Способ получения сибиреязвенных протективных антигенов Советский патент 1991 года по МПК A61K39/02 

ИчоРретение относится к медицинской микробиологии, в частности к вакцинно-сывороточному производству и может быть использовано дня получения сибиреязвенной токсоидной вакцины и видоспетдифической сибиреязв-ен- ной антисыворотки.

Цель изобретения - увеличение выхода антигенов за счет использования в качестве адсорбента при их очистке порошка из пористого стекла.

Вместо набора фильтров из обычного стеклянного порошка или стеклянных баллотини в качестве фильтра используют колонку из пористого стекла с контролируемым размером пор (700- 2000 л), которое позволяет в условиях колоночной хроматографии одновременно и стерилизовать токсический культурйльный фильтрат, и адсорбировать из него не только антигены EF - I LF - III, но и 88% РЛ - II. Большая скорость протекания токсина через пористое стекло (выдерживающее

раствор объединяют с фракцией токсина, прошедшей через колонку (Ф).

Антиге 1Ы, сорбированные на колонке, элюиругот охлажденным до А С)

5 0,3 М карбонатным буфером рН 9,6. Элгоат собирают с помощью коллектора фракций по 20 мл. Выход антигенов тестируют по оптической плотности при 280 HfJ ГОП 280),

О После того, как оптическая плотность элюата снизится до 0,05Q, колонку начинают отмывать дистиллированной водой и вновь собирают злюиро- ванные антигены.

5 Собранные фракции антигенов концентрируют методом ультрафильтрацйи на мембране РИПОР - 4, а затем диали- зуют против 0,02 М аммонийацетатного буфера рН 7,0.

20 Полное фракционирование завершается в течение 2,5-6 ч в зависимости от установленной скорости фильтрации.

Для восстановления колонки для последующего фракционирования ее промывысокое давление) и большая сорбцион- вают 0,6 л горячей азотной кислоты,

ная его емкость делает процесс получения высокопроизводительным и простым. Кроме того, использование для элюции помимо солевых растворов дистиллированной воды позволяет на 20% увеличить выход адсорбированных на стекле протективных антигенов.

I

Пористое стекло с контролируемым

а затем дистиллированной водой.

Оценка биологической активности- токсина и его фракций.

Протективную активность оценивают 30 на морских свинках. Животным вводят подкожно по 10 мкг (по белку) препарата в смеси с полным &дъювантом Фрейн- да. Заражают через 20 дней после иммунизации спор сибиреязвенного

количеством пор, контролируемого разО

мера (от 700 до 2000 А). Выпускаемые

размером пор (СКП) представляет собой 35 штамма 71/12. Гибель животных учиты- тонко измельченный порошок, каждая вают в течение 10 дней, частица которого пронизана большим I

Летальную активность оценивают на. инбредНых мышах линии CC57BR либо

отечественной промышленностью марки 40 BALB/c. Внутривенно вводят препарат СКВ представляют достаточно однород- в объеме 1 мл. Гибель мьшей регист- ньй материал, размер диаметра пор у рируют в течение 5 дней. которого колеблется п пределах 20% и Отечную активность оценивают на характеризуется высокой скоростью морских свинках. Внутрикожно вводят протекания через них жидкостей. Спо- 45 по 0,2 мл препарата. Отек оценивают

по толщине кожной складки (в мм) по сравнению с контролем.

соб поясняется следующим примером. Пример. 10л токсичного культурального центрифугата, обладающего

отечной, защитной и летальной активАнтигенный состав фракций исследуют в иммуноэлектрофорезе против ностью, фильтруют на холоду () 50 нидеоспецифической противосибиреяз- через колонку 40 х 500 мм, заполнен- венной сыворотки.

