Объектом настоящего изобретения является способ (а) диагностики или мониторинга функции почек у субъекта, или (b) диагностики дисфункции почек у субъекта, или (c) прогнозирования или мониторинга риска нежелательного явления у заболевшего субъекта, где указанное нежелательное явление выбрано из группы, включающей ухудшение функции почек, включая почечную недостаточность, потерю функции почек и терминальную стадию заболевания почек, или смерть вследствие нарушения функции почек, включая почечную недостаточность, потерю функции почек и терминальную стадию заболевания почек, или (d) прогнозирования или мониторинга успеха терапии или вмешательства, включающий в себя
определение уровня проэнкефалина или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот в жидкости организма, полученной от указанного субъекта; и
(a) соотнесение указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с функцией почек у субъекта или
(b) соотнесение указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с дисфункцией почек, где повышенный уровень выше определенного порога является прогностическим или диагностическим признаком дисфункции почек у указанного субъекта, или
(c) соотнесение указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с указанным риском нежелательного явления у заболевшего субъекта, где повышенный уровень выше определенного порога является прогностическим фактором повышенного риска указанных нежелательных явлений или
(d) соотнесение указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с успехом терапии или вмешательства у заболевшего субъекта, где уровень ниже определенного порога является прогностическим фактором успеха терапии или вмешательства, при этом указанная терапия или вмешательство может представлять собой заместительную почечную терапию или может представлять собой лечение гиалуроновой кислотой у пациентов, перенесших заместительную почечную терапию, или прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства может представлять собой прогнозирование или мониторинг восстановления функции почек у пациентов с нарушением функции почек до и после заместительной почечной терапии и/или фармацевтических вмешательств,
где указанный проэнкефалин или его фрагмент выбраны из группы, включающей SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10 и SEQ ID No. 11,
при этом указанный порог находится в диапазоне 150-1290 пмоль/л,
и при этом указанный субъект является ребенком.
Еще одним объектом настоящего изобретения является способ диагностики или мониторинга функции почек у субъекта, включающий в себя:
определение уровня проэнкефалина или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот в жидкости организма, полученной от указанного субъекта; и
при этом во время последующего измерения относительное изменение уровня проэнкефалина и его фрагментов, которое является понижением, соотносится с улучшением функции почек субъекта, или
при этом во время последующего измерения относительное изменение проэнкефалина и его фрагмента, которое является повышением, соотносится с ухудшением функции почек субъекта,
где указанный проэнкефалин или его фрагмент выбран из группы, включающей SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10 и SEQ ID No. 11; и
при этом указанное определение проэнкефалина или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот проводят более одного раза у одного пациента,
при этом субъектом является ребенок.
Острое повреждение почек (AKI) определяется как внезапная потеря функции почек, которая приводит к снижению скорости клубочковой фильтрации (GFR), задержке выведения мочевины и других азотистых отходов и нарушению регуляции внеклеточного объема и электролитов. Термин AKI в значительной степени заменил собой острую почечную недостаточность, поскольку он более четко определяет почечную дисфункцию как постоянное, а не дискретное выявление недостаточности функции почек. Острое повреждение почек (AKI) является частым и серьезным осложнением у тяжелобольных детей: зарегистрированная заболеваемость составляет до 5% в общей палате и до 35% в педиатрическом отделении интенсивной терапии (PICU) (Zwiers et al. 2015. Critical Care 19: 181). Более того, было показано, что оно представляет собой независимый фактор риска смертности, продолжительного пребывания в отделении интенсивной терапии и длительной искусственной вентиляции легких (Alkandari et al. 2011. Crit Care 15: R146). Текущие