ДИАГНОСТИКА АУТИЗМА Российский патент 2008 года по МПК G01N33/68 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к способу диагностики аутизма с помощью постановки простого теста на пробе, полученной от субъекта.

Уровень техники

Аутизм является термином для обозначения комплекса симптомов у субъекта, означающим такую плохую способность к общению с окружающими его людьми, что за данным субъектом требуется уход со стороны общества различными путями в течение всей его жизни.

От 1 до 5 из 1000 человек, родившихся в Швеции, страдают аутизмом. Диагностика затруднена, и для ее надежной гарантии может потребоваться несколько лет. Педагогические и социальные меры, которые должны предпринимать общество и семья человека, страдающего аутизмом, продолжаются в течение всей жизни, и они являются очень дорогостоящими. Заболевание доставляет много страданий больным людям и их семьям. До сих пор не известно биохимического лечения (например, при использовании фармацевтических препаратов).

Патофизиология аутизма включает аномальную взаимосвязь нейронов, возможно, связанную с аномальным профилем пептидов, например, нейропептидов в мозге. Аномальные концентрации пептидов можно выявить протеомическим исследованием белков/пептидов с молекулярной массой ниже 10 кДа в спинномозговой жидкости и/или плазме крови. Детектирование аномальных концентраций пептидов при аутизме позволит выдвинуть новые гипотезы, касающиеся его патофизиологии, и сможет облегчить диагностику, и является основой для предложения новых возможностей для лечения. Поскольку большинство пептидов образуется в результате протеолиза более крупных молекул-предшественников, причиной аномальных концентраций пептидов может быть аномальная протеолитическая активность.

Проведено и имеется очень мало результатов биохимических исследований, касающихся аутизма, поскольку отсутствуют доступные модели на животных, и имеется практическая проблема сбора серьезного материала от пациентов.

В патенте ЕР-А-0979828, являющемся частью предшествующего уровня техники, раскрывается способ диагностики аутизма определением конкретных пептидов, находящихся в биологической жидкости. Наличие пептидов, состоящих из 3-4 аминокислот, указывает на аутизм, когда они находятся в больших количествах.

Патент ЕР-А-0969015 относится к способу диагностики заболевания, такого как аутизм, идентификацией пептидов, находящихся в ткани или жидкости организма. Раскрываются пептиды, имеющие длину из 3-8 аминокислот и имеющие молекулярную массу <1081.

Green L.A. et al. в Biological Psychiatry, 50: 609-613 (2001) раскрывают, что концентрация окситоцина в плазме крови людей с аутизмом отличается от таковой у здоровых людей. Количество удлиненного окситоцина (ОТ-Х) выше у людей с аутизмом, в то время как количество окситоцина (9 аминокислот) ниже.

Заявка US-A-2002/0006640 относится к полипептидам и способам диагностики аутизма, помимо всего прочего.

Ни в одном из этих документов не раскрываются пептиды по настоящему изобретению.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение основано на гипотезе о том, что основой аутизма является наличие аномального пептидного профиля в мозге и/или жидкостях, проникающих в мозг или окружающих его, т.е. крови и спинномозговой жидкости, и о том, что некоторые из данных пептидов могут нарушать сигналы (например, передаваемые нейропептидами), которые используются мозгом для коммуникации.

Изобретение отличается определением наличия или отсутствия некоторых белков/пептидов с определенными аминокислотными последовательностями, находящимися в пробе крови, где данные белки/пептиды имеют молекулярную массу соответственно 1779±1 Дальтон (Да), 1865±1 Да и 2022±1 Да.

В частности, настоящее изобретение относится к определению в пробе ткани, пробе жидкости организма и/или плазме крови более высокого, чем это имеет место в норме, количества одного или более из следующих пептидов

SKITHRIHWESASLL (SEQ. ID. №1),

SSKITHRIHWESASLL (SEQ. ID. №2),

SSKITHRIHWESASLLR (SEQ. ID. №3).

В предпочтительном воплощении способа количество пептида(ов) выше более, чем в 10 раз по сравнению с таковым в пробе от здорового человека.

В дополнительном предпочтительном воплощении соответствующий пептид определяют с использованием технологии твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).

В другом предпочтительном воплощении соответствующий пептид определяют с использованием технологии радиоиммуноанализа (РИА).

В еще одном предпочтительном воплощении соответствующий пептид определяют с использованием системы SELDI-TOF-MS.

В дополнительном аспекте изобретение относится к набору для определения указанных пептидов, где набор содержит маркер для определенных пептидов, имеющих молекулярную массу соответственно 1779, 1865 и 2022.

