П., 2005] и высокая стоимость (2200-2500 рублей).

Целью изобретения является повышение точности способа и снижение его стоимости. Это достигается тем, что во время операции у больного производят забор створок пораженного клапана, затем осуществляют его иммуногистохимическое исследование с помощью использования антител к VP1-антигену энтеровирусов. В случае выявления VP1-антигена энтеровируса прогнозируют развитие гнойных осложнений в раннем послеоперационном периоде.

Положительный эффект от применения данного изобретения заключается в повышении точности прогнозирования развития послеоперационных осложнений. Это в свою очередь позволяет назначить антибактериальную и иммуномодулирующую терапию в более ранние сроки, снизить риск летальности и сократить время пребывания больного в стационаре. Способ прост в исполнении и не требует дорогостоящих реактивов.

Последний метод способен диагностировать репликацию энтеровирусов в клетке, так как моноклональные антитела к ним рассчитаны на прикрепление к структурному белку VP1-индикатору транскрипции и трансляции вирусной РНК [Li Y., Bourlet Th., Andreoletti L. et al., 2001]. Предполагают, что энтеровирусы могут стимулировать память Т- и В-лимфоцитов к М-протеину во время предыдущей стрептококковой инфекции, что приводит к аутоиммунной реакции и разрушению клапанов. Энтеровирусы могут приводить к рестимуляции аутореактивных Т-клеток, так как являются суперагентами для их активации [Muir P., 2002]. Конечно, они не могут конкурировать со стрептококком в отношении этиологии ревматизма, как полагают некоторые авторы [Li Y., Pan Z., Ji Y. et al., 2002], но нельзя исключить их роль в так называемой хронизации процесса с формированием порока сердца. Наиболее вероятно, что вирусы реактивируются или инфицируют клапан уже на фоне текущего ревматического процесса, который повышает их вирулентность. Доказана перекрестная реакция между энтеровирусами, М-протеином стрептококка и миозином кардиомиоцитов [Porter C.B., Hinthom D.R., Couchonnal G. et al. 1981, Cunningham M.W., Antone S.M., Gulizia J.M., 1992, Cunningham M.W., 2004]. При этом известно, что ревматизм относят к аутоиммунным заболеваниям с гуморальным и клеточным ответом, обусловленным повышенной реактивностью к стрептококковым антигенам, которые вызывают синтез антител, перекрестно реагирующих с антигенами: основного вещества соединительной ткани, фибробластами и эндотелием клапана, сарколеммы миокарда и гладких мышц, миозином кардиомиоцитов [Galvin J.E., Hemric M.E., Ward К., Cunningham M.W., 2000]. В неизмененных клапанах и при мезенхимальной дисплазии энтеровирусы не вызывают эндокардит из-за отсутствия перекрестной реакции со стрептококковым М-протеином. Считается, что подавление функции эндотелия, равно как и иммунитета при ревматизме, обусловлено присоединяющейся энтеровирусной инфекцией [Li Y., Yang Y.Z., Chen H.Z., 1997, Li Y., Pan Z., Ji Y. et al., 2002, Roberts W.C., Kozanke S., Dunn S.T. et al., 2001]. Таким образом, обнаружение VP1-антигена энтеровирусов в клетках створок клапанов сердца может объяснить тот факт, что не все больные с активным ревматизмом имеют ранние послеоперационные осложнения.

Способ осуществляется следующим образом. У больных с ревматическими пороками сердца необходимо во время операции протезирования клапана сердца или во время операции пластики клапана взять кусочек створки клапана сердца не менее 0,5×0,5 см площадью и положить его в 10% нейтральный формалин на 10-16 часов. В случае наличия петрификатов клапан помещается в смесь 85% муравьиной кислоты и 10% формалина в соотношении 1:1 на 3 дня. После формалина или смеси для декальцинации осуществляется традиционное гистологическое проведение препарата по спиртам 70°-80°-96° (используется этиловый спирт) по 40 мин в каждом спирте. Затем препарат проводится в смеси 1:1 96° этилового спирта с хлороформом в течение 60-120 мин и в химически чистом хлороформе в течение 60-120 мин. После этого кусочек ткани на ночь помещается в смесь парафина с хлороформом 1:1 в термостат при 37°С, затем проводится по 3 парафинам по 40 мин в термостате при 56°С. В результате гистологической проводки получается парафиновый блок створки клапана, из которого затем готовится иммуногистохимический препарат. Схема приготовления иммуногистохимических препаратов сводится к следующим этапам:

1. До этапа депарафинизации срезы помещаются в термостат с температурой 56°С на 30 минут.