единые критерии для диагностики AKI основаны на изменениях креатинина в сыворотке (SCr) и диуреза (Akcan-Arikan et al. 2007. Kidney International 71: 1028-1035). Тем не менее, SCr является индикатором клубочковой функции, а не повреждения клеток почечных канальцев, которое обычно происходит в начальной фазе AKI у пациентов в ICU (Andreoli 2009. Pediatr Nephrol 24: 253-63). Кроме того, на SCr влияют факторы, не связанные с функцией почек, и у новорожденных он отражает материнский уровень сразу после рождения (Schwartz and Furth 2007. Pediatr Nephrol 22: 1839-1848; Arant 1987. Pediatr Nephrol 1: 308-13). Таким образом, SCr все чаще считается поздним и не очень чувствительным маркером для диагностики AKI, особенно у детей. Термины «функция почек» и «ренальная функция» используются в описании как синонимы. Аналогично, термины «почечная недостаточность» и «ренальная недостаточность» используются как синонимы в описании. Другими предлагаемыми биомаркерами для обнаружения повреждения клеток почечного канальца являются, например, липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов (NGAL), молекула повреждения почек-1 (KIM-1), тканевый ингибитор металлопротеиназы-2 (TIMP-2) и белок-7, связывающий инсулиноподобный фактор роста (IGFBP-7). Однако эти маркеры не отражают функцию клубочковой фильтрации и могут зависеть от сопутствующих заболеваний, воспаления, времени измерения и выбранных пороговых значений (Kim et al. 2017. Ann Lab Med 37: 388-397; Ostermann et al. 2012. Critical Caare 16: 233).
Скорость клубочковой фильтрации (GFR) можно оценить по формуле с различными параметрами или определить с помощью функционального биомаркера, который фильтруется в клубочках. Как упоминалось выше, наиболее часто используемые тесты для оценки GFR основаны на концентрации SCr, хотя признаются многие ограничения. Помимо этнической принадлежности, массы тела и пола, вызывающих различия в продукции креатинина, на расчеты влияет активная почечная секреция креатинина (до 10-20% от общего клиренса) (Shemesh et al. 1985. Kidney Int 285: 830-838). Это приводит к завышению GFR, особенно у пациентов с ухудшением функции почек (Miller and Winkler, 1938. J Clin Invest, 1938; 171: 31-40). Таким образом, традиционные методы оценки GFR на основе креатинина являются нечувствительными, поздними и неточными.
Было показано, что плазменный клиренс иогексола, йодсодержащего контрастного вещества, которое фильтруется исключительно в клубочках, столь же точно определяет GFR, как и клиренс инулина, который в настоящее время является золотым стандартом для измерения истинной GFR. Однако эти способы только часто используются в клинической практике, так как являются времязатратными и определение на их основе является трудозатратным.
У детей чаще всего применяют формулы Schwartz и соавт., включающие креатинин и рост (Schwartz et al. 1987. Pediatr Clin North Am 34: 571-590). Однако это не подтверждается для детей младше 1 года и исследуется только в небольших когортах из-за этических проблем. Более того, в большинстве педиатрических исследований используются широкие возрастные интервалы, а рост не коррелирует с развитием почек <1 года. Созревание почечной функции представляет собой динамический процесс, который начинается во время органогенеза плода и завершается в раннем детстве. Повышение GFR в процессе развития зависит от наличия нормального нефрогенеза, процесса, который начинается на 9-й неделе беременности и завершается к 36-й неделе беременности, за которым следуют постнатальные изменения почечного и внутрипочечного кровотока. GFR составляет приблизительно от 2 до 4 мл в минуту на 1,73 м2 у доношенных новорожденных, но может быть ниже 0,6-0,8 мл в минуту на 1,73 м2 у недоношенных новорожденных. GFR быстро увеличивается в течение первых двух недель жизни, а затем монотонно повышается, пока не достигнет значений для взрослых в возрасте от 8 до 12 месяцев. Аналогично, канальцевая секреция является незрелой при рождении и достигает взрослой способности в течение первого года жизни (Boer et al. 2010. Pediatr Nephrol 25: 2107-2113; Kearns et al. 2003. N Engl J Med 349: 1157-1167). Наблюдается быстрое снижение уровня креатинина по мере созревания почек в первый год и небольшое увеличение в конце первого года из-за увеличения мышечной массы, что приводит к более высокому продуцированию креатинина (Boer et al. 2010. Pediatr Nephrol 25: 2107-2113).
