СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИБИРЕЯЗВЕННОГО ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА Российский патент 2008 года по МПК A61K39/07 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к технологии получения сибиреязвенного протективного антигена (ПА), в частности к сибиреязвенным вакцинам, и может быть использовано в медицине и ветеринарии для специфической профилактики сибирской язвы.

Изобретение позволяет воспроизводимо получать нативный ПА с активностью в реакции диффузионной преципитации (РДП) в геле более 100 ЕА·мл^-1, сократить время и количество технологических стадий получения стерильного концентрированного ПА.

Сибиреязвенный ПА используется для получения двух видов вакцин: сибиреязвенной очищенной адсорбированной химической и комбинированной жидкой и сухой (одним из компонентов которых он является), по иммунологическим и физико-химическим показателям, удовлетворяющим требования, предъявляемые национальным органом контроля медицинских иммунобиологических препаратов (МИБП) к этим вакцинам.

Известен способ получения сибиреязвенного ПА при глубинном анаэробном культивировании штамма B.antracis на питательной среде, содержащей бикарбонат натрия при аэрировании культуральной жидкости инертным газом(патент RU 2223114 C2, 10.02.2004). Данный способ используется при приготовлении вакцины сибиреязвенной очищенной адсорбированной химической жидкой, включающем в себя следующие стадии:

приготовление маточной посевной культуры производственного штамма СТИ-1;

приготовление производственной питательной среды;

получение нативной культуры штамма СТИ-1;

получение нативного ПА;

получение стерильного ПА, включающее сепарирование нативного ПА на сепараторе SA-1-02-575, концентрирование на установке УФУ-4,0, грубую, тонкую и стерилизующую фильтрацию через бумажный фильтр «синяя лента», фильтрующие мембраны МФА №2 и МФА №1;

сорбцию стерильного концентрированного ПА на геле гидроокиси алюминия;

стабилизацию раствором формалина и отмывку сорбированного ПА;

разведение сорбированного концентрированного ПА, розлив;

контроль качества полученного сорбированного концентрированного ПА.

Недостатком вышеуказанного способа является низкая воспроизводимость при получении нативного ПА в ферментерах с требуемой активностью ПА в реакции диффузионной преципитации 100 ЕА·мл^-1 и более. Кроме того, при выделении ПА из культуральной жидкости используется метод сепарирования, который по времени более длителен и имеет следующие недостатки (Отчет о НИР. Совершенствование технологии производства химической сибиреязвенной вакцины - Арх. Вч 23527 - инв. №30353, 1997. - С.28):

сложность эксплуатации (вибрация, шум, необходимость разборки и мойки) аппарата;

воздействие на микробную культуру центробежной силы, перепада давления и гидродинамического удара;

отсутствие герметизации и обеспечения асептических условий ведения процесса.

Кроме того, известно, что при выращивании микробной популяции вакцинного сибиреязвенного штамма СТИ-1 в присутствии бикарбонат-иона, добавляемого в момент начала культивирования, нарастает доля клеток со структурными поломками гена pag в условиях несбалансированного роста (Sirard J.C., Mocr М., Fonet A. Tne three Bacillus anthracis taxin genesare coordinately regulated by bicarbonate and temperature. / J. Bacterid / - 1962/ - vol.52, p.632-645), что отрицательно сказывается на продукции антигена.

Задачей изобретения является стабильное получение нативного сибиреязвенного ПА с высокой активностью, сокращением времени получения стерильного концентрированного ПА с высокой активностью.

Поставленная задача решается изменением момента введения раствора бикарбоната натрия в процессе культивирования и получением стерильного концентрированного ПА методом ультра- и микрофильтрации.

Возможность практического использования заявляемого изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Изменение времени введения индуктора синтеза ПА-раствора бикарбоната натрия (NaHCO₃).

Известно, что при выращивании микробной популяции вакцинного сибиреязвенного штамма СТИ-1 в присутствии бикарбонат-иона, добавляемого в момент начала культивирования, нарастает доля клеток со структурными поломками гена pag в условиях несбалансированного роста (Sirard J.C., Mocr M., Fonet A. Tne three Bacillus anthracis taxin genesare coordinately regulated by bicarbonate and temperature. / J. Bacterid / - 1962 / - vol.52, p.632-645).

Для уменьшения отрицательного влияния на развитие микробной культуры в начальной фазе роста, вызываемого присутствием в ПС бикарбоната натрия, целесообразно введение индуктора (NaHCO₃) синтеза ПА в динамике культивирования на 6...8 час роста, что контролируется содержанием глюкозы в среде и значением рН культуральной жидкости. Бикарбонат натрия активирует экспрессию гена рад, детерминирующего синтез ПА, на поздней лаг-фазе и протяжении экспоненциальной фазы роста.

Динамика развития микробной популяции вакцинного сибиреязвенного штамма и накопления ПА по существующему способу (на основании пяти циклов ферментации) технологии представлены в таблице 1, по заявляемому способу в таблице 2 (на основании 10 циклов ферментации).

