Ингибитор РНК-геномных бактериофагов Советский патент 1992 года по МПК C12N9/14 

Изобретение относится к области микробиологической промышленности и биотехнологии и может быть использовано для защиты бактериальных штаммов, используемых в производственных процессах от бактериофагов, вызывающих лизис культур.

До сих пор не существует надежного способа борьбы с бактериофагами в микробиологическом производстве. Стерилизация производственных биореакторов является дорогостоящей, сложно реализуется и не обеспечивает полной гибели бактериофагов.

Целью изобретения является повышение эффективности борьбы с РНК-содержащими бактериофагами в микробиологическом производстве.

Поставленная цель достигается применением в качестве ингибиторов РНК-геномных бактериофагов препаратов нуклеа з, обладающих РНК-деполимеразной активностью. Принципиально новые биогенные ингибиторы обладают широким спектром действия по отношению к различным группам бактериофагов и представляют собой нетоксичные экологически чистые вещества, безвредные для производственных штаммов бактерий.

Нуклеазы - белковые ферментные препараты с высокой каталитической активностью и способностью к неспецифическому расщеплению РНК по эндонуклеолитиче- скому механизму до олиго-, три-, ди- и мононуклеотидов, в связи с чем эти ферменты способны ингибировать различные РНК-геномные бактериофаги, например фаги М 12, f 2 и QB E coli, a также фаг РР 7 Pseudomonas aeruglnosa. Добавление ферментов в питательную среду в количестве 2-12 мкг/мл (4000-5000 ед/мл) практически полностью подавляет развитие фаговой инфекции, не влияет на

Ч 00

to

Ю

сл

рост и размножение бактерий и, следовательно, на количество и качество целевых микробных продуктов и является экологически безопасным.

Использовали следующие нуклеазы:

Рибонуклеаза Bacillus lntermedlus(Bn- наза, РНКаза BI, ЕС 3.1,27.2) представляет собой термостабильный фермент - эндо- нуклеазу, препарат которой имеет удельную активность -1,3 х 106 ед/мг белка. Ферментный препарат выпускается на Экспериментальном биотехнологическом производстве ИОС АН Латв, ССР по разработанному нами способу.

Рибонуклеаза Bacillus amylollquefaclens (Варназа, РНКаза Ва, ЕС 3.1.27.2) представляет аналог РНКазы Bi и производится на том же заводе. Удельная активность препарата барназы составляет 2,6 х 106 ед/мг белка.

Эндонуклеаза Serratia marcescens (Эн- донуклеаза Sm, EC 3.1.30.2) представляет собой термолабильный фермент - эндонук- леазу, атакующую ДИК и РНК, Удельная активность препарата составляет 0,35 х 106 ед/мг белка. Препарат производится на Вы- шнеполоЦком заводе ферментных препара- тов Минмедбиопрома СССР.

Рибонуклеаза панкреатическая (РНКаза А, ЕС 3.1.27.5), коммерческий препарат, производимый на Ленинградском фармза- воде. Представляет собой фермент, расщепляющий РНК с удельной активностью 0,35 х 10 ед/мг белка.

Дезоксирибонуклеаза панкреатическая (ДНКаза 1, ЕС 3.1.21.1), коммерческий препарат, производимый на Ленинградском фармзаводе. Представляет собой белковый ферментный препарат, расщепляющий только ДНК с удельной активностью 0,5х х106 ед/мг белка.

Все исследуемые ферменты - белки, которые быстро1 разлагаются в прир оде, поэтому экологически безопасны, нетоксичны для человека, животных, растений.

Противофаговое действие препаратов было испытано в отношении РНК-содержа- щих бактериофагов Е. coll и Ps. aeruglnosa Й использо ёанйём с л ёдующйТ сйсте м:

М 12 / E.coll W 1665 F+

f2/E.collKf046

QB / E.coil AB 301

PP 7 / Ps.aeruglnosa

Ингибиторная активность нуклеаз в отношении бактериофагов определялась с помощью луночного метода и методом определения минимальной концентрации ингибирования в чашках Петри с двухслойным агаром.

При луночном методе в верхний питательный слой вносились бактерии и соответствующие бактериофаги, а в лунки ( мм) добавляли 0,05 мл ферментного раствора.

Чашки инкубировали 24 ч при 37 или 28°С (E.coll и Ps.aeruglnosa соответственно). В направлении градиента диффузии ферментов образовывались радиальные зоны ингибирования фагов, в которых отсутствовали

0 зоны фаголизиса бактерий (негативные колонии или бляшки). Средние значения зон ингибирования получали не менее чем из 9 повторностей.