Проэнкефалин А является предшественником семейства энкефалинов эндогенных опиоидов. Он представляет собой прогормон, который протеолитически процессируется с образованием нескольких активных пентапептидов, таких как метионин-энкефалин (Met-Enk) и лейцин-энкефалин (Leu-Enk) вместе с несколькими другими пептидными фрагментами (энкелитин и удлиненные на С-конце пептиды Met-Enk). В дополнение к зрелым энкефалинам продуцируются другие пептиды, один из которых представляет собой стабильный проэнкефалиновый пептид 119-159. Уровни этого пептидного фрагмента в плазме/сыворотке могут служить суррогатным показателем системного синтеза энкефалина, поскольку проэнкефалин является преобладающим источником зрелых энкефалинов. (Ernst et al., 2006. Peptides 27: 1835-1840). Энкефалины широко секретируются, чтобы воздействовать на локально экспрессированные опиоидные рецепторы, особенно на дельта-опиоидные рецепторы. Эти опиоидные рецепторы также широко экспрессируются, с наибольшей плотностью в почках (Denning et al. 2008. Peptides 29 (1): 83-921). После связывания с рецептором биологические эффекты энкефалинов включают ноцицепцию, анестезирование и сердечно-сосудистую регуляцию (Holaday 1983. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 23: 541-594). Эти δ-опиоидные агонисты стимулируют натрийурез и диурез (Sezen et al. 1998. J. Pharmacol. Exp. Ther. 287 (1): 238-245). Хотя в нескольких исследованиях было показано, что повышенные концентрации связаны с неблагоприятными исходами, в целом эта связь была пропорциональна изменению функции почек. Действительно, повышенные концентрации связаны со снижением функции почек в некоторых популяциях, включая сепсис (Marino et al. 2015. J Nephrol 28: 717-724), сердечную недостаточность (Ng et al. 2017. J. Am. Coll. Cardiol. 69 (1): 56-69; Matsue et al., 2017. J. Card. Fail. 23 (3): 231-239), кардиохирургические вмешательства (Shah et al., 2015. Clin. Nephrol. 83 (1): 29-35) и инфаркт миокарда (Ng et al. 2014. J. Am. Coll. Cardiol. 63 (3) (2014) 280-289).
Уровни метионина-энкефалина (Met-Enk) в плазме и формы Met-Enk с более высокой молекулярной массой (удлиненные на C-конце пептиды Met-Enk) измеряли у новорожденных при рождении (Martinez et al. 1991. Biol Neonate 60: 102-107). Уровни иммунореактивности Met-Enk были значительно выше у новорожденных по сравнению с уровнями в плазме взрослых с коэффициентом 15. Напротив, более высокомолекулярные формы Met-Enk, измеренные как общая иммунореактивность Met-Enk, статистически не отличались между уровнями у новорожденных и взрослых.
Неожиданным открытием настоящего изобретения стало то, что уровни проэнкефалина и его фрагментов, особенно проэнкефалина 119-159 (MR-PENK, SEQ ID No. 6), значительно повышены в плазме детей по сравнению со взрослыми в статусе «здоров». Кроме того, уровень проэнкефалина и его фрагментов, особенно проэнкефалина 119-159 (MR-PENK, SEQ ID No. 6), значительно выше у детей с дисфункцией почек по сравнению с детьми с нормальной функцией почек.
Термины про-энкефалин, проэнкефалин и PENK используются в описании как синонимы.
