СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СРЕДСТВА, ОБЛАДАЮЩЕГО ГЕПАТОПРОТЕКТОРНЫМ, ЖЕЛЧЕГОННЫМ, ГИПОХОЛЕСТЕРИНЕМИЧЕСКИМ И РАНОЗАЖИВЛЯЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2008 года по МПК A61K36/185 A61P1/16 A61P3/06 A61P17/02 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к получению лечебно-профилактических средств из пищевого растительного сырья.

Технический результат изобретения заключается в разработке способа получения средства, обладающего одновременно гепатопротекторным, желчегонным, гипохолесте-ринемическим и ранозаживляющим действием.

Известны способы получения отдельно желчегонного средства фламин из соцветий бессмертника песчаного и отдельно гепатопротекторного средства силибор из семян расторопши пятнистой [1, 2].

Фламин получают из соцветий бессмертника песчаного экстракцией водой при температуре 60-70°С. Полученный экстракт сгущают, обрабатывают 5 объемами этанола, отстаивают, декантируют раствор с осадка, разбавляют водой и извлекают смесью этилацетат - этанол (9:1). Органическую фазу удаляют, остаток сушат и получают целевой продукт с выходом 4-5% по отношению к массе исходного сырья [1]. Однако данный способ трудоемок, не обеспечивает достаточно высокого выхода, ограничен из-за дефицита сырьевой базы (острая нехватка соцветий бессмертника), в процессе используется токсичный, взрывоопасный и дорогостоящий растворитель - этилацетат. Кроме того, данный лекарственный препарат характеризуется только желчегонной активностью.

Силибор получают экстракцией семян расторопши пятнистой 80% этанолом с последующим сгущением и растворением осадка в 50% этаноле. Полученный раствор последовательно обрабатывают тетрахлорметаном, затем смесью хлороформ-этанол в соотношении 2:1. Хлороформно-этаноловые извлечения сгущают, органическую фазу удаляют, остаток сушат. Получают целевой продукт с выходом 4,5-5% по отношению к массе сырья [2]. Однако данный способ не обеспечивает высокого выхода целевого продукта, в процессе используется только нативное сырье, запасы которого ограничены, а также токсичные растворители - тетрахлорметан, хлороформ. Кроме того, данное лекарственное средство, получаемое этим способом, обладает лишь гепатопротекторным действием.

Целью изобретения является расширение спектра фармакологического действия целевого продукта, обладающего одновременно гепатопротекторным, желчегонным, гипо-холестеринемическим и ранозаживляющим действием, повышение его выхода, исключение использования органических и токсичных растворителей, использование в качестве сырья отечественных промышленных отходов - шрота свежих яблок после получения яблочного сока.

Поставленная цель достигается экстракцией сырья (шрота яблок) водой при температуре 80-90°С, соотношение сырье - экстрагент 1:5 и 5-кратной экстракции. Объединенные водные извлечения сгущают досуха и получают целевой продукт.

Способ получения целевого продукта поясняется следующими конкретными примерами выполнения.

Примеры. К 1 кг сухого шрота яблок добавляют от 3-кратного до 7-кратного количества (по объему) воды и выдерживают при температуре от 60°С до 100°С в течение от 40 до 80 мин, при кратности процесса экстрагирования от 1 до 7.

Результаты исследований по влиянию некоторых факторов на выход целевого продукта приведены в сводной таблице 1.

Таблица 1Влияние регулируемых факторов на выход целевого продуктаСоотношение сырье - экстрагент, кг:лКратность извлеченияТемпературный режим, °СПродолжительность извлечения, минВыход, %1:358060271:458060301:558060321:658060321:758060321:518060161:528060241:538060281:548060301:558060321:568060321:578060321:556060271:557060301:558060321:559060321:5510060321:558040261:558050301:558060321:558070321:55808032

Острая токсичность целевого продукта изучалась на белых крысах массой 180-190 г при его пероральном введении в 3 мл водного раствора [3]. Максимальная доза целевого продукта, возможная для введения, составила 5000 мг/кг массы тела животного и не вызывала их гибели, что позволило считать LD₅₀>5000 мг/кг. Согласно классификации токсичности по К.К.Сидорову [4], исследуемую субстанцию следует отнести к группе практически нетоксичных веществ.

Гепатопротекторная активность целевого продукта исследовалась на белых крысах с экспериментальным хроническим гепатитом, вызванным 3-хразовым пероральным введением через день тетрахлорметана по 0,3 мл на 100 г массы тела в 50% масляном растворе [5]. Исследуемый продукт вводили перорально в дозе 75 мг/кг в виде водного раствора в течение 12 дней. Первое введение производили за 6 дней до начала введения тетрахлорметана. Аналогичным образом вводили в терапевтической дозе препарат сравнения - официнальное гепатозащитное средство силибинин [6]. В сыворотке крови животных определяли общий билирубин, триглицериды, щелочную фосфатазу и аланинаминотрансферазу, а в тканях печени - гликоген и общие липиды [7, 8].

