СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СИБИРЕЯЗВЕННОГО НАТИВНОГО ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА Российский патент 2004 года по МПК A61K39/02 C12N1/20 

Изобретение относится к лекарственным препаратам, содержащим антигены, в частности к производству сибиреязвенных вакцин, и может быть использовано в медицине и ветеринарии.

Уровень техники
Известны способы получения сибиреязвенного нативного протективного антигена (НПА) при глубинном аэробном и анаэробном культивировании В. anthracia /1-4/. Наиболее распространенным способом получения НПА является глубинное анаэробное культивирование некапсулирующих, непротеолитических и авирулентных штаммов. В. anthracis на питательной среде (ПС) с бикарбонатом натрия в атмосфере азота.

Недостатком этого способа являются значительные различия в выходе НПА в аппаратах с различным способом перемешивания жидкости (шуттель-аппараты, аппараты с перемешиванием мешалкой) и в различных по вместимости аппаратах /2-3/.

Прототипом изобретения может служить способ получения НПА /2/ при глубинном анаэробном культивировании штамма В. anthracis на ПС с бикарбонатом натрия в аппарате, снабженном мешалкой в атмосфере азота, который через стерилизующий фильтр подается в ферментер, пока давление не будет равным 0,35 кг/см². Газ поступает непосредственно к поверхности среды в течение 25 мин. Воздух из полости ферментера удаляется через верхний клапан, после чего клапан закрывается до конца процесса культивирования. Длительность процесса культивирования составляет около 26 ч.

Недостатком этого способа является относительно низкий выход НПА.

Сущность изобретения
Заявляемое изобретение направлено на повышение производительности стадии культивирования за счет увеличения выхода сибиреязвенного НПА в процессе глубинного анаэробного культивирования В. anthracis и сокращения длительности этого процесса.

Поставленная цель достигается тем, что предложен способ получения сибиреязвенного НПА, отличающийся тем, что в процессе анаэробного культивирования В. anthracis на ПС, содержащей бикарбонат натрия, культуральную жидкость в ферментере в течение всего процесса культивирования непрерывно аэрируют (продувают, вентилируют) воздухом или любым инертным газом (аргоном, гелием, азотом и т.п.). При атом аэрацию культуральной жидкости осуществляют с удельным расходом газа 0,05-0,040 л/(л•мин).

Указанный способ позволяет в 2-4 раза повысить выход НПА и сократить продолжительность процесса его накоплений до 15-20 ч.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1. Получение сибиреязвенного НПА в ферментерах 0,5 м³ с перемешиванием мешалкой и поверхностной аэрацией КЖ различными газами.

В качестве исходной культуры для получения НПА используют эталонный вакцинный, некапсулирующий, непротеолитический сибиреязвенный штамм СТИ-1. Стерильная питательная среда на основе 3%-ного соляно-кислотного гидролизата рыбной муки, кукурузного экстракта с добавлением бикарбоната натрия и других солей вводится в ферментер вместимостью 0,5 м³ (один из вариантов), и в нее добавляется посевной материал в количестве (3-5)•10⁵ спор на 1 мл. Включается мешалка и на поверхность культуральной жидкости (КЖ) в течение всего процесса культивирования подается через стерилизующий фильтр воздух или азот с удельным расходом 0,2 л/(л•мин). Показатели процесса культивирования и накопления НПА в аппарате 0,5 м³ при поверхностной аэрации КЖ воздухом и азотом приведены в табл. 1.

Пример 2. Получение сибиреязвенного НПА в ферментерах 0,5 м³ при барботажном способе перемешивания КЖ воздухом.

Условия проведения культивирования те же, что и в примере 1. Отличие заключается в том, что в ферментере перемешивание мешалкой и поверхностная аэрация заменены на барботажное перемешивание (аэрацию) КЖ воздухом. Показатели процесса культивирования и накопления НПА в аппарате 0,5 м³ при барботажном способе перемешивания КЖ приведены в табл. 2.