Риск в соответствии с настоящим изобретением коррелирует с риском, в соответствии с определенным в критериях RIFLE. Классификация RIFLE состоит из трех уровней дисфункции почек с увеличением степени тяжести, а именно «риска (R)», «повреждения (I)», и «отказа (F)», в зависимости от степени снижения расчетного клиренса креатинина (eCCL) и диуреза (таблица 1). В дополнение к «R», «I» и «F» имеются два уровня неблагоприятного клинического исхода: «Потеря (L)», которая относится к постоянной ренальной недостаточности в течение >4 недель, и «терминальная стадия (Е)» что относится к постоянной почечной недостаточности в течение >3 месяцев. Критерии pRIFLE отличаются от критериев RIFLE в том, что только снижение eCCL, а не изменение в SCr или GFR, используются для определения результата классификации. Кроме того, eCCL оценивают по формуле Шварца, которая включает в себя уровень роста и SCr пациента, и настраиваемую по возрасту константу (Schwartz et al. 1987. Pediatr Clin North Am 34:571-590), и в то же время зависит от более длительного диуреза, чем в классификации RIFLE для взрослых. Кроме того, существуют дополнительные критерии (AKIN/KDIGO) для педиатрии (таблица 1). Рекомендации KDIGO относятся к pRIFLE для определения AKI у детей, и последний остается используемым для детей в возрасте старше 1 месяца (Thomas et al. 2015. Kidney International 87: 62-73).
Таблица 1. Педиатрические шкалы RIFLE, AKIN и KDIGO (Thomas et al. 2015. Kidney International 87: 62-73)
снижение eGFR на ≥25% или повышение Cr на 50-99% по сравнению с исходным уровнем в течение 7 днейc (1,50-1,99 × исходный уровень)
или повышение Cr на 50-99% по сравнению с исходным уровнем в течение 7 днейс (1,50-1,99 × исходный уровень)
-
(≥3,00 × исходный уровень)
(В pRIFLE, RRT не приравнивается автоматически к стадии Отказ или стадии 3)126
(≥3,00 × исходный уровень)
Или любые требования для заместительной почечной терапии
-
Сокращения: AKIN, сеть AKI; Cr, креатинин; eGFR, расчетная скорость клубочковой фильтрации; KDIGO, Инициатива по улучшению качества исходов заболеваний почек; RRT, заместительная почечная терапия.
a Эквивалентно 0,3 мг/дл с округлением единиц СИ до ближайшего целого числа
b Следует обратить внимание, что продолжительность олигурии на стадиях риска и повреждения отличается от продолжительности той же стадии у взрослых и указана для классификации pRIFLE.
c Если известно (на основании предыдущего анализа крови) или предполагается (на основании анамнеза пациента) повышение в течение 7 дней.
Объектом настоящего изобретения является применение проэнкефалина (PENK) или его фрагментов в качестве маркера функции и дисфункции почек и его клиническое применение у здоровых и больных детей. Объектом настоящего изобретения является способ диагностики или мониторинга функции почек у детей, или диагностики дисфункции почек у детей, или прогнозирования риска нежелательных явлений у заболевшего ребенка.
Объектом настоящего изобретения также являлось обеспечение прогностической и диагностической значимости PENK или его фрагментов для диагностики функции почек, дисфункции почек и прогностической значимости у заболевших детей.
Неожиданно было показано, что PENK или его фрагменты являются мощными и имеющими высокую значимость биомаркерами почек, их функции, дисфункции, риска нежелательных явлений и прогноза, а также мониторинга успеха терапии или вмешательства у детей.
Согласно настоящему изобретению, указанный проэнкефалин или его фрагменты не являются Leu-энкефалином и Met-энкефалином в одном конкретном варианте осуществления. В другом конкретном варианте осуществления указанный фрагмент проэнкефалина представляет собой среднерегиональный проэнкефалин (MR-PENK; SEQ ID No. 6) или его фрагмент, содержащий, по меньшей мере 5 аминокислот.