Результаты опытов обрабатывали методом вариантной статистики.

Введение животным с токсическим гепатитом целевого продукта обусловило существенное восстановление нарушенных показателей: снижение в крови повышенного уровня общего билирубина на 31,7% (р<0,001), триглицеридов на 36,6% (р<0,001), аланинаминотрансферазы на 50% (р<0,01), щелочной фосфатазы на 45% (р<0,001), а также уменьшение в ткани печени общих липидов на 54,3% (р<0,05) и увеличение гликогена на 159% (р<0,001). Этот эффект находился на уровне или превышал действие официнального гепатозащитного средства силибинина.

Желчегонное действие целевого продукта исследовано в опытах in vivo на белых крысах в острых опытах по методу Литвинчук М.Д. и Новосилец З.И. [9]. В трехчасовых порциях собранной желчи определяли содержание холестерина и желчных кислот [10]. Целевой продукт в дозе 75 мг/кг в 2 мл воды вводили в желудок крысе за 30 мин перед опытом. В аналогичных условиях исследовали препараты сравнения - официнальное желчегонное средство фламин в терапевтической дозе [6]. Контролем служили опыты, в которых животным вводили воду (табл.2).

Таблица 2Желчегонное действие целевого продуктаУсловия опытаКоличество животныхКоличество желчи за 3 часа опыта (мл); М±m; п; р; % изм. к контр.Желчные кислоты (г/л) М+m; п; р; % изм. к контр.Холестерин желчи (г/л) М±m; п; р; % изм. к контр.Крысы, получавшие воду (контроль)111,7±0,15,32±0,470,34±0,02Крысы, получавшие извлечение из яблок73,0±0,04
р<0,01; +76,0%4,28±0,16
р<0,01; -20,0%0,38±0,02
р<0,05; +12,2%Крысы, получавшие фламин62,0±0,06
р<0,05; +17,6%2,85±0,01
р<0,001; -46,5%0,22±0,04
р<0,01; -35,3%

Как видно из данных табл.2, извлечение из яблок обладает значительной желчегонной активностью: по сравнению с контролем желчевыделение усиливается на 76% (р<0,001). Этот эффект превышает аналогичное действие фламина.

Исследование гипохолестеринемического действия целевого продукта проводили на белых крысах, у которых экспериментальная гиперхолестеринемия вызывалась внутрибрюшинным введением твина-80 в дозе 200 мг на 100 г массы тела животного [11]. Одновременно с твином-80 опытным животным перорально вводили в объеме 1 мл целевого продукта в дозе 75 мг/кг. Контрольные животные в аналогичных условиях получали 1 мл воды. В качестве препаратов сравнения использовались официнальные гипохолестеринемические средства: цетамифен, полиспонин и сапарал, вводимые в терапевтических дозах [6], в аналогичных условиях. У всех животных, а также в группе интактных крыс исследовалось содержание в сыворотке крови общего холестерина [7]. Результаты опытов обрабатывались методом вариантной статистики и приведены в таблице 3.

Таблица 3Гипохолестеринемическая активность целевого продуктаУсловия опытаКоличество животныхХолестерин сыворотки крови (ммоль/л)M±mр% изм. к контр.Интактные животные102,0±0,07  Животные с гиперхолестеринемией, получавшие воду (контроль)102,99±0,07  Животные с гиперхолестеринемией, получавшие целевой продукт81,89±0,150,001-37,6Животные с гиперхолестеринемией, получавшие воду (контроль)103,12±0,07  Животные с гиперхолестеринемией, получавшие полиспонин82,4±0,020,001-23,2Животные с гиперхолестеринемией, получавшие воду (контроль)102,9±0,17  Животные с гиперхолестеринемией, получавшие цетамифен92,35±0,120,05-19,5Животные с гиперхолестеринемией, получавшие воду (контроль)103,01±0,18  Животные с гиперхолестеринемией, получавшие сапарал102,39±0,10,05-20,4

Из данных таблицы 3 видно, что под влиянием целевого продукта у животных с гиперхолестеринемией уровень холестерина в крови снижался на 37,6% (р<0,001), тогда как под влиянием полиспонина - на 23,2% (р<0,001), цетамифена - на 19,5% (р<0,05), сапарала - на 20,4% (р<0,05).

Исследование ранозаживляющей активности целевого продукта, после термического ожога, проведено на 12 нелинейных крысах обоего пола в возрасте 80 суток. В качестве препарата сравнения использовали левомеколь, обладающий противомикробным и противовоспалительным действием, традиционно применяемый при лечении гнойных ран.

