СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА И БЕЛКА S-СЛОЯ EA1 ИЗ АСПОРОГЕННОГО РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА B. anthracis 55ΔТПА-1Spo Российский патент 2013 года по МПК C12P21/00 A61K39/02 C12N1/21 C12R1/07 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к технологии получения иммуногенных сибиреязвенных антигенов - протективного антигена и белка ЕА1, и может быть использовано в производстве средств специфической профилактики сибирской язвы.

В. anthracis - этиологический агент особо опасного инфекционного заболевания -сибирской язвы. Высокая вирулентность возбудителя сибирской язвы обусловлена генами, детерминирующими синтез капсулы и экзотоксина. Капсула защищает микробную клетку от фагоцитоза, а экзотоксин, состоящий из протективного антигена, отечного и летального факторов, вызывает патологические реакции макроорганизма. Один из компонентов токсина - протективный антиген, обладает выраженным иммуногенным потенциалом и является действующим началом всех сибиреязвенных вакцин [1]. Несмотря на доминирующее значение протективного антигена в процессе формирования иммунного ответа, не подвергается сомнению участие в иммуногенезе и других антигенов, в том числе белка S-слоя - ЕА1 [2]. Введение в состав вакцины дополнительных иммуногенных антигенов является одним из подходов к повышению их иммунологической эффективности.

В России производится комбинированная вакцина, представляющая собой композицию спор вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 и выделенного из него протективного антигена, адсорбированного на гидроокиси алюминия. В Великобритании лицензирована химическая вакцина, состоящая из осажденного квасцами протективного антигена, выделенного из культурального фильтрата вакцинного штамма В. anthracis Sterne 34F₂. Лицензированная в США химическая вакцина содержит адсорбированный на гидроокиси алюминия протективный антиген, полученный из культурального фильтрата протеазонегативного производного В. anthracis Sterne 34F₂ - В. anthracis V770-NP1-R.

Известны способы получения протективного антигена из вакцинных штаммов В. anthracis СТИ-1, В. anthracis Sterne 34F₂, В. anthracis V770-NP1-R [3, 4, 5]. Известен способ получения протективного антигена из штамма В. anthracis 55 ВНИИВВиМ, используемого в ветеринарии [6]. Во всех перечисленных способах продуцентами протективного антигена сибиреязвенного микроба являются штаммы схожие между собой по методу получения - элиминация плазмиды pXO2, и плазмидному составу - рХО1⁺ pXO2^-. Ввиду отсутствия плазмиды pXO2 они лишены способности синтезировать капсулу и, как следствие, вызывать инфекционный процесс при попадании в восприимчивый организм. Однако данные штаммы характеризуются относительно высокой реактогеностью, обусловленной, помимо прочего, синтезируемыми ими факторами патогенности - отечным и летальным факторами. Кроме того, они, как все типичные представители рода Bacillus, образуют споры, устойчивые к действию большинства дезинфицирующих агентов. Использование спорообразующих микроорганизмов в промышленном производстве вакцинных препаратов сопряжено с риском бактериальной контаминации оборудования и помещений.

Еще одним недостатком способов с использованием вакцинных штаммов-продуцентов является их неспособность обеспечить высокий уровень продукции протективного антигена ввиду генетических особенностей, а именно наличия в геноме В. anthracis сложной системы регуляции, лимитирующей его синтез [7, 8]. Уровень продукции протективного антигена аттенуированными штаммами зависит от содержания СО₂ в атмосфере и составляет не более 15-30 мкг/мл. Для увеличения продукции протективного антигена разработан способ, заключающийся в глубинном культивировании штамма В. anthracis СТИ-1 на питательной среде с бикарбонатом натрия с непрерывной аэрацией культуральной жидкости смесью нескольких газов - азотом, аргоном, гелием [9]. Однако использование смеси различных газов для аэрирования излишне усложняет технологию культивирования. Повышенное содержание СО₂ в среде выращивания достигается добавлением в нее бикарбоната натрия. Однако установлено, что в этих условиях в микробной популяции возрастает доля клеток с мутациями в гене pag, кодирующем его синтез. Известен способ, предлагающий добавление в среду бикарбоната натрия на определенной стадии роста микроорганизма [10]. Это приводит к более стабильной продукции протективного антигена, но не изменяет возможного предела его синтеза, обусловленного особенностями генотипа.

Все вышеуказанные способы получения протективного антигена из вакцинных штаммов предполагают приготовление маточной посевной культуры штамма В. anthracis; глубинное анаэробное культивирование на питательной среде, содержащей бикарбонат натрия; концентрированно и стерилизацию культурального фильтрата; осаждение присутствующего в фильтрате протективного антигена на геле гидроокиси алюминия или аналогичном адъюванте. Однако они не включают этапы тонкой хроматографической очистки, вследствие чего получаемый продукт имеет неопределенный состав и содержит большое количество балластных веществ, что не соответствует современным требованиям, представляемым к профилактическим препаратам. Кроме того, получаемый такими способами протективный антиген, даже при включении этапа хроматографии, будет содержать примеси отечного и летального факторов, ввиду сложности хроматографического разделения белков с очень близкими значениями молекулярных масс. Наличие в химических вакцинах ненормированных количеств реактогенных компонентов сибиреязвенного токсина может привести к развитию поствакцинальных осложнений.