Объектом настоящего изобретения также является способ (а) диагностики или мониторинга функции почек у субъекта, или (b) диагностики дисфункции почек у субъекта, или (c) прогнозирования или мониторинга риска нежелательного явления у указанного заболевшего субъекта, где нежелательное явление выбрано из группы, включающей ухудшение функции почек, включая почечную недостаточность, потерю функции почек и терминальную стадию заболевания почек, или смерть вследствие нарушения функции почек, включая почечную недостаточность, потерю функции почек и терминальную стадию заболевания почек, или (d) прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства, включающего
определение уровня иммунореактивного аналита с использованием по меньшей мере одного связывающего вещества, которое связывается с областью аминокислотной последовательности проэнкефалина (PENK) в жидкости организма, полученной от указанного субъекта; и
(a) соотнесение указанного уровня иммунореактивного аналита с функцией почек у субъекта или
(b) соотнесение указанного уровня иммунореактивного аналита с дисфункцией почек, где повышенный уровень выше определенного порога является прогностическим или диагностическим признаком дисфункции почек у указанного субъекта, или
(c) соотнесение указанного уровня иммунореактивного аналита с указанным риском нежелательного явления у заболевшего субъекта, где повышенный уровень выше определенного порога является прогностическим фактором повышенного риска указанных нежелательных явлений или
(d) соотнесение указанного уровня иммунореактивного аналита с успехом терапии или вмешательства у заболевшего субъекта, где уровень ниже определенного порога является прогностическим фактором успеха терапии или вмешательства, при этом указанная терапия или вмешательство может представлять собой заместительную почечную терапию или может представлять собой лечение с помощью гиалуроновой кислоты у пациентов, перенесших заместительную почечную терапию, или прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства может представлять собой прогнозирование или мониторинг восстановления функции почек у пациентов с нарушением функции почек до и после заместительной почечной терапии и/или фармацевтических вмешательств, и
при этом указанный порог находится в диапазоне 150-1290 пмоль/л,
где указанный субъект является ребенком.
Это означает, что в случае использования в способах по настоящему изобретению связывающего вещества, которое связывается с областью аминокислотной последовательности проэнкефалина (PENK) в жидкости организма, термины «определение уровня проэнкефалина (PENK) или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот в жидкости организма, полученной от указанного субъекта», эквивалентны «определению уровня иммунореактивного аналита с использованием, по меньшей мере, одного связывающего вещества, которое связывается с областью аминокислотной последовательности проэнкефалина (PENK) в жидкости организма, полученной от указанного субъекта». В конкретном варианте осуществления в способах по настоящему изобретению используется связывающее вещество, которое связывается с областью аминокислотной последовательности проэнкефалина (PENK) в жидкости организма. В конкретном варианте осуществления указанное связывающее вещество, используемое в способах по настоящему изобретению, не связывается с областью аминокислотной последовательности Leu-энкефалина или Met-энкефалина в жидкости организма. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения указанное по меньшей мере одно связывающее вещество связывается со среднерегиональным проэнкефалином (MR-PENK) или его фрагментом, состоящим, по меньшей мере, 5 аминокислот.
Используемый в настоящем описании термин «субъект» относится к живому организму, являющемуся человеком или не являющемуся человеком. Предпочтительно, в настоящем описании субъектом является человек. Субъект может быть здоровым или заболевшим, если не указано иное.
Используемый в настоящем описании термин «ребенок» относится к субъекту в возрасте 18 лет или младше, более предпочтительно, в возрасте 14 лет или младше, еще более предпочтительно, в возрасте 12 лет или младше, еще более предпочтительно, в возрасте в возрасте 8 лет или младше, еще более предпочтительно, в возрасте 5 лет или младше, еще более предпочтительно, в возрасте 2 лет или младше, наиболее предпочтительно, в возрасте одного года или младше.
В конкретном варианте осуществления указанный ребенок является новорожденным. Новорожденный относится к ребенку в первые 28 дней после рождения и относится к недоношенным, доношенным и переношенным детям.
Термин «тяжелобольной пациент» определяется как пациент с высоким риском фактически или потенциально опасных для жизни проблем со здоровьем, требующих интенсивного наблюдения и ухода. Этим пациентам может потребоваться поддержка при сердечнососудистой нестабильности (гипертензия/гипотензия), потенциально летальных сердечных аритмиях, нарушении проходимости дыхательных путей или дыхательной недостаточности (например, поддержка искусственной вентиляцией легких), острой почечной недостаточности или кумулятивных эффектах полиорганной недостаточности, которые в настоящее время чаще называют синдромом множественной органной дисфункции.