Для оценки результатов эксперимента был использован комплексный критерий определения эффективности заживления ожогов у экспериментальных животных. Данный критерий представляет собой совокупность трех адекватных методов исследования, показатели которых отражают различные стороны течения раневого процесса и обеспечивают наиболее достоверную и максимально объективную оценку процесса заживления.

Первый метод основан на исследовании характера заживления раны. Для этого были проведены гистологические исследования ожоговых поверхностей. Срезы кожи, полученные на 3-и, 7-е и 14-е сутки эксперимента, помещали в 10% раствор формалина с последующим экспериментом по стандартной методике и окраской гематоксилином и эозином, позволяющим определить влияние терапии на процессы репарации.

В результате проведенных исследований установлено, что заживление ожоговой поверхности происходит при применении целевого продукта и левомеколя, а также в контрольной группе животных, не получавших лечение. Однако наиболее быстро признаки начала краевой эпителизации, уже на 3-й сутки, наблюдались при применении целевого продукта. На 14-е сутки зарегистрированы пикообразные разрастания эпителия при практически полном смыкании ожогового дефекта. Под эпителизированными участками наблюдались разрастания соединительной ткани. У животных контрольной группы, а также группы сравнения, в меньшей степени, наблюдалась выраженная клеточно-лейкоцитарная инфильтрация, что приводило к удлинению сроков эпителизации и заживления раны по сравнению с животными опытной группы. Также было отмечено, что при использовании левомеколя эпителизация происходила с элементами патологической регенерации, проявляющейся в виде роста эпителия вокруг волосяного фолликула.

Бактериологические исследования позволяют оценить динамику заживления ран путем определения наличия микрофлоры в составе раневого отделяемого и ее качественной оценки. Количественный и видовой состав микрофлоры поверхности раны изучали путем посева смывов с поверхности раны на дифференциально-диагностические среды, после применения соответствующего лечения (табл.4). В качестве контроля использовали 8 смывов с ожоговых поверхностей, не подвергшихся лечению.

Таблица 4Среды и условия культивирования, применявшиеся для изучения бактериальной обсемененности ожоговой поверхностиМикроорганизмыСредаУсловия культивированияЭнтеробактерииЭвдо24 ч, аэробное, +37°ССтафилококкиЖелточно-солевой агар48 ч, аэробное, +37°СДрожжеподобные грибыСабуро48 ч, аэробное, +30°СОбщая микробная обсемененностьМясо-пептонный агар; Кровяной агар 5%48 ч, аэробное, +37°С

При исследовании микробиоценоза поверхности раны учитывали: общее количество микрофлоры; микроорганизмы сем. Enterobacteriaceae; стафилококки; грибы рода Candida; оценивали частоту встречаемости отдельных видов микроорганизмов, в зависимости от биотопа и применяемых препаратов для лечения ожогов, плотность бактериальной обсемененности в динамике на 7 и 14-е сут лечения ожогов с учетом индекса доминирования.

Основные представители, высеваемые с поверхностного слоя раны, - стафилококки (табл.5). При оценке биоценозов поверхностей раны особое значение уделяют сообществу стафилококков, являющихся доминирующими. Наибольший удельный вес среди стафилококков принадлежит S. saprophyticus, S. epidermidis, S. aureus.

Таблица 5Частота встречаемости экологических групп микроорганизмов в микробиоценозе раневой поверхности у крысБиотопЭкологические группы, %StaphylococcusStreptococcusEnterobacteriaceaeГрибы рода CandidaКонтроль100,037,587,575,0Целевой продукт75,012,525,025,0Левомеколь87,525,062,537,5

Анализ доминантности стафилококков показал, что на поверхности ожога контрольной группы доминировали золотистый (54,8) и эпидермальный (с гемолитическими свойствами) стафилококки (41,8) (табл.6).

Таблица 6Степень доминантности видов стафилококков в структуре сообщества различных биотопов ожоговой поверхностиБиотопВид стафилококков, %S. saprophyticusS. epidermidisS. aureusКонтроль3,441,854,8Целевой продукт23,645,930,5Левомеколь23,631,345,1

Наибольшая численность эпидермального и сапрофитного стафилококков при применении целевого продукта свидетельствует о его положительном влиянии на раневую поверхность, тогда как на обрабатываемых левомеколем биотопах доминировал золотистый стафилококк (45,1%), осложняющий течение раневого и ожеговых процессов и обуславливающий гнойные осложнения. Из данных табл.6 видно, что из 3-х образцов наименьшее содержание стафилококка золотистого в ранах, обрабатываемых целевым продуктом, что также оказывает положительный эффект на заживление ожоговых поверхностей.

