СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛЮКОЗЫ В РОТОВОЙ ЖИДКОСТИ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии и биоорганической химии.

Глюкоза в организмах человека и животных - основной представитель углеводов, входящий в состав важнейших биологических жидкостей: крови, мочи, слюны.

В клинической практике для диагностики патологических состояний используются результаты анализов крови и мочи «на сахар», т.е. содержание глюкозы.

Содержание глюкозы в крови здорового человека колеблется от 0,8 до 1,2 г/л [Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. /Под ред. проф. Т.Т.Березова. М., Медицина. 1976 г. с.138]. При некоторых заболеваниях содержание сахара в крови возрастает (гипергликемия) и может достигать в тяжелых случаях 50-80 г/л. Параллельно увеличивается содержание глюкозы в ротовой жидкости [Денисов А.Б. Слюнные железы. Слюна. М., Изд. РАМН, 2005 г. с.53] и сахар обнаруживается в моче. Понижение содержания сахара в крови (гипогликемия) наблюдается реже и связано с нарушением функций печени и поджелудочной железы.

Методы определения глюкозы в водных растворах и крови человека весьма многочисленны [Камышников B.C. Клинико-биохимическая лабораторная диагностика. Справочник в двух томах. Том II, с.10] и делятся на ферментативные и неферментативные.

Аналогом заявленного способа авторы предлагают наиболее распространенный ферментативный метод определения глюкозы в крови с помощью препарата, содержащего ферменты, глюкозооксидазу и пероксидазу (по В.К.Городецкому) [Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии. /Под ред. проф. Т.Т.Березова. М.: Медицина, 1976 г. с.141], отличается высокой специфичностью, но позволяет определять глюкозу в исследуемой жидкости только при содержании от 0,2 до 4,0 г/л. Он включает 3 ступени биохимических превращений и 4- чисто химическую: окисление о-толуидина с последующим фотоколориметрическим определением окисленной формы красителя методом калибровочного графика.

Использование четырехступенчатой цепочки превращений с применением рабочего раствора, содержащего два ферментативных препарата, усложняет технику выполнения анализа и увеличивает вероятность ошибки эксперимента. Нельзя не отметить, что применение в лабораторной практике ароматического амина о-толуидина влечет за собой опасность канцерогенеза.

Прототипом заявленного способа авторы считают неферментативное определение глюкозы по Хагедорну-Иенсену в безбелковом фильтрате крови [Руководство к лабораторным занятиям по биологической химии /Под ред. проф. Т.Т.Березова. М., Медицина, 1976 г. с.138]. Метод основан на восстановлении железа (III) в составе гексацианоферрата (III) калия (красной кровяной соли) до железа (II) с получением желтой кровяной соли K₄[Fe(CN)₆] при нагревании в щелочной среде Избыток красной кровяной соли определяется иодометрическим титрованием. Свободный иод, выделившийся в количестве, эквивалентном избытку K₃[Fe(CN)₆], оттитровывается раствором Na₂S₂O₃.

Определение сахара производят в безбелковом фильтрате крови, поэтому необходимо предварительно осадить белки крови. Для этого берут 2 пронумерованные пробирки, в каждую из них наливают из бюретки по 5 мл 0,45% раствора сернокислого цинка и по 1 мл 0,1 н. NaOH. Образуется студенистый осадок гидроксида цинка.

В микропипетку, предварительно сполоснутую раствором оксалата натрия, набирают 0,1 мл крови. Пипетку с кровью погружают до дна в пробирку 1 с гидроксидом цинка, осторожно выдувают кровь и промывают пипетку 2-3 раза путем втягивания и выпускания верхнего слоя жидкости. Таким же образом сухой пипеткой (или той же самой, сполоснутой раствором оксалата натрия) набирают кровь в пробирку 2. Пробирки 3 и 4 - контрольные (без крови). Затем все четыре пробирки помещают в кипящую водяную баню на 3 мин и по истечении этого времени вынимают и ставят в штатив.

Жидкость во всех четырех пробирках фильтруют в заранее пронумерованные сахарные стаканчики через вату, которая кладется в виде маленького плотного кусочка в конус воронок. Вату предварительно промывают дистиллированной горячей водой 3 раза, при этом каждый раз отжимают ее, надавливая ладонью на края воронки. Пробирки, в которых нагревалась кровь, и воронки с ватой после того, как отфильтрована вся жидкость, промывают 3 раза горячей дистиллированной водой по 1-3 мл (вату каждый раз отжимают указанным выше способом).

К фильтрату в каждый стаканчик прибавляют по 2 мл щелочного раствора железосинеродистого калия и пробы нагревают в кипящей водяной бане точно 15 мин (за это время глюкоза полностью окисляется). После охлаждения к жидкости добавляют 3 мл тройного раствора (смесь растворов ZnSO₄, NaCI, KI). Содержимое стаканчиков перемешивают взбалтыванием и подкисляют 2 мл 3% уксусной кислоты. Выделившийся иод оттитровывают тиосульфатом натрия (Na₂S₂O₃), используя в качестве индикатора 2 капли 1% раствора крахмала; титруют до исчезновения синей краски.