ную-СКП с размером пор 700-2000 X, предварительно хорошо отмыв ее дис- ткгти рованной водой. CKopodiTb фильт-. рации 200-400 мм мин /сн ..Затем колонку отмывают от иесорбированных антигенов охлажденным злбуференным (0,0 М к-к фосфати.лй буфер рН 7,4) 0,9%-ньгм раствором NaCH.. Собранный

Фактор РА - II во фракции Ф, прошедшей через СКП не сорбируясь, тестируют в виде термолабильного ком- 55 понента (инактивируется при 56 с в течение 30 мин), реагирующего с ни-, доспецифической антисывороткой. РД - II из других фракций токсина идентифицируют по вьш1еуказанному препарату

PA - II в реакции иммуиодифуэии по Ухтерлоне.

Фактор LF - III идентифицируют по способности давать в соединении с РА - II смесь, летальную д)я пьшей CC57BR и BALB/c, Фактор EF I оиеии за;от по уровню аденилат- циклазной активности (в нг на 1 мг белка в 1 мин) , тестируе 5Ой in vitro

1282381 4

Основное достоинство предлагаемого способа по сравнению со способом- прототипом заключается в том, что при этих условиях происходит адсорбция на стекле не двух, а трех видов про- тективньгх антигеКов, кроме того, предлагаемые условия элюции позволяют увеличить на 20% выход адсорбированных протективных антигенов. Эти дорадиоизотопным методом. Белок опреде-}0 стоинства предлагаемого способа позволяют методом Лоури,

Распределение факторов токсина по фракциям, полученньм с колонки СКП, оценивагот по количеству белка (в мг) в препаратах EF - I, РА - II и LP - JII, полученных в результате последующей очистки.

На одной колонке, содержащей 500 см СКП5 быпи последовательно фпакционирова1 Ы 4 серии токсина, объемом по 10 п и получены сходные профили элюции антигенных фракций.

В соотзетствии с кривой элюции аьтиге ш, элюированные 0,3 М карбонатным буфером, можно разделить -иа две фракции, восходящую (Э,) и нис- ходящ: гю (Э||), и выделить антигены, элюироваиные дистиллированной водой Од)

ляют увеличить в i раза выход очищен- ных протективных антигенов и обогатить состав очищеннь х протективных антигенов фактором РА - II.

15 Кроме того, применение колоночной хроматографии на пористом стекле с . контролируемым размером пор позволяет увеличить производительность процесса получения, сократив затраты време20 ни, упростить процесс, соединив воедино процессы стерилизующей фильтрации и очистки, а также уменьшить число операций и тем самым сделав возможным его автоматизацию, применять

25 предлагаемый способ для промьтшенно- го производства.

Увеличение .ионной силы элюируюпмх- ; растворов (до Ш NaCl и до ЗМ ) - с одновременным снижением рН до 7,0

Из 1ение биологических свойств 30 либо снижение ионной силы до О (днеэтих фракций показало, что элюированные антигены (Э. +Э+Эд) обладали выV,U

раженными протективнои, отечной и летапькой активностями.

Элюция сорбированных на СКП факто- ческой активности протективньтх антиров токсина происходит в следующей последовательности (табл,2), сначала РА -- II и LF - III (Э и Э„), а затем EF I и LF - III (Э,. и Э„),

Предложенная нами дополнительная элюция дистиллированной водой позволила увеличить выход EF - I на 98% и LF - III на 31% (табл.).

генов, (табл.2).

Таким образом, поставленная цель - , улучшение качества препарата и увеличение его выхода - достигается благо- ,40 даря двум основным отличительным осо бенностям предлагаемого способа, а именно, применению, порошка из пористого стекла, с контролируемым размером пор, адсорбирующего эффективнее

Из общего количества РА - II, вы- 45 и полнее протективные антигены, чем

деленного из 10 л токсина, 12% содержится во фракции фильтрата Ф и 88% - во фракции люата, тогда как ЕЕ - Ij LF - III обнаруживается только во фракции элюата. 50

Степень очистки проективных антигенов во всех Фракциях элюата (Э, Э|, и Э„) по сравнению с фракцией фильтрата (Ф) достигает 79-85 - кратности.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получить до 9А,6% протективных антигенов всех трех видов) при 8П-кратной их очистке.