На сегодняшний день преимуществом обладают способы получения протективного антигена из генно-инженерных продуцентов с клонированным геном pag, детерминирующим его синтез.

Известны способы получения протективного антигена из рекомбинантных штаммов на основе бациллярных штаммов В. anthracis и В. subtilis [11, 12]. Перечисленные способы используют генно-инженерные продуценты, содержащие гибридные плазмиды с включенным в их состав геном pag. Данные штаммы не синтезируют факторы патогенности сибиреязвенного микроба - капсулу, отечный и летальный факторы, вследствие чего безопасны. Кроме того, они обладают низкой активностью протеолитических ферментов, в результате уровни продукции протективного антигена достигают высоких значений - 100-120 мкг/мл. Способы получения протективного антигена из рекомбинантных бациллярных штаммов включают подготовку посевной культуры; выращивание в обычных условиях на питательной среде с интенсивным перемешиванием для аэрирования; концентрированно и стерилизацию культурального фильтрата; выделение и хроматографическую очистку протективного антигена. Однако недостатком предложенных технологий является образование в процессе культивирования микробных спор, устойчивых к ультрафиолетовому облучению, средствам дезинфекции и сохраняющихся во внешней среде в течение многих десятилетий.

Известны способы получения сибиреязвенного протективного антигена из штаммов Escherichia coli, содержащих клонированный ген pag [13, 14]. Однако в отличие от представителей рода Bacillus, обладающих способностью к экзогенному синтезу белков, для Е. coli характерен внутриклеточный механизм секреции протективного антигена, что негативным образом сказывается на количестве получаемого целевого продукта, и кроме того, усложняет его выделение и очистку. Для производства нетоксичной противосибиреязвенной вакцины была предложена процедура получения протективного антигена из штамма Е. coli DH5α, с клонированным геном pag [15]. Увеличения выхода белкового антигена удалось достичь с помощью усовершенствования процесса культивирования в ферментере, в качестве добавок к стандартной среде использовали полиолы, углеводы, органические кислоты и минеральные соли. Однако изменение технологии за счет внесения существенных дополнений в состав среды культивирования снижает ее рентабельность.

Известен метод создания вакцины из сибиреязвенного протективного антигена [16]. В данном патенте описан способ получения протективного антигена из аспорогенного рекомбинантного бациллярного штамма. Способ включает подготовку посевной культуры продуцента; выращивание при постоянной температуре 37±0,1°С до достижения стационарной фазы роста; фильтрацию через бактериальный фильтр (0,2 мкм); концентрированно культурального фильтрата и диафильтрацию; выделение и очистку протективного антигена на хроматографической системе высокого давления с использованием ионообменных носителей. Однако в предложенном способе в качестве продуцента протективного антигена используется штамм В. anthracis DELTA Sterne-1(pPA102)CR4, полученный на основе бесплазмидного производного вакцинного штамма В. anthracis Sterne, обладающего высокой активностью протеолитических ферментов [17], которая лишь частично купируется за счет ингредиентов среды выращивания [18]. Протеолитическое действие продуцирующего микроорганизма представляет серьезную проблему для организации технологических линий получения биологически-значимых антигенов. Помимо этого, масштабируемое культивирование рекомбинантного штамма В. anthracis DELTA Sterne-1(pPA102)CR4 осуществляется на питательной среде с добавлением селективного антибиотика в относительно высокой концентрации - 40 мкг/мл. Использование антибиотика в технологии получения бактериального антигена, входящего в состав препарата для вакцинации людей, нежелательно. Кроме всего перечисленного, заложенный в основу способа продуцент недоступен российским производителям.

Известен способ получения белка S-слоя сибиреязвенного микроба ЕА1[19]. Способ включает следующие этапы: выращивание штамма В. anthracis V770-NP-1R (рХО1⁺ pXO2^-) в жидкой питательной среде (R medium) в течение 18-20 часов, осаждение клеточной массы центрифугированием, дезинтеграцию клеточных стенок, инкубацию с гуанидин-гидрохлоридом в течение 2 часов при комнатной температуре, осаждение гуанидинового экстракта спиртом с последующим отмыванием дистиллированной водой. Однако получаемый с помощью этого способа конечный продукт содержит помимо ЕА1 многочисленные сопутствующие белки, что не отвечает требованиям, предъявляемым к современной химической вакцине.

Проведенный анализ уровня техники, включающий поиск по патентам и научно-техническим источникам информации показал, что сведений о способе, объединяющем получение протективного антигена и белка ЕА1 в один технологический процесс, не обнаружено.

Задачей изобретения является разработка биологически безопасного и эффективного способа получения препаративных количеств высокоочищенных антигенов сибиреязвенного микроба - протективного антигена и белка ЕА1, необходимых для создания химических вакцин.

Технический результат заключается в возможности получения в одной технологической цепочке препаративных количеств высокоиммуногенных препаратов протективного антигена и белка ЕА1 сибиреязвенного микроба, эффективно защищающих от заражения возбудителем сибирской язвы, взаимодействующих со структурами врожденного иммунитета и не токсичных для макроорганизма.