2. Депарафинизация парафиновых срезов проводится в ксилоле (по 3 минуты 2 раза), абсолютном спирте (по 3 минуты 2 раза), 96° этиловом спирте (по 3 минуты 2 раза).

3. Блокирование активности эндогенной пероксидазы в 3% растворе перекиси водорода на метаноле (20 минут при 6°С).

4. Промывание в дистиллированной воде (3 минуты).

5. Восстановление активности антигенов путем кипячения в ЭДТА (рН 9,0) при повышенном давлении в скороварке (4 минуты после достижения максимального давления) с остужением скороварки под проточной водой.

6. Промывание в Трис-буфере с Tween 20 (2 раза по 5 минут).

7. Инкубация с бычьей сывороткой в контейнере с влажной фильтровальной бумагой (при комнатной температуре 20 мин).

8. Инкубация с первичными антителами (18 часов, при 6°С). Антитела к VP1-антигену энтеровирусов используются разведенными в 1% растворе бычьего сывороточного альбумина в Трис-буфере 1:100.

9. Инкубация с Envision Mouse (30 мин при 37°). После этапов 7 и 8 промывание в Трис-буфере с Tween 20 (по 5 мин 2 раза).

10. Реакция с DAB (3-5 мин, под контролем микроскопа, комнатная температура). Рабочий раствор DAB готовился путем добавления к 1 мл буфера 1 капли концентрированного хромогена согласно инструкции.

11. Смывание хромогена дистиллированной водой, промывание в дистиллированной воде (3 мин).

12.Докрашивание ядер гематоксилина (2 мин). Подсинивание в теплой проточной воде (под контролем микроскопа).

13. Обезвоживание: 96° спирт (2 раза по 2 минуты), карбол-ксилол (2 раза по 2 мин), ксилол (2 раза по 2 мин).

14. Заключение в бальзам.

В качестве положительного контроля используется парафиновый срез клапана, в котором РНК энтеровируса была выявлена с помощью полимеразной цепной реакции. Положительным результатом считается обнаружение экспрессии VP1-антигена в клетках створок клапанов сердца (коричневое окрашивание цитоплазмы). В случае обнаружения энтеровирусов в клапане сердца больного с ревматизмом прогнозируется неблагоприятное протекание раннего послеоперационного периода с развитием гнойных осложнений.

Исследование выполняется в течение 3 дней, стоит 300 рублей, что в 7 раз дешевле обходится пациенту по сравнению с прототипом метода - иммунологическим тестом. Данный метод не требует специального сложного оборудования и прост в исполнении.

Способ прогнозирования был апробирован на кардиохирургическом отделении НИИ кардиологии имени В.А.Алмазова Росздрава на 21 больном с ревматическим пороком сердца, 10 больных с митральным пороком сердца, обусловленным мезенхимальной дисплазией и 10 нормальных клапанах (аутопсийный материал). В результате исследования экспрессия VP1-антигена энтеровирусов в клетках клапанов была обнаружена в 18 из 21 случая с ревматизмом. В остальных случаях данный антиген обнаружен не был. В 14 случаях с экспрессией VP1-антигена у больных с ревматизмом обычное гистологическое исследование подтвердило активную фазу заболевания, в 4 - неактивную. У 16 из 18 пациентов с выявленным в клапане антигеном энтеровируса в раннем послеоперационном периоде возникли гнойные осложнения в виде нагноения послеоперационной раны, лигатурных свищей, гнойного медиастинита и остеомиелита грудины. У всех 10 больных с мезенхимальной дисплазией гнойных послеоперационных осложнений не наблюдалось. В клетках створок больных ревматизмом (эндотелиоцитах, фибробластах и гладкомышечных клетках сосудов), пораженных энтеровирусом, наблюдались апоптоз, некроз и дистрофические изменения. Этим же (21 пациентам) с ревматическими пороками сердца проводился иммунологический тест (по способу-прототипу), по которому только у 7 больных прогнозировались послеоперационные осложнения в раннем периоде. Таким образом, предлагаемый способ прогнозирования ранних послеоперационных осложнений у больных с ревматическими пороками сердца имеет точность 89%, а способ-прототип (иммунологический тест) - 44%.