55 ДО ЗМ) и рН (6,0-9,6).

Формулаизоб

Способ получения сиб протективных антигенов

ляют увеличить в i раза выход очищен- ных протективных антигенов и обогатить состав очищеннь х протективных антигенов фактором РА - II.

15 Кроме того, применение колоночной хроматографии на пористом стекле с . контролируемым размером пор позволяет увеличить производительность процесса получения, сократив затраты време20 ни, упростить процесс, соединив воедино процессы стерилизующей фильтрации и очистки, а также уменьшить число операций и тем самым сделав возможным его автоматизацию, применять

25 предлагаемый способ для промьтшенно- го производства.

Увеличение .ионной силы элюируюпмх- ; растворов (до Ш NaCl и до ЗМ ) с одновременным снижением рН до 7,0

тиллированная вода) и рН до 6,0 позволяет увеличить выход антигенов с колонки на 18-20%. При рН ниже 6,0 наблюдается быстрая утрата биологипорошок из непористого стекла, при этом размер пор стекла в указанных пределах (700-2000 А) не влияет ре- шаюищм образом на его адсорбционную способность (табл.3), а также более полному снятию со стекла адсорбированных антигенов и использованию для элюции солевых растворов в более широком диапазоне концентраций (от О

Формулаизобретения

Способ получения сибиреязвенных протективных антигенов из культураль512823816

него фильтрата п утем их адсорбции пористого стекла с размерами пор s на с.теклянно.5 порошке с последующей пределах 7ПП-2000 X, а элюцию ведут элюцкс :, отличающийся тем, последовательно солевым раствором что, с целью увеличения выхода про- и дистиллированной водой в условиях дукта и сокращения времени, н качест- колоночной хроматот рафии. ве адсорбента используют порошок из .

Т а б л и ц а 1

Распределение сибиреязвенньпс прЬтективных антигенов, во фракциях. Полученных предлагаемым способом из 1П л токсина

Фильт

par - Ф О

Элюат

0,92 12

т и е я н U в 2

Яляймяе Hoimofl снхш и рП п« элицйм «ACOpeHpoeeMMix м СКП аятигвков

Карбонатный

9,6 О.ЗМ

7,0 0,02Н .

1М NaCl

7,0 0,02Н

+

зм W so

НцО

6,0 . о

Всего элюирован- иого белка

9,4 9,6 9,0 100 Чероз колонку (2x35 см), эаполненкуп СКЛ (2000 А., 100 см ) фильтровали по 1 л токсина.

0,92 5,3

7.7

7,8.

7,2

вО-в2

J.7

18

1,8

«8,7

1,в20

Влияние размера контролируемых пор стекла на адсорбционную емкость стеклянного порошка.

Через колонку фильтровали 1 л токсина.. Адсорбированные на стекле антигены последовательно элюировали 0,3 М карбонатным буфером рН 9,6 и ди(ггиллир званной водой.

Таблица 3

Изобретение относится к медицинской микробиологии, может быть использовано в вакциносывороточном производстве при получении сибирейзвен Мой токсоидной вакцины, а также ви- доспецифичной сибиреязвенной антисыворотки. Цель изобретения - увеличение выхода антигенов за счет исполь- зования в качестве адсорбента при их очистке порошка из пористого стекла. В качестве фильтра используют колонку из пористого стекла с размером пор 700 - 2000 А, Это позволяет в условиях колоночной хроматографии одновременно и стерилизовать токсический культуральный фильтрат и адсорбировать из нег о не только антигены EF - I и LF - III, но и 88% PA-II. Элюцию ведут последовательно солевым раствором и дистиллированной водой и условиях колоночной хроматографии. 3 табл. .. 1чЭ 00 го со 00