СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОГО КОЛИЧЕСТВА АЛЬДОЗ В СМЕШАННОЙ СЛЮНЕ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/50 G01N33/66 

Изобретение относится к медицине и биоорганической химии. В организме человека наиболее доступным для биохимических анализов материалом является смешанная слюна (ротовая жидкость), использование которой для анализов имеет ряд преимуществ по сравнению с анализом крови.

Это простота, неинвазивность, безболезненность сбора материала для анализа и возможность многократного получения проб. Анализ крови «на сахар» широко используется при диагностике сахарного диабета и некоторых других патологических состояний организма. Большая часть присутствующих в крови сахаров (>96%) представлена глюкозой - от 3,2 до 5,5 ммоль/л. Содержание рибозы и дезоксирибозы в крови составляет 0,13-0,20 ммоль/л, фруктозы - от 0,027 до 2,75 мкмоль/л; галактоза, манноза и восстанавливающие дисахариды - в следовых количествах. При анализе крови «на сахар» определяют по сути суммарное количество восстанавливающих сахаров, представленных преимущественно альдогексозами и альдопентозами. В смешанной слюне человека содержится около 30 мг/л свободных моносахаридов (в т.ч. около 10 мг/л глюкозы).

Количественные методы определения сахаров многочисленны и делятся на редуктометрические и колориметрические.

В качестве прототипа авторы предлагают способ определения глюкозы Хагедорна-Йенсена // Практикум по биохимии. Под ред. С.Е.Северина, Г.А.Соловьевой, 2-е издание. М., МГУ, 1989 г., с.21-23//, в котором используют способность альдоз восстанавливать при нагревании в щелочной среде гексацианоферрат(III) калия (красную кровяную соль) в гексацианоферрат(II) калия (желтую кровяную соль). Избыток красной кровяной соли определяется йодометрическим титрованием. Свободный йод, выделившийся в количестве, эквивалентном избытку К₃[Fe(CN)₆], оттитровывают раствором Na₂S₂O₃. Количество сахара в крови вычисляют по данным титрования с помощью эмпирически составленной авторами метода таблицы.

Ввиду того, что ряд соединений неуглеводного характера (мочевая кислота, глютатион и др.) обладают наряду с глюкозой способностью восстанавливать ионы тяжелых и переходных металлов, результаты анализа оказываются завышенными. Ошибка может достигать 10-20%.

Четырехэтапное определение глюкозы с предварительным осаждением белков крови и приготовлением достаточно большого количества титрованных растворов требуют от аналитика значительных затрат времени на подготовку и проведение анализа.

Заявителями предложен быстрый и несложный метод прямого определения альдоз в смешанной слюне, имеющий определенные преимущества по сравнению с описанным выше классическим методом определения глюкозы.

При существенном сокращении времени проведения анализа для его осуществления не требуется каких-либо редких реактивов и специальных приборов. Анализ основан на способности глюкозы при нагревании в щелочной среде обесцвечивать индикатор метиленовый синий (метиленовую синь).

Оборудование и реактивы:

водяная баня; лабораторный термометр на 100°С; микробюретка на 2 мл; пипетка на 2 мл; пипетка на 0,2 мл; градуированная пипетка на 1 мл; градуированная пипетка на 10 мл; 0,00025 М раствор метиленового синего; 2 N раствор КОН; 1 М раствор KNO₃; 0,0025 М раствор глюкозы; дистиллированная вода.

Ход определения

После предварительного осаждения белков по стандартным методикам // Практикум по биохимии. Под ред. С.Е.Северина, Г.А.Соловьевой, 2-е издание. М., МГУ, 1989 г., с.21-23 // к пробе ротовой жидкости объемом 2,0 мл добавляют 0,2 мл 2 N раствора КОН, 0,6 мл 1 М раствора KNO₃, 7,2 мл дистиллированной воды, доводя общий объем смеси до 10 мл, и нагревают на водяной бане до t=80°С±2,0°С.