Чтобы предотвратить образование железосинеродистого калия из железистосинеродистого калия, последний выводится из сферы реакции с помощью сернокислого цинка. Добавление сернокислого цинка приводит к образованию нерастворимой комплексной соли.

Количество сахара в крови вычисляют по данным титрования с помощью эмпирически составленной авторами метода таблицы.

Ввиду того, что ряд соединений неуглеводного характера (мочевая кислота, глютатион и др.) обладают наряду с глюкозой способностью восстанавливать ионы тяжелых и переходных металлов, результаты анализа оказываются завышенными. Ошибка может достигать 10-20%.

Четырехэтапное определение глюкозы с предварительным осаждением белков крови и приготовлением достаточно большого количества титрованных растворов требуют от аналитика значительных затрат времени на подготовку и проведение анализа.

Авторы предлагают быстрый и доступный метод определения глюкозы в ротовой жидкости, имеющий определенные преимущества по сравнению с описанными выше классическими методами.

При значительном сокращении времени проведения анализа для его осуществления не требуется каких-либо редких реактивов и специальных приборов. Анализ выполняют следующим образом:

оборудование и реактивы: водяная баня, лабораторный термометр на 100°С, 2N раствор КОН, 0,1% р-р метиленового синего, градуированные термостойкие пробирки (по числу проб ротовой жидкости), неградуированные пипетки - 2 шт., дистиллированная вода.

Ход определения:

в пробирку набирают 1 мл свежеотобранной ротовой жидкости, добавляют 1 мл дистиллированной воды, 2 капли 2N раствор КОН и 3 капли 0,1%-ного р-ра метиленового синего. Перемешивают встряхиванием и нагревают на водяной бане до ˜80°С (±2°С).

При содержании глюкозы в анализируемом образце>0,12% наблюдается полное исчезновение синей окраски индикатора. При меньшем содержании глюкозы окраска сохраняется.

Заявленным способом было протестировано 50 образцов ротовой жидкости (смешанной слюны), взятых у пациентов стоматологической поликлиники с жалобами на состояние пародонта. Ротовая жидкость собиралась натощак после тщательного прополаскивания ротовой полости дистиллированной водой. Содержание глюкозы, превышающее 0,12%, было обнаружено в смешанной слюне шести пациентов, у которых в дальнейшем при обследовании были обнаружены нарушения функции поджелудочной железы.

Клинический пример №1

Амбулаторная карта №76278. Пациентка Н., 56 лет, обратилась в стоматологическую поликлинику в сентябре 2006 г. с жалобами на состояние пародонта. В образце ротовой жидкости предложенными авторами способом обнаружено повышенное содержание глюкозы (>0,12%).

При дальнейшем обследовании у эндокринолога и в крови пациента было обнаружено содержание сахара, превышающее норму.

Клинический пример №2

Амбулаторная карта №69179. Пациент Т., 47 лет, обратился в стоматологическую поликлинику в сентябре 2006 г. с жалобами на состояние пародонта. Предложенным авторами способом в образце ротовой жидкости не обнаружено превышения содержания глюкозы. Анализ крови, выполненный параллельно с анализом ротовой жидкости, также показал содержание глюкозы в пределах нормы.

Изобретение относится к медицине, к области лабораторной диагностики. Сущность способа: к 1 мл свежеотобранной ротовой жидкости добавляют 1 мл дистиллированной воды, 2 капли 2N раствора КОН и 3 капли 0,1% раствора метиленового синего; содержимое перемешивают встряхиванием и нагревают на водяной бане до 80°С. При сохранении синей окраски индикатора делают вывод о том, что содержание глюкозы в ротовой жидкости соответствует норме и не превышает 0,12%; при полном исчезновении синей окраски индикатора - о превышении нормального значения содержания глюкозы. Способ доступен и прост в исполнении. Использование способа позволяет в короткие сроки определить повышенное содержание глюкозы (>0,12%) в пробе ротовой жидкости объемом 1 мл.

Способ определения глюкозы в ротовой жидкости, включающий определение содержания глюкозы в биологической жидкости, отличающийся тем, что к 1 мл свежеотобранной ротовой жидкости добавляют 1 мл дистиллированной воды, 2 капли 2 N раствора КОН и 3 капли 0,1%-ного раствора метиленового синего, перемешивают содержимое встряхиванием и нагревают на водяной бане до 80°С (±2°С) и при сохранении синей окраски индикатора говорят о нормальном содержании глюкозы в ротовой жидкости - менее 0,12%, а при полном исчезновении синей окраски индикатора делают выводы о превышении нормального значения содержания глюкозы в ротовой жидкости.