Технический результат достигается способом получения протективного антигена и белка ЕА1 сибиреязвенного микроба, включающим подготовку посевной культуры штамма-продуцента; культивирование аспорогенного рекомбинантного штамма В. anthracis 55ΔТПА-1Spo^- при температуре 37±0,1°С в течение 16 часов в жидкой питательной среде, содержащей триптон с концентрацией не менее 20 мг/мл, с постоянным перемешиванием при 150 об/мин; отделение клеточной массы с применением фильтрационного модуля с мембраной, имеющей диаметр пор 0,2 мкм; выделение белка ЕА1 из отмытой клеточной массы и его очистку при помощи последовательных этапов инкубации с содержащим 1% додецилсульфат натрия экстрагирующим буфером, диафильтрации с использованием мембранных фильтров с пределом исключения белков с молекулярной массой 30 кДа и двухступенчатой ионообменной хроматографией на гидроксиапатите; выделение протективного антигена из культурального фильтрата и его очистку при помощи последовательных этапов концентрирования и диафильтрации с использованием мембранных фильтров с пределом исключения белков с молекулярной массой 30 кДа и двухступенчатой хроматографии на ионообменном носителе и носителе для гель-фильтрации.

В заявляемом способе в качестве продуцента протективного антигена и белка S-слоя (ЕА1) сибиреязвенного микроба используют аспорогенный и авирулентный генно-инженерный штамм В. anthracis 55ΔТПА-1Spo^-. Штамм разработан ФКУЗ Российским научно-исследовательским институтом "Микроб" и является объектом охраны по патенту РФ №2321629. Штамм создан генно-инженерным путем на основе бесплазмидного производного вакцинного штамма В. anthracis 55, он сохраняет биологические свойства при культивировании на питательных средах и хранении, в нем отсутствуют детерминанты синтеза основных факторов вирулентности возбудителя сибирской язвы, а наличие хромосомной мутаций определяет аспорогенный фенотип. Использование аспорогенного авирулентного штамма B. anthracis 55ΔТПА-1Spo^- для получения протективного антигена и белка ЕА1 сибиреязвенного микроба обеспечивает биологическую безопасность работ и исключает риск контаминации помещений и оборудования спорами возбудителя сибирской язвы.

Высокий уровень продукции протективного антигена сибиреязвенного микроба обеспечивается функционированием клонированного гена pag в составе мультикопийной гибридной плазмиды. Штамм В. anthracis 55ΔТПА-1Spo^- синтезирует в 10-20 раз больше протективного антигена, чем вакцинный штамм В. anthracis СТИ-1, ввиду отсутствия у него негативного регулятора синтеза протективного антигена pagR и увеличения числа копий кодирующего гена pag за счет мультикопийности векторной плазмиды. Для эффективности процедуры выделения и очистки протективного антигена и белка ЕА1 крайне важно, что штамм В. anthracis 55ΔТПА-1Spo^- характеризуется резко сниженной активностью протеолитических ферментов. Предлагаемый продуцент сибиреязвенных антигенов хорошо растет как на традиционных отечественных средах, например, бульоне Хоттингера, так и на стандартизованных полусинтетических средах с высоким содержанием триптона. Добавление в бульон Хоттингера триптона в концентрации до 20 мг/мл увеличивает продукцию протективного антигена в 1,5-2 раза. Установленная экспериментально заявителем продолжительность выращивания 16 часов приводит к увеличению примерно в 5 раз выхода протективного антигена. Существенным моментом для создания вакцинных препаратов является то, что культивирование генно-инженерного штамма В. anthracis 55ΔТПА-1Spo^- в течение 16 часов можно проводить без добавления селективного антибиотика. Установлено, что в течение этого периода не происходит элиминации гибридной плазмиды. Кроме того, отсутствие в штамме В. anthracis 55ΔТПА-1Spo^- плазмидной области позитивной регуляции AtxA позволяет получать максимальное количество протективного антигена без дополнительных материальных затрат и усилий на создание повышенной концентрации углекислого газа в атмосфере. Следовательно, использование штамма В. anthracis 55ΔТПА-1Spo^- для получения протективного антигена и белка ЕА1 сибиреязвенного микроба существенно повышает рентабельность технологического процесса производства химических сибиреязвенных вакцин.

Концентрирование и диафильтрация препаратов протективного антигена и белка ЕА1 с использованием мембранных фильтров с пределом исключения белков с молекулярной массой 30 кДа, а также двухступенчатые процедуры хроматографической очистки на различных носителях обеспечивают получение высокоочищенных антигенов, эффективно взаимодействующих со структурами врожденного и адаптивного иммунитета, не реактогенных и не токсичных для макроорганизма.

Возможность осуществления изобретения подтверждена примером 1.

Пример 1. Выделение и очистка протективного антигена и белка S-слоя сибиреязвенного микроба из штамма B. anthracis 55ΔТПА-1Spo^-

Пилотный ферментер с рабочим объемом 14 литров заполняют 5 литрами бульона Хоттингера (рН 7,2-7,4), среду стерилизуют. После стерилизации дополнительно вносят стерильный раствор триптона до конечной концентрации не менее 20 мг/мл.

Подготовку культуры штамма-продуцента для получения достаточного количества биомассы на определенной стадии роста производят следующим образом. По одной полной петле 18-часовой агаровой культуры штамма-продуцента засевают в пробирки со скошенным агаром Хоттингера, содержащим канамицин в концентрации 25 мкг/мл, и инкубируют при температуре 37°С в течение 6 часов. После периода инкубации биомассу смывают, добавляя по 1 мл охлажденного 0,85% раствора хлорида натрия (рН 7,2), ресус-пендируют и переносят во флаконы со скошенным агаром Хоттингера, содержащим селективный антибиотик в той же концентрации. Посевы инкубируют при температуре 37°С в течение 18 часов. Микробную массу с поверхности агара смывают, добавляя в каждый флакон по 3 мл охлажденного 0,85% раствора хлорида натрия (рН 7,2).