Для определения оптимальных доз пре5 паратов нуклеаз методом минимальных концентраций ингибирования (МКИ) в верхний агаровый слой вносили бактериофаги, бактерии и ферментные препараты в разных концентрациях. После инкубирования в

0 течение 24 ч при 37° (28°С) определяли процент ингибирования путем сравнения числа образованных негативных колоний с числом таких колоний в контрольных чашках, в которые фермент не вносили. Конечная кон5 центрация фермента в агаре, при которой еще происходит образование негативных колоний, считается минимальной концентрацией ингибирования.

Результаты показали, что предлагаемые

0 в качестве ингибиторов препараты нуклеаз действуют на все изучаемые бактериофаги, а именно препятствуют процессу образования негативных колоний,

Были получены широкие зоны ингибиро5 вания, свидетельствующие о том, что препараты действуют в очень низких концентрациях, которые образуются в зонах диффузии ферментов.

Действие РНКазы BI на РНК-содержа0 щие бактериофаги (метод лунок) показаны в табл,1. г

Изучение фагоингибирования препаратов нуклеаз в концентрациях, соответствующих одинаковой каталитической активности

5 показало (табл. 2), что РНКазы Bi, А Ва и нуклеаза Sm в условиях, когда ферменты диффундируют из лунок в агаре, образуют зоны ингибирования 7,4. Антифаговое действие нуклеаз на примере системы М

0 12/E.coli W 1665 F+ (метод лунок) показано в табл. 2,

7,1. 6,2 и 4,7 мм соответственно, тогда как ДНКаза 1, неспособная к разрушениям РНК, не влияет на РНК-геномные бактерио5 фаги. Пример 2 свидетельствует, что для фагоингибирования ферменты должны обладать РЕК-деполимеразной активностью.

В табл. 3 представлены результаты определения МКИ для РНКазы BI с использованием четырех фаговых систем. Показано,

что МКИ РНКаэы Bi в отношение бактериофагов М 12, f 2 и РР 7 приблизительно составляет 0,6 мкг/мл агаризованной среды, что соответствует 800-1000 ед/мл. Фаг QB более устойчив к действию РНКазы, поскольку фермент в концентрации, соответствующей 780 ед/мл способен ингибироваты его только на 37%. Поэтому МКИ для этого фага выше и соответствует активности РНКазы около 7800 ед/мл.

Для сравнительной характеристики препаратов использовали такие их концентрации, при которых РНК-деполимеразная активность, рассчитанная на 1 мл агзризо- ванной среды была одинаковой. Результаты представлены в табл. 4.

Установлено, что разные препараты нуклеаз в концентрациях, соответствующих одинаковой РНКазной активности, оказывают приблизительно одинаковое противо- фаговое действие. МКИ препаратов РНКазы Bi, РНКазы Ва, РНКазы А и нуклеазы Sm соответственно составляют: 3,0, 2,0, 12,0 и 12,0 мкг/мл.

Как следует из табл. 1-3, ни в одном из случаев препараты нуклеаз не оказывали вредного влияния на размножение, рост и развитие бактерий-хозяев.

Проведенные эксперименты с нуклеа- зами, выделенными из разных штаммов В, intermedius (4 штамма) и S. marcescens (3 штамма), а также РНКазой А, свидетельствуют, что источник получения фермента не оказывает влияния на его ингибирующую активность. Вероятно, любые РНКазы обладают ингибирующим действием в отношение РНК-содержащих фагов, причем

0 степень ингибирования зависит от ферментативной актийности препаратов, а также в определенной степени от сложности строения фага. Так, к примеру, наиболее устойчивым к действию нуклеаз оказался фаг QB

5 Е.соМ, для полного ингибирования роста которого необходимо 7000-8000 ед любого из исследованных ферментных препаратов, т.е. вдвое больше, чем для остановки роста других бактериофагов.

0 Проведено также изучение действия перечисленных нуклеаз, включая панкреатическую ДНКазу, на ДНК-геномные фаги E.coli, B.subtills, Ps.aeruginosa, Ps.fluorescens. Ин- гибирующего действия не проявил ни один

5 из исследуемых ферментных препаратов. Формула изобретения Применение нуклеаз, обладающих РНК-диполимеразной активностью, в качестве ингибитора РНК-геномных бактерио0 фагов.

Использование: биотехнология, микробиологическая промышленность. Сущность изобретения: для борьбы с РНК-геномными бактериофагами в микробиологической промышленности и биотехнологических экспериментах предложены нуклеазы, обладающие ДНК-полимераз- ной активностью, в качестве последних могут быть использованы как панкреатические дезоксирибонуклеазы и рибонуклеа- зы, а также эндонуклеазы и рибонуклеазы бактериального происхождения. 4 табл.

Таблица 1

Таблица 2

Таблица 3

Определение минимальных концентраций ингибирования (МКИ) препарата РНКазы Bi для

РНК-содержащих бактериофагов.

Таблица 4

Определение минимальных концентраций ингибирования препаратов нуклеаз на примере

фага М 12.

Продолжение табл. 4