АНТИМИКРОБНЫЙ ПРЕПАРАТ Российский патент 2008 года по МПК C12N9/14 A61K38/43 

Предлагаемое изобретение относится к ветеринарии, сельскому хозяйству, медицине, биотехнологии и микробиологической промышленности и может быть использовано для защиты от инфекций, вызываемых микроорганизмами.

В настоящее время рынок насыщен препаратами, ингибирующими рост и развитие микроорганизмов. Однако до сих пор не создан надежный универсальный препарат, способный угнетать рост и развитие бактерий, грибов, в также ДНК- и РНК-содержащих вирусов, оставаясь при этом нетоксичным для человека и животных. Обычно отсутствие видо- и типоспецифичности препаратов сочетается с их острой токсичностью в отношении теплокровных организмов или (и) агрессивностью в отношении окружающей среды.

Наиболее близким к заявляемому препарату является препарат «Эндоглюкин», созданный на основе бактериальной эндонуклеазы и применяемый для борьбы и профилактики инфекций пчел, вызываемых рядом РНК-содержащих вирусов [1].

Бактериальная эндонуклеаза - продукт структурного гена nuc, исходно найденного в геноме бактерий S.marcescens и позднее клонированного и экспрессированного в клетках S.marcescens и Е.colli [2]. Поскольку бактериальная эндонуклеаза - это природный биологический катализатор белковой природы, она нетоксична благодаря способности к самопроизвольной инактивации и безвредна для человека, животных и растений. Присутствие в среде бактериальной эндонуклеазы ускоряет нарушение фосфодиэфирных связей ДНК и РНК по сравнению с их спонтанным разрушением в 10¹⁶ раз. Фермент гидролизует нуклеиновые кислоты по эндонуклеолитическому механизму до моно-, ди-, три-, тетра- и олигонуклеотидов, чем обусловлено его воздействие на вирусы.

Влияние бактериальной эндонуклеазы на рост и размножение бактерий и грибов отсутствует, что было установлено в ходе разработки «Ингибитора РНК-геномных бактериофагов» для микробиологической промышленности и биотехнологии [3].

Задачей изобретения является расширение спектра действия бактериальной эндонуклеазы, т.е. создание препарата, обладающего вирулицидным, фунгицидным, бактерицидным и хламидиоцидным действием без выраженной видо- и типоспецифичности.

Поставленная задача решается применением препарата бактериальной эндонуклеазы в комбинации с электроактивированным водно-солевым раствором, содержащим 0,1% йодита калия и 0,3% хлорида натрия (препарат «Йодохлорин»), и стабилизатором.

Препарат эндонуклеазы представляет собой раствор с активностью не менее 10000 ед./мл (удельная активность 10000 ед./мг белка), содержащий 1 М Трис-HCl буфер, рН 6,5-9,5, и не менее 0,5 моль/л ионов магния.

Стабилизатор представляет собой 40-80% глицерин, или 30-70% сахарозу, или 50-90% поливинилпирролидон, или 40-80% глюкозу, или 0,5-10% альбумин.

Пример: Антимикробное действие испытывали в непосредственном контакте микроорганизмов с электроактивированным водно-солевым раствором, содержащим 0,1 мас.% йодита калия и 0,3 мас.% хлорида натрия, и 0,01% бактериальной эндонуклеазой в присутствии стабилизатора. Комбинированный препарат получали, смешивая равные объемы электроактивированного водно-солевого раствора (препарат «Йодохлорин»), исходно содержавшего 0,2 мас.% йодита калия и 0,6 мас.% хлорида натрия, и 0,02% раствора бактериальной эндонуклеазы, предварительно разведенной в 100 раз раствором стабилизатора. Фунгицидное, бактерицидное и хламидиоцидное действие оценивали по изменению числа жизнеспособных клеток стандартными методами. Вирулицидную активность определяли в отношении бактериофагов E.coli в перекрестном тесте на чашках Петри.

Минимальное время контакта микроорганизмов с электроактивированным водно-солевым раствором, содержащим 0,1 мас.% йодита калия и 0,3 мас.% хлорида натрия, и бактериальной эндонуклеазой в присутствии стабилизатора, вызывающее 40-90% снижение жизнеспособности микроорганизмов: РНК- и ДНК-содержащих вирусов, грамположительных и грамотрицательных бактерий, включая хламидии, а также несовершенных грибов, - при 20-40°, составляло 1 мин.

Созданный принципиально новый препарат обладает широким спектром действия в отношении микроорганизмов разных групп и представляет собой нетоксичное, экологически чистое вещество, проявляющее активность при мягких физиологических условиях.