Для масштабируемого культивирования 50 мл клеточной взвеси штамма-продуцента В. anthracis 55ΔТПА-1Spo^- с концентрацией микробных клеток не менее 50 млрд м.к./мл вносят в готовую стерильную среду. Культивирование осуществляют при температуре 37±0,1°С в течение 16 часов с постоянным перемешиванием при 150 об/мин. Через 16 часов уровень продукции протективного антигена по данным иммуноферментного анализа составляет 640 мкг/мл, что в 20 раз больше значений, определяемых для вакцинного штамма В. anthracis СТИ-1 (фиг.1).

После окончания периода выращивания добавляют 2 мМ ЭДТА. Отделение клеточной массы и стерилизацию осуществляют при комнатной температуре и оперативном давлении около 2 бар на установке для концентрирования и очистки белков (Sartorius, Германия), используя модуль тангенциальной фильтрации Vivaflow 200 (Sartorius, Германия), содержащий мембранный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. После высева по 0,1 мл культурального фильтрата на чашки с агаром Хоттингера и инкубации при температуре 37°С в течение 10 суток не отмечают характерной для сибиреязвенного микроба морфологии колоний.

Для выделения протективного антигена после стерилизации культуральный фильтрат разводят в объемном соотношении 1:1 буфером, содержащим 25 мМ диэтаноламина, 50 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА (рН 8,9). Затем концентрируют приблизительно в 20 раз на установке для концентрирования и очистки белков путем фильтрации в тангенциальном потоке Vivaflow (оперативное давление около 2,5 бар), используя модуль Vivaflow 200 (Sartorius, Германия) с пределом исключения белков с молекулярной массой 30 кДа. Следующим этапом проводят диафильтрацию 10-кратным объемом того же буфера на том же модуле при комнатной температуре. Сконцентрированный и диафильтрованный препарат, содержащий протективный антиген, очищают на хроматографической колонке с Macro Prep 50Q (Bio-Rad, США). Носитель предварительно дегазируют и промывают таким же объемом буфера, содержащего 1М NaCl. Затем колонку уравновешивают, пропуская последовательно 10 объемов буфера, содержащего 25 мМ диэтаноламина, 50 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА (рН 8,9) и 1 объем того же буфера с добавлением 30 мМ KCl (рН 8,9). Белки культурального фильтрата элюируют при скорости протока 10 мл/мин, используя один свободный объем колонки, после чего колонку промывают последним буфером в объеме, соответствующем объему носителя. Полученную пробу объединяют с элюатом. Препарат протективного антигена концентрируют в 10 раз на модуле Vivaflow 200 (30 кДа) при оперативном давлении около 2 бар и комнатной температуре. Диафильтрацию осуществляют на том же модуле с последовательным использованием 10-кратного объема буфера, содержащего 25 мМ диэтаноламина, 50 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА (рН 8,9) и 10-кратного объема буфера, содержащего 145 мМ ацетата аммония, 2 мМ ЭДТА (рН 10,0). Перед окончательным этапом очистки препарат протективного антигена фильтруют через мембранные фильтры с диаметром пор 0,2 мкм (Sartorius, Германия), разливают по аликвотам и сохраняют при температуре минус 70°С. Дальнейшую очистку проводят на хроматографической системе BioLogic Duo Flow^™ (BioRad, США). В качестве носителя для гель-фильтрации используют Sephacryl-HR300 (BioRad, США). Соответствующую колонку заполняют носителем и уравновешивают 3 объемами буферного раствора, содержащего 0,1 М трисОН, 1 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl (рН 8,0). Охлажденный до 4°С препарат протективного антигена (с концентрацией белка до 2,5 мг/мл) наносят на колонку порционно в объеме не более 3% от объема геля. Хроматографическую систему программируют на скорость протока 2 мл/мин. Выход белков контролируют спектрофотометрией при длине волны 280 нм. Пробы, соответствующие максимальному пику поглощения, отбирают и после нескольких подобных циклов очистки объединяют. Учитывая происходящее в процессе гель-фильтрации разбавление препарата, объединенные пробы концентрируют в 10 раз с помощью концентраторов "Vivaspin-20" (Sartorius, Германия). Степень очистки протективного антигена, определенная с помощью электрофореза в 10% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, составила 90%. Результаты очистки протективного антигена представлены на фиг.2, где: 1 - культуральный фильтрат В. anthracis 55ΔТПА-1Spo^-; 2 - препарат после концентрирования на модуле Vivaflow 200 (30 кДа); 3 - препарат после очистки на колонке с Macro Prep 50Q; 4 - препарат после диафильтрации; 5 - препарат после вторичного концентрирования на модуле Vivaflow 200 (30 кДа); 6 - маркеры молекулярных масс (260, 135, 95, 72, 52, 42, 34, 26, 17, 10 кДа); 7 - конечный препарат протективного антигена после хроматографии на колонке с Sephacryl-HR300. Препарат протективного антигена разливают по аликвотам и сохраняют при температуре минус 70°С, а после лиофилизации - при температуре 8°С.