При изучении общей бактериальной обсемененности в динамике установлено, что к 14 суткам эксперимента целевой продукт способствует снижению данного показателя, в отличие от левомеколя. Несмотря на тенденцию в уменьшении микробной плотности на всех биотопах выраженность этого процесса была неодинакова. Наиболее значительная положительная динамика наблюдалась при изучении микробной плотности поверхности раны, подвергнутой лечению целевьм продуктом, - снижение со 139,4±18,9 до 119,7±10,7 КОЕ/см². Снижение плотности микробных ассоциаций в динамике на 7 и 14-е сут зафиксировано также на раневых поверхностях, не подвергавшихся лечению, и после применения левомеколя с 254,9±34,5 до 230,2±22,2 КОЕ/см² и с 200,2±25,5 до 185,2±16,54 КОЕ/см² соответственно.

Третий критерий - динамика уменьшения площади кожного дефекта (на 3-й, 7-ые и 14-ые сутки эксперимента), из расчета на начало лечения - 0% заживления (табл.7).

Таблица 7Площадь кожной раны (% от площади ожога)Серия3 сут7 сут14 сутКонтроль (без лечения)85,0*45,836,9Целевой продукт52,036,025,5Левомеколь (препарат сравнения)94,562,126,7^*В ранние сроки в контрольной группе всегда наблюдается стягивание поверхности раны, что приводит к уменьшению площади раны на 10-15%

Как видно из таблицы 7, использование целевого продукта приводит к более выраженному уменьшению площади кожной раны по сравнению с контрольной группой и животными, получавшими левомеколь.

Таким образом, целевой продукт обладает достаточно выраженной ранозаживляющей активностью, его использование ускоряет процессы эпителизации, приводит к значительному уменьшению площади раны на 3 сутки и отчетливому снижению микробной плотности раневой поверхности.

Приведенные результаты позволяют заключить, что целевой продукт - водное извлечение из шрота яблок - характеризуется отчетливым гепатопротекторным, желчегонным, гипохолестеринемическим, противоожоговым и ранозаживляющим действием в сочетании с низкой токсичностью и может быть предложен в качестве лечебно-профилактического средства.

Таким образом, заявляемый способ позволяет получить полифункциональное средство, характеризуещееся гепатопротекторным, желчегонным, гипохолестеринемическим, ранозаживляющим действием, что обеспечивает перспективность его применения в качестве лечебно-профилактического средства. При этом повышается специфическая активность по сравнению с силибором, фламином, цетамифеном, сапаралом, левомеколем. Выход целевого продукта по заявленному способу в 7-8 раз выше силибора и фламина. Обеспечивается и упрощение процесса получения целевого продукта, при этом исключается использование дефицитного сырья.

ЛИТЕРАТУРА

1. Авторское свидетельство СССР №587940. Опубл. 15.01.78. Бюлл. №2.

2. Авторское свидетельство СССР №2436409. Опубл. 25.04.78. Бюлл. №15.

3. Требования к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ. Москва, 1985.

4. Сидоров К.К. Методы определения острой токсичности и опасности химических веществ (токсиметрия). Медицина, Москва, 1970.

5. Саркисов Д.С., Ремезов П.И., Воспроизведение болезней человека в эксперименте. М., 1960.

6. М.Д.Машковский. Лекарственные средства. Москва, ООО «Новая Волна», 2004.

7. Колб В.Г., Камышников B.C. Справочник по клинической химии. Минск, 1982.

8. Методы исследования химии и обмена углеводов и липидов (ЦОЛИУВ). М., 1962.

9. Литвинчук М.Д., Новосилец З.И. Бюлл. экспер. биол. и медицины, 1980, №6, с.750-752.

10. Мирошническо В.П. Исследование холято-холестериновой функции печени при вирусном гепатите и холеимазе новым методом фотометрического анализа (дисс.). Запорожье, 1978.

11. Поляков Э.Д., Климова М.А. Пат. физиология и экспер. терапия, 1973, №1, с.74-77.

Изобретение относится к медицине. Проводят экстрагирование шрота после получения сока яблок водой при температуре 80-90°С, при соотношении сырье - экстрагент 1:5 и кратности экстракции, равной 5. Объединенные водные извлечения сгущают досуха и получают целевой продукт с выходом 32% по отношению к массе исходного сырья. Изобретение позволяет реализовать указанное назначение. 7 табл.

Способ получения средства, обладающего гепатопротекторным, желчегонным, гипохолестеринемическим и ранозаживляющим действием путем экстракции шрота яблок, полученного после получения сока яблок, водой при температуре 80-90°С, соотношений сырье - экстрагент 1:5 и 5-кратной экстракции и сгущения извлечений.