В конкретном варианте осуществления изобретения следует понимать, что этим пациентам может потребоваться поддержка при сердечнососудистой нестабильности (гипертензия/гипотензия), потенциально смертельных сердечных аритмиях, нарушении проходимости дыхательных путей или дыхательной недостаточности (например, поддержка искусственной вентиляцией легких) или кумулятивных эффектов полиорганной недостаточности, которые в настоящее время чаще называют синдромом множественной органной дисфункции.
Термин «повышенный уровень» означает уровень выше определенного порогового уровня. Термин «повышенный» уровень может означать уровень выше значения, которое рассматривается как контрольный уровень.
Термин «диагностика» в контексте настоящего изобретения относится к распознаванию и (раннему) обнаружению заболевания или клинического состояния у субъекта и может также включать дифференциальную диагностику.
Термин «предсказание» в контексте настоящего изобретения означает предсказание того, как будет развиваться состояние здоровья субъекта (например, пациента). Это может включать оценку вероятности выздоровления или вероятности неблагоприятного исхода для указанного субъекта.
Термин «мониторинг» в контексте настоящего изобретения относится к контролированию развития заболевания и/или патофизиологического состояния субъекта.
Термин «мониторинг успеха терапии или вмешательства» в контексте настоящего изобретения относится к контролю и/или корректировке терапевтического лечения указанного пациента.
Прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства может представлять собой, например, прогнозирование или мониторинг успеха заместительной почечной терапии с применением измерения проэнкефалина (PENK) или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот.
Прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства может представлять собой, например, прогнозирование или мониторинг успеха лечения гиалуроновой кислотой у пациентов, получавших заместительную почечную терапию, с применением измерения проэнкефалина (PENK) или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот.
Прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства может заключаться, например, в прогнозировании или мониторинге восстановления функции почек у пациентов с нарушением функции почек до и после заместительной почечной терапии и/или фармацевтических вмешательств с применением измерения PENK или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот.
Жидкость организма может быть выбрана из группы, включающей кровь, сыворотку, плазму, мочу, спинномозговую жидкость (CSF) и слюну. В одном из вариантов осуществления изобретения жидкость организма выбрана из группы, включающей цельную кровь, плазму и сыворотку.
Определение проэнкефалина или его фрагментов демонстрирует функцию почек у субъекта. Повышенная концентрация проэнкефалина или его фрагментов выше определенного порогового уровня свидетельствует о сниженной функции почек. Во время последующих измерений относительное изменение проэнкефалина или его фрагментов коррелирует с улучшением (снижением проэнкефалина или его фрагментов) и ухудшением (повышение проэнкефалина или его фрагментов) функции почек субъектов.
Проэнкефалин или его фрагменты служат для диагностики дисфункции почек, при этом повышенный уровень выше определенного порога является прогностическим или диагностическим признаком дисфункции почек у указанного субъекта. Во время последующих измерений относительное изменение проэнкефалина или его фрагментов коррелирует с улучшением (снижением проэнкефалина или его фрагментов) и ухудшением (увеличением проэнкефалина или его фрагментов) функции почек субъектов.
Проэнкефалин или его фрагменты превосходят другие маркеры в диагностике функции/дисфункции почек и последующем наблюдении (NGAL, креатинин крови, клиренс креатинина, цистатин С, мочевина). Превосходство означает более высокую специфичность, более высокую чувствительность и лучшую корреляцию с клиническими конечными точками.
Соотнесение указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с риском нежелательных явлений у заболевшего субъекта (ребенка), где повышенный уровень выше определенного порога является прогностическим фактором повышенного риска нежелательных явлений. В этом аспекте проэнкефалин или его фрагменты превосходят указанные выше клинические маркеры.
Функцию почек можно измерить по GFR, клиренсу креатинина, SCr, анализу мочи, азоту мочевины крови или диурезу. Дисфункция почек означает снижение функции почек, например, почечную недостаточность.