Для выделения ЕА1 осажденную центрифугированием клеточную массу отмывают от остатков среды 0,9% раствором хлорида натрия. 500 мл биомассы смешивают с 50 мл экстрагирующего буфера, содержащего 5 мМ трис-HCl, 1% додецилсульфата натрия, 5 мМ 2-меркаптоэтанола. Смесь прогревают на водяной бане при температуре 70°С в течение 30 минут, затем остужают до комнатной температуры и центрифугируют в течение 30 минут при 10000 об/мин и температуре 4°С. Клеточный экстракт стерилизуют, пропуская через модуль тангенциальной фильтрации Vivaflow 200 (0,2 мкм) при оперативном давлении около 2 бар. На следующем этапе клеточный экстракт диафильтруют 10 объемами буфера, содержащего 0,1 М трис-HCl, 2 мМ ЭДТА (рН 8,0), при комнатной температуре с использованием модуля Vivaflow 200 (30 кДа) под давлением около 2 бар. До этапа очистки препарат, содержащий ЕА1, сохраняют при температуре минус 70°С. Очистку осуществляют на хроматографической системе BioLogic Duo Flow^™ (Bio-Rad, США). Колонку заполняют предварительно декантированным гидроксиапатитом и уравновешивают 10 свободными объемами буфера, содержащего 5 мМ K₂HPO₄·KH₂PO₄ (рН 6,8), при скорости протока 10 мл/мин до получения стабильной базовой линии. Препарат, содержащий ЕА1, наносят на колонку и создают линейный градиент фосфата калия (от 0 до 1 М K₂HPO₄·KH₂PO₄), используя 3 свободных объема колонки. Фракции, соответствующие пикам поглощения при 280 нм, собирают и объединяют.Затем проводят второй этап очистки на том же носителе, создавая градиент фосфата калия, как описано выше. Очищенный белок ЕА1 диафильтруют 10 объемами бидистиллированной воды при температуре 4°С с использованием модуля Vivaflow 200 (30 кДа) под давлением около 2 бар. Степень очистки белка ЕА1, определенная с помощью электрофореза в 10% полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, составила 95%. Результаты очистки белка ЕА1 представлены на фиг.3, где 8 - клеточный экстракт после инкубации в буфере с 1% додецилсульфатом натрия; 9, 10 - препарат после первого этапа очистки на гидроксиапатите; 11 - конечный препарат белка ЕА1 после второго этапа очистки на гидроксиапатите; 12 - маркеры молекулярных масс (116,0; 97,0; 66,0; 45,0; 29,0 кДа). При необходимости препарат белка ЕА1 концентрируют, разливают по аликвотам и сохраняют при температуре минус 70°С, а после лиофилизации - при температуре 8°С.

Полученные таким образом препараты протективного антигена и белка ЕА1 пригодны для использования в качестве основного и дополнительного компонентов сибиреязвенной химической вакцины, что подтверждено следующими примерами.

Пример 2. Определение способности препаратов на основе протективного антигена и белка ЕА1 защищать лабораторных животных при заражении тест-штаммом возбудителя сибирской язвы

Лабораторных животных иммунизируют протективным антигеном и белком ЕА1, полученными описанным выше способом (пример 1). Отдельным группам мышей линии BALB/c (по 20 особей в группе) двукратно вводят протективный антиген в дозе 10 мкг или комплексный препарат, содержащий протективный антиген в той же дозе и белок ЕА1 в дозе 5 мкг. Иммунобиологическую перестройку оценивают по показателям ЛД₅₀ тест-штамма В. anthracis 71/12 и индексам иммунитета. В результате значения ЛД₅₀ заражающего штамма для неиммунизированных особей составляет 5×10² (100÷2512) спор; для иммунизированных протективным антигеном - 7,9×10⁴ (15849÷501187) спор; для имменизированных комплексным препаратом - 1,9×10⁵ (39811÷1000000) спор. Соответственно индексы иммунитета следующие: 158,5 - для протективного антигена, 398,2 - для протективного антигена с ЕА1. Таким образом, добавление ЕА1 в иммунизирующий препарат на основе протективного антигена повышает устойчивость линейных мышей к заражению тест-штаммом возбудителя сибирской язвы в 2,5 раза.

Равновеликим группам морских свинок двукратно вводят протективный антиген в сочетании с полным адъювантом Фрейнда или протективный антиген в сочетании с белком ЕА1 и адъювантом. Иммунизирующая доза протективного антигена для морских свинок составляет 25 мкг/мл, белка ЕА1 - 10 мкг. Иммунизацию вакцинным штаммом В. anthracis СТИ-1 (препарат сравнения) осуществляют однократно подкожно в дозе 5×10⁷ спор. В результате, ЛД₅₀ тест-заражающего штамма В. anthracis 71/12 для контрольных животных составляет 3,1×10² спор; для морских свинок, иммунизированных протективным антигеном, протективным антигеном с ЕА1 и вакцинным штаммом В. anthracis СТИ-1 1,9·10⁷ спор. Соответственно индекс иммунитета во всех случаях - 100072,0. То есть двукратная иммунизация биомоделей протективным антигеном или протективным антигеном с ЕА1 обеспечивает защиту от заражения тест-штаммом В. anthracis 71/12, сопоставимую с протективностью живой сибиреязвенной вакцины В. anthracis СТИ-1. Таким образом, предложенный способ позволяет получать антигенные препараты, эффективно защищающие от заражения возбудителем сибирской язвы.