Пример 1. Больная Е., 57 лет, страдала ревматическим пороком сердца в течение 39 лет. К моменту хирургического вмешательства у больной сформировался сложный порок сердца: комбинированный порок митрального и аортального клапанов. В течение последних 3 лет до операции наблюдалось тяжелое, не купирующееся терапией, активное течение ревматизма с лихорадкой до 38-39°С на протяжении 5 месяцев. Был поставлен клинический диагноз вторичного инфекционного эндокардита на фоне ревматизма, не подтвердившийся при гистологическом исследовании. Иммунологический тест (способ-прототип) не выявил нарушений Т- и В-клеточного иммунитета, все параметры иммунограммы были в пределах нормы. Таким образом, по способу-прототипу послеоперационные осложнения не ожидались. Было выполнено протезирование митрального и аортального клапанов искусственным протезом. Морфологически диагностировали ревматизм активной фазы, возвратно-бородавчатый эндокардит митрального и аортального клапанов, активность ++++, III фаза, ревматический очаговый миокардит, миокардитический кардиосклероз головок папиллярных мышц. Иммуногистохимическое исследование выявило экспрессию VP1-антигена энтеровирусов (коричневое окрашивание цитоплазмы) в эндотелиоцитах, гладкомышечных клетках и фибробластах створок митрального клапана, что позволило прогнозировать развитие гнойных осложнений раннего послеоперационного периода и подтвердилось нагноением операционной раны, лигатурными свищами, медиастинитом. Пациентка провела на кардиохирургическом отделении 4 месяца, на кардиологическом отделении - 3 месяца, а затем лечилась в кардиологическом санатории.

Пример 2. Больной К., 64 лет, страдал ревматизмом в течение 50 лет. На момент оперативного вмешательства у пациента сформировался комбинированный митральный порок сердца. По клинической картине и лабораторным методам была диагностирована активная фаза ревматизма. По результатам иммунологического теста (способа-прототипа) ожидались гнойные осложнения в раннем послеоперационном периоде, так как было выявлено снижение относительного и абсолютного числа Т-хелперов (CD4), снижение абсолютного числа Т-киллеров (CD3+CD8+). Была резко повышена продукция провоспалительных цитокинов (ИЛ-1β и ФНО-α) и увеличены IgM и IgG. Морфологическое исследование иссеченного клапана подтвердило активную фазу ревматизма. Иммуногистохимическое исследование не выявило экспрессии VP1-антигена энтеровирусов в створках. Больной К. был переведен на кардиологическое отделение через 7 дней после операции. Гнойных осложнений не наблюдалось.

Список использованной литературы

1. Данилов А.А. Митральный порок сердца в возрастном аспекте (клинико-морфологические сопоставления, некоторые механизмы компенсации сердечной недостаточности, особенности лечения дигоксином: Автореф. дисс... д-ра мед. наук. - М., 1991, 46 с.

2. Каплина Э.Н., Вайнберг Ю.П. Деринат - природный иммуномодулятор для детей и взрослых. - М., 2005. - 212 с.

3. Маколкин В.И. Приобретенные пороки сердца. - М., 1986. - 252 с.

4. Насонова В.А. Клинико-патогенетические особенности ревмокардита с минимальной активностью // Кардиология. - 1975. - №11. - С.5-8.

5. Нуштаева Н.Н. Эволюция ревматических пороков сердца за 1970-1985 годы и варианты их естественного течения: Автореф. дисс... канд. мед. наук. - М., 23 с.

6. Ольбинская Л., Привалова Е. Ревматические пороки сердца // Медицинская газета. - 2004. - №59. - С.8-9.