Заболевший субъект (ребенок) может страдать заболеванием или может подвергаться риску страдания заболеванием, выбранным из хронического заболевания почек (CKD), острого заболевания почек (AKD) или AKI.
Состояния, влияющие на структуру и функцию почек, можно рассматривать как острые или хронические, в зависимости от их продолжительности.
AKD характеризуется структурным поражением почек в течение <3 месяцев и функциональными критериями, которые также обнаруживаются при AKI, либо GFR <60 мл/мин на 1,73 м2 в течение <3 месяцев, либо снижением GFR на >35%, либо повышение сывороточного креатинина (SCr) более чем на 50% в течение <3 месяцев (Kidney International Supplements, Vol. 2, Issue 1, March 2012, pp. 19-36).
AKI является одним из ряда острых заболеваний и расстройств почек и может возникать в сочетании с другими острыми или хроническими заболеваниями и расстройствами почек или без них (Kidney International Supplements, Vol. 2, Issue 1, March 2012, pp. 19-36).
AKI определяется как снижение функции почек, включая снижение GFR и почечную недостаточность. Критерии для постановки диагноза AKI и стадии тяжести AKI основаны на изменениях в SCr и диурезе. В AKI не требуются структурные критерии (но могут существовать), но обнаруживается повышение SCr на 50% в течение 7 дней, или повышение на 0,3 мг/дл (26,5 мкмоль/л) или олигурия. AKD может возникнуть у пациентов с травмой, инсультом, сепсисом, SIRS, септическим шоком, дыхательной недостаточностью, сердечной недостаточностью (например, острой и после инфаркта миокарда, остановкой сердца), врожденной диафрагмальной грыжей, местными и системными бактериальными и вирусными инфекциями, аутоиммунными заболеваниями, ожогами, после хирургического вмешательства, раком, заболеваниями печени, заболеваниями легких, а также у пациентов, получающих нефротоксины, такие как ингибиторы кальциневрина (например, циклоспорин), антибиотики (например, аминогликозиды или ванкомицин) и противоопухолевые препараты (например, цисплатин).
CKD характеризуется GFR <60 мл/мин на 1,73 м2 в течение >3 месяцев и поражением почек в течение >3 месяцев (Kidney International Supplements, 2013; Vol. 3: 19-62).
Почечная недостаточность является стадией CKD и определяется как GFR <15 мл/мин на 1,73 м2 площади поверхности тела или потребность в RRT.
Определения AKD, AKI и CKD (согласно руководству по клинической практике KDIGO для острого повреждения почек, 2012 г., том 2 (1)) обобщены в таблице 2.
Таблица 2: Определение AKI, AKD и CKD
Повышение SCr на 0,3 мг/дл (26,5 мкмоль/л) в течение 2 дней, ИЛИ
Олигурия
GFR <60 мл/мин на 1,73 м2 в течение <3 месяцев, ИЛИ
Понижение GFR на≥35% или повышение SCr на >50% в течение < 3 месяцев
Стабильный SCr
NKD=отсутствие заболевания почек
У детей младше 2 лет пороговые значения GFR, которые определяют и устанавливают стадию повреждения почек и снижения почечной функции, необходимо адаптировать в зависимости от возраста (Клиническое практическое руководство KDIGO 2012 по оценке и лечению хронической болезни почек).
В предпочтительном варианте осуществления изобретения заболевший субъект (ребенок) может страдать заболеванием, выбранным из почечной недостаточности, дыхательной недостаточности, врожденной диафрагмальной грыжи, сердечной недостаточности, SIRS, сепсиса, септического шока или другого тяжелого заболевания.
Терапия или вмешательство, поддерживающие или замещающие функцию почек, могут включать различные методы заместительной почечной терапии, включая, но не ограничиваясь указанным, гемодиализ, перитонеальный диализ, гемофильтрацию и трансплантацию почки.
Терапия или вмешательство, поддерживающие или замещающие функцию почек, может также включать фармацевтические вмешательства, меры по поддержке почек, а также адаптацию и/или отмену нефротоксичных лекарственных препаратов.