Пример 3. Определение способности очищенных препаратов протективного антигена и белка ЕА1 взаимодействовать со структурами врожденного иммунитета - толл-подобными рецепторами

Мышей линии BALB/c иммунизируют однократно подкожно протективным антигеном (10 мкг) или белком ЕА1 (10 мкг), полученными описанным выше способом (пример 1). Животных умерщвляют через 4 часа, на 1, 3, 7 и 14 сутки после иммунизации и забирают материал из органов центрального и периферического иммуногенеза (тимус и селезенка). Выделение РНК из клеток селезенки и тимуса осуществляют с помощью комплекта реагентов «РИБО-сорб» (ИнтерЛабСервис, Россия) согласно инструкции фирмы-производителя. Обратную транскрипцию проводят с использованием комплекта «Реверта» (ИнтерЛабСервис, Россия) в соответствии с инструкцией производителя. С полученной кДНК проводят ПЦР со специфическими праймерами к толл-подобным рецепторам (TLRs) 2 и 6 типа. Положительным контролем служит амплифицированный фрагмент гена «домашнего хозяйства» β-актина. Амплификацию фрагментов генов проводят на программируемом амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Россия) по схеме: один цикл при температуре 95°С в течение 5 мин, 30 циклов при температуре 95°С - 1 мин, температуре 60°С - 1 мин, температуре 72°С - 1 мин и завершающий цикл 5 мин при температуре 72°С. Электрофоретический анализ ПЦР-продуктов осуществляли в горизонтальной камере (Bio-Rad, США) в 2% агарозном геле. Для определения размера ампликонов использовали коммерческие маркеры молекулярных масс «О' GeneRuler 100 bp DNA Ladder Plus ready-to-use (Fermentas, Литва). Визуализацию полос ДНК осуществляют с помощью источника ультрафиолетового света и регистрируют с помощью системы гель-документирования (Bio-Rad, США). В результате, во всех пробах, взятых начиная от 4 часов и до 14 суток, у иммунизированных животных в отличие от контрольных отмечают достоверное увеличение экспрессии TLRs 2 и 6 типа на клетках селезенки и тимуса.

Пример 4. Определение токсичности очищенных препаратов протективного антигена и белка ЕА1 в экспериментах in vivo и in vitro

Морским свинкам (по 10 особей в группе) однократно подкожно вводят протективный антиген или белок ЕА1 в дозах 25, 50 и 100 мкг. В течение первых двух недель с периодичностью 1 раз в два дня проводят взвешивание и осмотр животных. В результате в течение 21 суток наблюдения у морских свинок визуальных и пальпаторных изменений на месте введения не отмечается, масса тела животных не снижается.

Для оценки повреждающего действия in vitro протективный антиген и белок ЕА1 в дозах 10 мкг инкубируют с 3 мл цельной дефибринированной крови здоровых доноров при 37°С в течение 24 часов. Окраску проб лейкоцитов проводят смесью митрамицина (125 мкг/мл) и бромида этидия (25 мкг/мл). Цитотоксическое действие антигенных препаратов контролируют по количеству клеток в состоянии апоптоза с применением метода проточной цитофлуориметрии. В результате очищенный рекомбинантный ПА сибиреязвенного микроба не повышает апоптотическую активность и не оказывает повреждающего действия на лейкоциты крови человека.

Для исследования пролиферативной активности лимфоцитов органов центрального и периферического иммуногенеза мышей линии BALB/c (по 6 особей в группе) иммунизируют подкожно протективным антигеном или белком ЕА1 в дозах 10 мкг. Контролем служат интактные животные. Пробы тимуса и селезенки забирают через 4 часа, на 1, 3, 7 и 14 сутки после иммунизации. Процентное соотношение тимоцитов и спленоцитов в фазах клеточного деления регистрируют с помощью проточного цитофлуориметра. Апоптоз оценивают по накоплению гиподиплоидных клеток в пике, располагающемся левее пика, соответствующего диплоидным клеткам. Активацию иммунокомпетентных клеток отражает их число в стадии пролиферации. Определяют также соотношение клеток, находящихся в стадии апоптоза и пролиферации. Значение данного индекса должно быть меньше единицы

В результате во все сроки исследования апоптотическая и пролиферативная активность клеток тимуса существенно не отличается от аналогичных показателей в группе контроля. Баланс апоптоза и пролиферации не превышает 1,0, что свидетельствует об отсутствии повреждающего действия исследуемого препарата на иммунокомпетентные клетки. В пробах селезенки, взятых через 4 часа, на 1 и 3 сутки, число пролиферирующих спленоцитов соответствовало контрольным значениям. На 7 и 14 сутки регистрировали повышение пролиферативной активности клеток селезенки, что может быть обусловлено пролиферацией В-клеток и антителопродукцией. Введение мышам протективного антигена и белка ЕА1 не влияет на апоптотическую активность спленоцитов. Индекс соотношения клеток селезенки в стадии апоптоза и пролиферации не превышает 1,0.

Таким образом, полученные с применением вышеописанного способа препараты протективного антигена и белка ЕА1 не оказывают повреждающего действия на иммунокомпетентные клетки органов центральной и периферической иммунной системы макроорганизма.