Как видно из данных, приведенных в табл. 1 и 2, предложенный способ получения НПА позволяет значительно повысить выход сибиреязвенного антигена (до 1:8) и сократить сроки его накопления на стадии культивирования примерно до l5-20 ч. При этом необходимо отметить, процесс развития культуры СТИ-1 и накопления НПА в ферментере 0,5 м³ при барботажном способе перемешивания КЖ воздухом был несколько продолжительнее и наблюдался более высокий выход биомассы (см. табл. 2), чем в ферментере с перемешиванием мешалкой и поверхностной аэрацией КЖ (см. табл. 1). Это было связано с тем, что в примере 2 в ПС для ферментера 0,5 м³ вносилось несколько больше глюкозы, чем ПС в примере 1.

Полученный при культивировании вакцинного штамма СТИ-1 в ферментерах вместимостью 0,5 м³ НПА концентрировался, и из него готовилась адсорбированная химическая сибиреязвенная вакцина.

Все серии полученной вакцины удовлетворяли требованиям ГИСК им. Л.А.Тарасевича /5/ по содержанию общего азота и сорбента Аl₂О₃ на одну человекодозу ((35±5) мышиных ИД₅₀), которое составляло в среднем 0,15 и 1,6 мг соответственно.

По физико-химическим свойствам - молекулярному весу, устойчивости к прогреву и к действию протеолитических ферментов, по антигенному составу - полученные препараты не отличались.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ
1. Puziss M,. Howard M.B- Studies on Immunity in Anthrax. XI. Control of Сellular Permeability by Bicarbonate Ion in Relation to Protective Antigen Elaboration // J. Bacteriol. - 1963, - Vol. 85, N 1 - P.237-243.

2. Puziss M., Manning L.C., Lynch J.W. et al. Larse-Scale Production of Protective Antigen of Bacillus anthracis in Anaerobic Cultures // Appl. Microbiol. -1963. - Vol. 11, N4, - P.330-334.

3. Wright C.G., Angelety L.H. Effect of the Method of Agitation on the Accumulation of Protective Antigen in Cultures of Bacillus anthracis // Appl. Microbiol. - 1971. - Vol. 22. N1. - P.135-136.

4. Александров Н.И., Гефен H.Е., Езепчук Ю.В. и др. Изучение оптимальных условий образования сибиреязвенного внеклеточного защитного антигена молочной среде //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1962. - 4 - С.9-13.

5. ВФС 42-198ВС-92. Вакцина сибиреязвенная очищенная адсорбированная химическая жидкая, 1992.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии. Глубинное анаэробное культивирование штамма В. anthracis на питательной среде, содержащей бикарбонат натрия, осуществляют в ферментере, непрерывно аэрируя культуральную жидкость газом или смесью нескольких газов (аргоном, гелием, азотом и т.п.). При этом нативный протективный антиген можно получать в ферментерах с перемешиванием мешалкой и поверхностной аэрацией культуральной жидкости (КЖ) различными газами или только при барботажном способе перемешивания КЖ. При этом расход газа составляет 0,05-0,40 л/мин на один литр КЖ. Способ позволяет в 2-4 раза повысить выход сибиреязвенного антигена и сократить сроки его накопления на стадии культивирования до 15-20 ч. 2 табл.

Способ получения сибиреязвенного нативного протективного антигена при глубинном анаэробном культивировании В. anthracis в ферментере на питательной среде, содержащей бикарбонат натрия, отличающийся тем, что в ферментер в течение всего процесса культивирования на поверхность при постоянном механическом перемешивании мешалкой или под поверхность культуральной жидкости без перемешивания мешалкой непрерывно подают газ или смесь нескольких газов с расходом 0,05-0,40 л/мин на один литр культуральной жидкости для обеспечения в ферментере оптимального уровня массообмена диоксида углерода на границе раздела фаз газ-жидкость.