7. Пальцев М.А., Аничков Н.М. Патологическая анатомия. Т.2, ч.1. - М., 2001. - 736 с.

8. Струков А.И., Бегларян А.Г. Патологическая анатомия и патогенез коллагеновых болезней. - М.: Гос. изд. мед. лит., 1963. - 322 с.

9. Фрейдлин И.С., Тоталян А.А. Клетки иммунной системы. T.1. - СПб: Наука, 2001. - 328 с.

10. Aggosino L., Faico A., de Vivo F. et al. Surgical pathology of the mitral valve: gross and histological study of 1288 surgically excised valves // IntJ. Cardiol. - 1992. - Vol.37, №1. - P.79-89.

11. Angelini A., Basso C., Grassi G., Casarotto D. Surgical pathology of valve disease in the elderly // Aging (Milano). - 1994. - Vol.6, №4. - P.225-237.

12. Ayoub E.M., Dajani A.S. Acute Rheumatic Fever // Valvular Heart Disease. Ed. by M.Al.Zaibag, C.M.G.Duran. - New-York, 1994. - P.47-64.

13. Cunningham M.W., Antone S.M., Gulizia J.M. Cytotoxic and viral neutralizing antibodies cross react with streptococcal M-protein, enteroviruses and human cardiac myosin // Proc. Natl. Acad. Sci USA. - 1992. - Vol.89. - P.1320-1324.

14. Cunmngham M.W. T-cell mimicry in inflammatory heart disease // Molecular Immunology. - 2004. - Vol.40. - P.1121-1127.

15. Galvin J.E., Hemric M.E., Ward K., Cunningham M.W. Cytotoxic monoclonal antibody from rheumatic carditis with human endotelium: implications in rheumatic heart disease // J. Clinic. Invest. - 2000. - Vol.106. - P.217-224.

16. Li Y., Yang Y.Z., Chen H.Z. Relationship between enteroviral infection and chronic rheumatic valvular disease // Chin. J. Exper. Surg. - 1997. - Vol.14. - P.163-164.

17. Li Y., Bourlet Th., Andreoletti L. et al. Enteroviral capsid protein VP1 is present in myocardial tissues from some patients with myocarditis or dilated cardiomyopathy // Circulation. - 2000. - Vol.101. - P.231-234

18. Li Y., Pan Z., Ji Y. et al. Enterovirus replication in valvular tissue from patients with chronic rheumatic heart disease // Europ. Heart J. - 2002. - Vol.23. - P.567-573.

19. Muir P. Entorovirus infection of the heart - a causal or contributory factor in chronic rheumatic heart disease? // European Heart J. - 2002. - Vol.23. - P.517-520.

20. Porter C.B., Hinthom D.R., Couchonnal G. et al. Simultaneous Streptococcus and Picomavirus infection // JAMA. - 1981. - Vol.245. - P.1545-1547.

21. Roberts W.C., Kozanke S., Dunn S.T. et al. Pathogenic mechanisms in rheumatic carditis: focus on valvular endotelium // J. of Infect. Dis. - 2001. - Vol.183. - P.507-511.

Изобретение относится к области медицины. Способ прогнозирования ранних послеоперационных осложнений у больных с ревматическими пороками сердца характеризуется тем, что во время операции протезирования или пластики иссекается клапан или его часть, а затем проводится иммуногистохимическое исследование препарата с использованием антител к VP1-антигену энтеровирусов. В случае обнаружения экспрессии искомого антигена в эндотелиоцитах, фибробластах и фибробластах створок прогнозируются ранние гнойные послеоперационные осложнения. Изобретение обеспечивает точность прогнозировании с меньшей затратой времени, прост в исполнении.

Способ прогнозирования ранних послеоперационных осложнений у больных с ревматическими пороками сердца путем иммунологического исследования, отличающийся тем, что интраоперационно проводят забор створок клапанов сердца и осуществляют его иммуногистохимическое исследование, и в случае выявления VP1-антигена энтеровируса прогнозируют развитие гнойных осложнений в раннем послеоперационном периоде.