В предпочтительном воплощении он содержит маркер для одного или более пептидов, кодируемых аминокислотной последовательностью SSKITHRIHWESASLLR, SSKITHRIHWESASLL и/или SKITHRIHWESASLL.

Жидкость организма означает здесь любую жидкость организма, такую как цельная кровь, сыворотка крови, плазма крови, спинная жидкость, спинномозговая жидкость и лимфа.

Настоящие пептиды, конкретные значения которых представлены выше, могут представлять собой фрагмент белка плазмы крови, называемый комплементарным фактором С3.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение было подтверждено в экспериментальном исследовании с использованием так называемой технологии SELDI-TOF-MS (Clphergen Biosystems Inc. Palo Alto, CA. USA), новой протеомической технологии, с помощью которой анализировали и сравнивали пептидные профили плазмы крови у четырех детей с аутизмом и четырех детей, не страдающих аутизмом. Посредством этого было установлено, что, по меньшей мере, три пептида, каждый из которых содержит 15-20 аминокислот, находились в очень большом количестве у всех детей с аутизмом в полосе, соответствующей молекулярной массе в пределах 1700-2200 Да. Количество указанных пептидов было, по меньшей мере, в 10 раз выше в плазме крови у детей, страдающих аутизмом, по сравнению с детьми без аутизма.

На чертеже представлено восемь различных масс-спектров полосы, соответствующей молекулярной массе 1700-2200 Да, полученных от восьми детей, из которых четыре не имели диагноза аутизм и четыре имели диагностированный аутизм. Верхние четыре являются масс-спектрами полос от детей без диагноза аутизм и нижних четыре - от детей с аутизмом.

Становится очевидным, что имеется, по меньшей мере, три различных пика, имеющихся в пробах от детей с аутизмом, которые значительно отличаются от таковых у детей без диагноза аутизм. При использовании соответствующих маркеров молекулярной массы установлено, что примерно при 1779, 1865 и 2022 Да имеются большие пики. Площади различных пиков представляют количество соответствующих пептидов, где количества в 10 раз выше в пробах от детей с аутизмом по сравнению с пробами от детей, не имеющих диагностированного аутизма.

Структуры пептидов определяли с использованием МС/МС масс-спектрометрии, посредством чего определенные их аминокислотные последовательности представляли собой соответственно SSKITHRIHWESASLLR (SEQ. ID. №1), SSKITHRIHWESASLL (SEQ. ID. №3) и SKITHRIHWESASLL (SEQ. ID. №3). Первый пептид известен как комплемент С3f (инвентарный номер в NCBI 1413205 А), во втором отсутствует С-концевой аргинин, и в третьем отсутствует N-концевой серин.

Концентрацию выбранных пептидов, например, в пробах плазмы и спинномозговой жидкости, можно легко определить с помощью иммунохимических методов, таких как ELISA или РИА. Использование антител и введение метки в антитела и/или антигенные пептиды будет проводиться согласно общим протоколам, например, с применением метода с хлорамином Т для введения радиоизотопной метки.

Становится очевидным, что высокие концентрации в жидкостях/тканях организма данных пептидов, указанных выше, представляют собой, по меньшей мере, маркеры аутизма, и их можно легко использовать для диагностики аутизма. Однако определение наличия данных пептидов в высоких концентрациях также означает, что раскрыт возможный механизм патогенеза аутизма и что это может привести к новым возможностям лечения аутизма, например подавлением образования данных пептидов.

Изобретение относится к области медицины, а именно к диагностическим методам. Предложен способ диагностики аутизма посредством определения наличия высоких концентраций определенных пептидов в пробе крови и/или плазмы крови, и/или сыворотки. Способ предусматривает выявление определенных, имеющих аминокислотные последовательности SKITHRIHWESASLL, SSKITHRIHWESASLL и SSKITHRIHWESASLLR, с молекулярной массой соответственно 1779±1 Да, 1865±1 Да и 2022±1 Да. Превышение концентраций данных пептидов в 10 и более раз по сравнению с нормой является маркером для диагностики аутизма. 5 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ диагностики аутизма у субъектов с подозрением на аутизм или страдающих аутизмом, предусматривающий проведение анализа пробы крови и/или плазмы крови, и/или сыворотки на наличие концентраций определенных пептидов, превышающих норму в 10 или более раз, где указанные пептиды имеют молекулярную массу соответственно 1779±1 Да, 1865±1 Да и 2022±1 Да, и имеют аминокислотные последовательности:

SKITHRIHWESASLL (SEQ. ID. №1),

SSKITHRIHWESASLL (SEQ. ID. №2) и/или

SSKITHRIHWESASLLR (SEQ. ID. №3).