Полученную смесь медленно по каплям, дожидаясь полного обесцвечивания, оттитровывают 0,00025 М раствором метиленовой сини до появления не исчезающего при 80°С(±2°С) бледно-голубого окрашивания титруемого раствора. Параллельно титруют 2 колбы с контрольными растворами, содержащими взамен 2 мл ротовой жидкости 2 мл стандартного 0,0025 М раствора глюкозы. Содержание суммы альдоз (глюкозы, рибозы, 2-дезоксирибозы) в ммоль/л рассчитывают по формуле:

С_м.с. - концентрация раствора метиленовой сини (моль/л);

V_м.с. - объем раствора метиленовой сини (мл);

V_сл. - исходный взятый для анализа объем смешанной слюны (мл).

Заявленным способом проанализировано 50 образцов смешанной слюны пациентов стоматологической поликлиники ТГМА. В 27 образцах содержание суммы альдоз не превышало нормы (0,19 ммоль/л). Среди пациентов этой группы не выявлено тяжелых патологий пародонта и эндокринной системы.

В 23 образцах ротовой жидкости содержание суммы альдоз определено в количестве от 0,2 до 2,1 ммоль/л. Среди пациентов этой группы у 13 человек диагностирован парадонтит и у 10 человек - патологии парадонта (парадонтоз и парадонтит) в сочетании с сахарным диабетом.

Пример 1. История болезни №27830. Пациент К., возраст 55 лет.

Обратился в стоматологическую поликлинику ТГМА в марте 2007 г. с жалобами на состояние парадонта. Содержание суммы альдоз в ротовой жидкости, определенное заявленным способом, составило 1.10 ммоль/л. Проведенный впоследствии анализ крови показал уровень сахара 17,3 ммоль/л. Диагноз после обследования состояния ротовой полости: парадонтит; после обследования у эндокринолога - сахарный диабет 2 типа.

Пример 2. История болезни №30719. Пациентка М., возраст 65 лет.

Обратилась в стоматологическую поликлинику ТГМА с жалобами на состояние парадонта. Содержание суммы альдоз в ротовой жидкости, определенное заявленным способом, составило 0,59 ммоль/л. Диагноз после обследования ротовой полости: парадонтит.

Проведенный анализ крови «на сахар» (4,65 ммоль/л) и обследование у эндокринолога не выявили патологий эндокринной системы.

Таким образом, разработанный авторами способ определения альдоз в смешанной слюне может служить для диагностики патологических состояний парадонта и в некоторых случаях - для диагностики патологий эндокринной системы, сопряженных с патологиями парадонта.

Изобретение относится к области биохимии и медицине. Способ включает следующие стадии. Пробу ротовой жидкости объемом 2,0 мл после осаждения белков по стандартным методикам подщелачивают 2 N раствором КОН, добавляют 1 М раствор KNO₃ для создания постоянной ионной силы и доводят объем смеси дистиллированной водой до 10 мл. Полученную смесь нагревают на водяной бане до t=80±2°C и оттитровывают 0,00025М раствором метиленовой сини. Содержание альдоз (в ммоль/л) рассчитывают по закону эквивалентов. Полученные заявленным способом результаты анализа смешанной слюны могут служить для диагностики состояния парадонта и в некоторых случаях - для диагностики патологий эндокринной системы.

Способ определения суммарного количества альдоз, отличающийся тем, что после предварительного осаждения белков в пробе ротовой жидкости объемом 2 мл к ней добавляют 0,2 мл 2N раствора КОН, 0,6 мл 1М раствора KNO₃, 7,2 мл дистиллированной воды, доводя общий объем смеси до 10 мл, и нагревают на водяной бане до t=80±2°C, подогретую смесь медленно по каплям оттитровывают 0,00025М раствором метиленовой сини до появления не исчезающего при t=80±2°C бледно-голубого окрашивания и рассчитывают суммарное количество альдоз в ммоль/л по формуле

где С_м.c. - t=80±2°C концентрация раствора метиленовой сини, моль/л;

V_м.с. - объем раствора метиленовой сини, мл;

V_сл. - исходный, взятый для анализа объем смешанной слюны, мл.