Как видно из результатов, представленных в таблицах 1 и 2, введение бикарбоната натрия на 6 часов культивирования по заявляемому способу технологии в отличие от существующего способа благоприятно сказывается на продукции ПА, антигенная активность которого к 12 часам культивирования выходит на регламентируемый показатель 100 ЕА·мл^-1, а к 19 часам роста антигенная активность возрастает до 200 ЕА·мл^-1 и сохраняется на этом уровне до окончания процесса культивирования.

Пример 2. Выбор эффективного оборудования в процессе получения стерильного концентрированного ПА.

Использование ультра- и микрофильтрационной установки «Сартокон» в технологическом процессе выделения, стерилизации и концентрирования ПА дает возможность:

проводить технологический процесс в асептических условиях;

осуществлять стерилизацию оборудования химическим и термическим способами и их сочетанием, что соответствует требованиям GMP;

быстро заменять фильтрующие элементы в случае их выхода из строя во время проведения технологического процесса благодаря модульной системе фильтров установки «Сартокон».

Заявляемый способ получения стерильного концентрированного ПА с использованием установки «Сартокон» при проведении процесса микро- и ультрафильтрации уменьшает количество стадий с 6 до 2, сокращает время выделения ПА из культуральной жидкости и всего цикла в целом по сравнению с существующим способом и включает в себя:

выделение ПА из культуральной жидкости и одновременную его стерилизацию;

концентрирование стерильного ПА.

Технологические характеристики проведения процесса концентрирования ПА по существующему и заявленному способам технологии представлены в таблице 3.

Как видно из данных, представленных в таблице 3, применение микро- и ультрафильтрационной установки «Сартокон» по заявленному способу в значительной степени уменьшает время выделения ПА из культуральной жидкости и всего технологического процесса в целом по сравнению с существующим способом технологии.

Таблица 1Динамика развития микробной культуры по существующему способу, n=5Определяемый показательВремя выращивания, ч0912151820рН, ед. рН8,48,17,77,67,47,0Биомасса, ед. экс.602502803505601300Утилизация глюкозы, %0518284368Антигенная активность в РДП, ЕА. мл^-10252525...5025...5025...100

Таблица 2Динамика развития микробной культуры по заявляемому способу, п=10Определяемый показательВремя выращивания, ч061219рН, ед. рН7,77,2/7,9*7,67,4Биомасса, ед. экс.7565014801860Утилизация глюкозы, %01679100Антигенная активность в РДП, ЕА. мл^-10050...100100...200Примечание: * - значение рН культуры до и после внесения бикарбоната натрия.

Таблица 3Временные характеристики технологического процесса по существующему и заявляемому способу, n=3Стадии технологического процесса по существующему способуВремя проведения процесса по существующему способу, минСтадии технологического процесса по заявляемому способуВремя проведения процесса по заявляемому способу, минВыделение ПА из культуральной жидкости методом сепарирования на «Westfalia» SA-02-57590±10Выделение ПА из нативной культуры и одновременная его стерилизация методом микрофильтрации на установке «Сартакон-2»40±10Концентрирование нативного ПА на установке УФС -0,490±20Концентрирование стерильного ПА методом ультрафильтрации на установке «Сартакон-2».40±10Грубая фильтрация (колба Бунзена)120±10отсутствуетотсутствуетТонкая фильтрация, фильтр МФА-А №260±10отсутствуетотсутствуетСтерилизующая фильтрация, фильтр МФА-А №160±10отсутствуетотсутствуетОбщее время проведения по существующему способу составляет 420±20 минутОбщее время проведения заявляемого способа составляет 80±10 минут

Изобретение относится к области биотехнологии. Способ включает культивирование вакцинного штамма на стерильной питательной среде с бикарбонатом натрия. При этом бикарбонат натрия вводят в питательную среду на протяжении экспоненциальной фазы роста на 6-8 ч культивирования вакцинного штамма. После окончания процесса культивирования выделение, концентрирование и стерилизацию протективного антигена осуществляют на одной установке ультра- и микрофильтрации. Способ обеспечивает стабильное получение нативного сибиреязвенного протективного антигена с активностью в РДП более 100 ЕА·мл^-1, а также сокращение времени и стадий получения стерильного концентрированного протективного антигена с активностью в РДП не менее 200 ЕА·мл^-1. 3 табл.

Способ получения сибиреязвенного протективного антигена, включающий культивирование вакцинного штамма на стерильной питательной среде с бикарбонатом натрия, отличающийся тем, что бикарбонат натрия вводят в питательную среду на протяжении экспоненциальной фазы роста на 6-8 ч культивирования вакцинного штамма, а после окончания процесса культивирования выделение, концентрирование и стерилизацию протективного антигена осуществляют на одной установке ультра- и микрофильтрации.