Пример 5. Патоморфологическое и гистологическое исследование органов лабораторных животных, иммунизированных протективным антигеном и белком ЕА1

Морских свинок однократно вводят препарат протективного антигена в дозе 50 мкг в сочетании с белком ЕА1 в дозе 20 мкг. Забор органов для гистологического исследования осуществляют на 1, 3, 7, 21, 28 сутки после иммунизации.

Подкожное введение сибиреязвенных антигенов морским свинкам не вызывает гибели животных и не влияет на их общее состояние. В месте введения после иммунизации отмечают минимальные изменения в виде очагового умеренного отека подкожно-жировой клетчатки и незначительной лимфоцитарной инфильтрации дермы, полностью исчезающие после 3 суток. Изменения в надпочечниках, наблюдаемые в течение первых 7 суток, свидетельствуют о легкой стресс-реакции. Со стороны паренхиматозных органов при макроскопическом исследовании за весь период наблюдения не отмечают грубых дистрофических изменений, инфильтративных процессов, резкого нарушения кровенаполнения сосудов. В период с 1 по 7 сутки при гистологическом исследовании регистрируют признаки умеренного функционального напряжения клеток паренхимы печени, почек, кардиомиоцитов на фоне очаговых явления полнокровия сосудов. Изменения со стороны гломерулярного аппарата почек характеризуются умеренным полнокровием капиллярных петель сосудистых клубочков почечных телец. Количество почечных телец с изменениями не достигает 50%. В печени у морских свинок в ранние сроки (1-3 сутки) наблюдают умеренный застой в системе циркуляции (внутридольковые синусоидальные гемокапилляры) и системе оттока (центральные вены) крови, сочетающийся с функциональным напряжением светлых гепатоцитов центра печеночных долек. Однако к 7 суткам функциональное состояние органа достоверно не отличается от наблюдаемого у животных из группы контроля.

В лимфоидных органах регистрируют нарастание активности с 3 по 21 сутки, с достижением максимума на 27 сутки, что свидетельствует об активизации иммунной системы. Со стороны центрального органа иммунной системы - тимуса увеличение массы органа в 2 раза по отношению к массе органа у контрольных животных отмечают на 21 сутки наблюдения. В селезенке регистрируют увеличение массы органа в 2 раза по отношению к аналогичному показателю у интактных животных и умеренную гиперплазию фолликулярных структур (появление зернистости) на 21 сутки наблюдения. Выраженная гиперплазия регионарных лимфатических узлов отмечают с 21 суток. Масса отдаленных лимфатических узлов достигает максимальных значений на 21 сутки, в этот период она в 30 раз превышает значение контрольного показателя. Однако уже к 27 суткам размеры и масса лимфатических узлов возвращается к контрольным значениям. При гистологическом исследовании в тимусе при нормальном соотношении коркового и мозгового вещества умеренные гиперпластические процессы со стороны лимфоидных элементов и относительная активация митотической активности в мозговом веществе начинаются после 7-х суток, постепенно убывая к 27-м суткам. Функциональное состояние органов периферической иммунной системы укладывается в картину иммуногенеза, что проявлялось последовательной активацией Т- и В-зон в них. Таким образом, изменения, выявленные при гистологическом исследовании внутренних органов морских свинок, иммунизированных протективным антиген в сочетании с белком ЕА1, являются допустимыми и обратимыми. Со стороны иммунокомпетентных органов регистрируют проявления иммуногенеза.

Таким образом, заявляемый способ позволяет эффективно и без риска контаминации помещений и оборудования спорами возбудителя сибирской язвы получать препаративные количества высокоиммунногенных и нетоксичных препаратов протективного антигена и белка ЕА1, необходимых для создания средств специфической профилактики сибирской язвы.

Литература

1. Chitlaru Т., Altboum Z., Reuveny S., Shafferman A. Progress and novel strategies in vaccine development and treatment of anthrax // Immunol. Rev. - 2011. - V.239. - №1. - P.221-236.

2. Gat O., Grosfeld H., Ariel N. Search for Bacillus anthracis potential vaccine candidates by a functional genomic-serologic screen // Infect. Immun. - 2006. - V.74. - №7. - P.3987-4001.

3. Садовой Н.В., Кравец И.Д., Селиваненко Г.М., Харечко Г.С., Садовая Е.А., Васильев П.Г., Литусов Н.В., Елагин Г.Д., Супотницкий М.В. Вакцина сибиреязвенная комбинированная // Патент РФ №2115433 (A61K 39/07, A61K 39/40). - опубликовано 20.07.1998.

4. Wright C.G., Angelety L.H. Effect of the Method of Agitation on the Accumulation of Protective Antigen in Cultures of Bacillus anthracis // Appl. Microbiol. - 1971. - Vol.22. N1. - P.135-136.

5. Anthrax Vaccine Adsorbed. Package insert. Lansing, MI: BioPort Corporation 1999; US License No.1260.

6. Кожухов В.В., Пименов Е.В., Сероглазов В.В., Юдников В.А., Меновщиков В.А. Способ получения сухой комбинированной сибиреязвенной вакцины // Патент РФ №2181294 (A61K 39/07, C12N 1/04). - 11.08.1999 (опубл. 20.04.2002).

7. Bourgogne A., Drisdale M., Hilsenbeck S., Peterson S., Koehler T. Global effect of virulence gene regulators in a Bacillus anthracis strain with both virulence plasmid // Infect. Immun. - 2003. - V.71. - №.5. - P.2736-2743.