Полученные данные показывают возможность применения препарата в качестве универсального средства защиты при инфекциях различной этиологии (бактерии, хламидии, грибы и вирусы), микробиологических и биотехнологических процессов от бактериофагов, а также в различных отраслях животноводства. Результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1МикроорганизмыПрепаратДоза (мг, мас.%) или концентрация (%)Время экспозиции, минСнижение жизнеспособности, %ОпытКонтроль123456Ser. marcescensИодохлорин0,1-0,31400St. aureus0,1-0,31200Aspergillus niger0,1-0,3100Ascosphera apis0,1-0,3100Chl. psittaci0,1-0,31100Фаг fd0,1-0,3100Фаг Т₄0,1-0,3100Ser. marcescensЭндонуклеаза0,01100St. aureus0,01100Aspergillus niger0,01100Ascosphera apis0,01100Chl. psittaci0,01100Фаг fd0,011200Фаг f₂0,011400Ser. marcescensГлицерин39,6100St. aureus39,6100Aspergillus niger39,6100Ascosphera apis39,6100Chl. psittaci39,6100Фаг fd39,6100Фаг f₂39,6100Ser. marcescensСахароза29,7100St. aureus29,7100Aspergillus niger29,7100Ascosphera apis29,7100Chl. psittaci29,7100Фаг fd29,7100Фаг f₂29,7100Ser. marcescensПоливинилпирролидон44,6100St. aureus44,6100Aspergillus niger44,6100Ascosphera apis44,6100Chl.psittaci44,6100Фаг fd44,6100Фаг f₂44,6100Ser. marcescensГлюкоза39,6100St. aureus39,6100Aspergillus niger39,6100Ascosphera apis39,6100Chl. psittaci39,6100Фаг fd39,6100Фаг f₂39,6100Ser. marcescensАльбумин0,495100St. aureus0,495100Aspergillus niger0,495100Ascosphera apis0,495100Chl. psittaci0,495100Фаг fd0,495100Фаг f₂0,495100Ser. marcescens 0,1-0,31900  0,01     39,6   St. aureus0,1-0,31800  0,01     39,6   Aspergillus niger0,1-0,31500 Антибактериальный препарат: Йодохлорин/эндонуклеаза/ глицерин0,01    39,6   Ascosphera apis0,1-0,31500 0,01    39,6   Chl. psittaci0,1-0,31600  0,01,     39,6   Фаг fd0,1-0,31800  0,0111     39,6   Фаг f₂0,1-0,31700  0,01     39,6   Ser. marcescens 0,1-0,31800  0,01     29,7   St. aureus0,1-0,31700  0,01     29,7   Aspergillus niger0,1-0,31400  0,01    Антибактериальный препарат: Йодохлорин/эндонуклеаза/ сахароза29,7   Ascosphera apis0,1-0,31400 0,01    29,7   Chl.psittaci0,1-0,31500 0,01     29,7   Фаг fd0,1-0,31500  0,01     29,7   Фаг f₂0,1-0,31600  0,01     29,7   Ser. marcescens 0,1-0,31800  0,01     44,6   St. aureus0,1-0,51700  0,01     44,6   Aspergillus niger0,1-0,31400 Антибактериальный препарат: Йодохлорин/ эндонуклеаза/поливинилпирролидон0,01    44,6   Ascosphera apis0,1-0,31400 0,01,    44,6   Chl. psittaci0,1-0,31500 0,01     44,6   Фаг fd0,1-0,31800  0,01     44,6   Фаг f₂0,1-0,31800  0,01     44,6   Ser. marcescens 0,1-0,31600  0,01     39,6   St. aureus0,1-0,31600  0,01     39,6   Aspergillus niger0,1-0,31400 Антибактериальный препарат: Йодохлорин/эндонуклеаза/ глюкоза0,01    39,6   Ascosphera apis0,1-0,31400 0,01    39,6   Chl. psittaci0,1-0,31400 0,01     39,6   Фаг fd0,1-0,31700  0,01     39,6   Фаг f₂0,1-0,31600  0,01     39,6   Ser. marcescens 0,1-0,31800  0,01     0,495   St. aureus0,1-0,31700  0,01     0,495   Aspergillus niger0,1-0,31400 Антибактериальный препарат: Йодохлорин/эндонуклеаза/ альбумин0,01    0,495   Ascosphera apis0,1-0,31400 0,01    0,495   Chl. psittaci0,1-0,31600  0,01     0,495   Фаг fd0,1-0,31700  0,01     0,495   Фаг f₂0,1-0,31600  0,01     0,495   Ser. marcescensПрототип «Эндоглюкин»0,01100St. aureus0,01100Aspergillus niger0,01100Ascosphera apis0,01100Chl. psittaci0,01100Фаг fd0,01100Фаг f₂0,011540

Источники информации

1. Аликин Ю.С., Сенженко Л.П., Клименко В.П. Развитие технологии получения и перспективы использования эндонуклеазы Serratia marcescens // Ферменты микроорганизмов: Сб. Докладов XI Всероссийской конференции. - Казань, 1998. - С.152-163.

2. Ball Т.К., Saurugger P.N., Benedik M.J. The extracellular nuclease gene of Serratia marcescens and its secretion from Escherichia coli // Gene. -1987. - V.57. - P.183-192.

3. Лещинская И.Б., Шарипова Ф.Р., Филимонова М.Н., Штенц Э., Рокштро А., Клуге 3. Ингибитор РНК-геномных бактериофагов / Патент '1781295 A1, SU, С12N 9/14, приор. 31.05.90, регистр. 14.10.93.

Изобретение относится к биотехнологии и микробиологической промышленности и может быть использовано для защиты от инфекций, вызываемых микроорганизмами. Антимикробный препарат включает бактериальную нуклеазу в комбинации с электроактивированным водно-солевым раствором, содержащим 0,1% йодита калия и 0,3% хлорида натрия, и стабилизатором - глицерином, или сахарозой, или поливинилпирролидоном, или глюкозой, или альбумином. Изобретение позволило расширить спектр действия бактериальной эндонуклеазы, т.е. создать препарат, обладающий вирулицидным, фунгицидным, бактерицидным и хламидиоцидным действием без выраженной видо- и типоспецифичности. 1 табл.

Антимикробный препарат, включающий бактериальную нуклеазу - продукт гена nucA (синоним nuc), отличающийся тем, что дополнительно содержит электроактивированный водно-солевой раствор, включающий 0,1 мас.% йодита калия и 0,3 мас.% хлорида натрия, и в качестве стабилизатора глицерин или сахарозу или поливинилпирролидон или глюкозу или альбумин.