8. Mignot Т., Mock M., Fouet A. A plasmid-encoded regulator couples the synthesis of toxins and surface structures in Bacillus anthracis // Mol. Microbiol. - 2003. - V.47. - №4. - P.917-927.

9. Орлов Ю.Н., Садовой Н.В., Махортова Е.Б., Федорова Н.В., Мельников С.В., Кузьмич М.К., Дербин М.И. Способ получения сибиреязвенного нативного протективного антигена // Патент РФ №2223114 (A61K 39/02; C12N 1/20). - 04.07.2000 (опубликовано 10.02.2004).

10. Шевцов А.Н., Лобастов B.C., Боровской Д.В., Меновщиков В.А., Хапаев Н.Г. Способ получения сибиреязвенного протективного антигена // Патент РФ №2340356 (A61K 39/07) - опубл. 10.12.2008.

11. Cohen S., Mendelson I., Altboum Z., Kobiler D., Elhanany E., Bino Т., Leitner M., Inbar I., Rosenberg H., Gozes Y., Barak R., Fisher M., Kronman C., Velan В., Shafferman A.

Attenuated nontoxinogenic and nonencapsulated recombinant Bacillus anthracis spore vaccines protect against anthrax // Infect. Immun. - 2000. - Vol.68. - №8. - P.4549-4558.

12. Baillie L. Vaccine production of the Bacillus anthracis protective antigen // United States Patent №US6267966 (C12N 15/31; A61K 39/07; C12R 1/125) - 2001.

13. Бхатнагар Р., Батра С., Чаухан В., Сингх А., Ахуджа Н., Кумар П., Гупта П. Способ получения нетоксичной противосибиреязвенной вакцины // Патент РФ №2287581 (C12N 15/31, C07K 2/00, C12P 21/00, A61K 39/07) - опубл. 20.11.2006.

14. Brehm J., Mcentee I., Vincent P., Allison N., Brehm R., Jack G., Herbert M., Solow В., Arpoyo J., Lapcevich R. Preparation of protective antigen from Bacillus anthracis // KR 20070114263 (A) (A61K 39/07; C07K 14/32) - опубл. 30.11.2007.

15. Chauhan V., Singh A., Waheed S.M., Singh S., Bhatnagar R. Constitutive expression of protective antigen gene of Bacillus anthracis in Escherichia coli // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2001. - Vol.283. - N 2. - P.308-315.

16. Ivins В., Worsham P., Friedlander A., Farchaus J., Welkos S. Method of making a vaccine // United States Patent №US2002034512 (C12N 15/75; C12N 15/74). - 21.03.2002.

17. Farchaus J., Ribot W., Jendrek S., Little S. Fermentation, purification, and characterization of protective antigen from a recombinant, avirulent strain of Bacillus anthracis // Applied and Environmental Microbiol. - 1998. - Vol.64. - №3. - P.982-991.

18. Ezzell J., Abshire T. Immunological analysis of cell-associated antigens of Bacillus anthracis // Infect. Immun. - 1988. - V.56. - №2. - P.349-356.

19. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Шулепов Д.В. Аспорогенный рекомбинантный штамм В. anthracis 55ΔТПА-1 Spo- (pUB110PA-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба // Патент РФ №2321629 (C12N 1/21, C12P 21/00, C12R 1/07). - 10.04.2008.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается технологии получения иммуногенных сибиреязвенных антигенов - протективного антигена и белка ЕА1. Способ предусматривает выращивание предварительно подготовленной культуры рекомбинантного штамма В. anthracis 55ΔТПА-1Spo^-. Клеточную массу отделяют с применением фильтрационного модуля с мембраной, имеющей диаметр пор 0,2 мкм. Белок ЕА1 экстрагируют из отмытой клеточной массы при помощи буфера с 1% додецилсульфатом натрия и очищают диафильтрацией с использованием мембранных фильтров и двухступенчатой ионообменной хроматографией на гидроксиапатите. Протективный антиген выделяют из культурального фильтрата и очищают при помощи последовательных этапов концентрирования и диафильтрации. Использование изобретения позволяет получить в одной технологической цепочке высокоочищенные антигены сибиреязвенного микроба - протективного антигена и белка ЕА1, необходимых для создания химических вакцин. 3 ил., 5 пр.

Способ получения протективного антигена и белка ЕА1 из штамма В. anthracis, включающий подготовку посевной культуры штамма-продуцента; культивирование аспорогенного рекомбинантного штамма В. anthracis 55ΔТПА-1Spo^- при температуре 37±0,1°C в течение 16 ч в жидкой питательной среде, содержащей триптон с концентрацией не менее 20 мг/мл, с постоянным перемешиванием при 150 об/мин; отделение клеточной массы с применением фильтрационного модуля с мембраной, имеющей диаметр пор 0,2 мкм; выделение белка ЕА1 из отмытой клеточной массы и его очистку при помощи последовательных этапов инкубации с содержащим 1% додецилсульфат натрия экстрагирующим буфером, диафильтрации с использованием мембранных фильтров с пределом исключения белков с молекулярной массой 30 кДа и двухступенчатой ионообменной хроматографией на гидроксиапатите, а также выделение протективного антигена из культурального фильтрата и его очистку при помощи последовательных этапов концентрирования и диафильтрации с использованием мембранных фильтров с пределом исключения белков с молекулярной массой 30 кДа и двухступенчатой хроматографии на ионообменном носителе и носителе для гель-фильтрации.