Нежелательное явление может быть выбрано из группы, включающей ухудшение функции почек, включая почечную недостаточность, потерю функции почек и терминальную стадию заболевания почек, или смерть вследствие нарушения функции почек, включая почечную недостаточность, потерю функции почек и терминальную стадию заболевания почек (согласно педиатрическим критериям RIFLE (Akcan-Arikan et al. 2007. Kidney International 71: 1028-1035)).
В одном из вариантов осуществления изобретения следует понимать, что термин «фрагменты проэнкефалина» также включает Leu-энкефалин и Met-энкефалин.
Объектом настоящего изобретения является способ, в котором уровень проэнкефалина или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот определяют с использованием по меньшей мере одного связывающего вещества для проэнкефалина или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот. В одном из вариантов осуществления изобретения указанное связывающее вещество выбрано из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или не-Ig-каркас, связывающийся с проэнкефалином или его фрагментами, состоящими, по меньшей мере, из 5 аминокислот. В конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с областью, имеющей последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12. В конкретном варианте осуществления указанное связывающее вещество не связывается с пептидами энкефалина: Met-энкефалин, SEQ ID No. 3 и Leu-энкефалин, SEQ ID No. 4. В конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с областью, имеющей последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 8, 9, 10 и 11. В другом конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с областью, имеющей последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 8 и 9. В другом конкретном варианте осуществления указанное связывающее вещество связывается с проэнкефалином 119-159, среднерегиональным фрагментом проэнкефалина, MR-PENK, SEQ ID No. 6.
Проэнкефалин имеет следующую последовательность:
SEQ ID No. 1 (проэнкефалин 1-243)
ECSQDCATCSYRLVRPADINFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTLRENSKPEESHLLAKRYGGFMKRYGGFMKKMDELYPMEPEEEANGSEILAKRYGGFMKKDAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVSKRYGGFMRGLKRSPQLEDEAKELQKRYGGFMRRVGRPEWWMDYQKRYGGFLKRFAEALPSDEEGESYSKEVPEMEKRYGGF MRF
Фрагменты проэнкефалина, которые можно определить в жидкости организма, могут быть, например, выбраны из группы следующих фрагментов:
SEQ ID No. 2 (синенкефалин, проэнкефалин 1-73)
ECSQDCATCSYRLVRPADINFLACVMECEGKLPSLKIWETCKELLQLSKPELPQDGTSTLRENSKPEESHLLA
SEQ ID No. 3 (Met-энкефалин)
YGGFM
SEQ ID No. 4 (Leu-энкефалин)
YGGFL
SEQ ID No. 5 (проэнкефалин 90-109)
MDELYPMEPEEEANGSEILA
SEQ ID NO 6: (проэнкефалин 119-159, среднерегиональный фрагмент проэнкефалина, MR-PENK)
DAEEDDSLANSSDLLKELLETGDNRERSHHQDGSDNEEEVS
SEQ ID No. 7 (Met-энкефалин-Arg-Gly-Leu)
YGGFMRGL
SEQ ID No. 8 (проэнкефалин 172-183)
SPQLEDEAKELQ
SEQ ID No. 9 (проэнкефалин 193-203)
VGRPEWWMDYQ
SEQ ID No. 10 (проэнкефалин 213-234)
FAEALPSDEEGESYSKEVPEME
SEQ ID No. 11 (проэнкефалин 213-241)
FAEALPSDEEGESYSKEVPEMEKRYGGF M
SEQ ID No. 12 (Met-энкефалин-Arg-Phe)
YGGFMRF
Определение уровня проэнкефалина, включая Leu-энкефалин и Met-энкефалин или их фрагменты, может означать, что определяют иммунореактивность по отношению к проэнкефалину или его фрагментам, включая Leu-энкефалин и Met-энкефалин. Связывающее вещество, используемое для определения проэнкефалина, включая Leu-энкефалин и Met-энкефалин или их фрагменты, в зависимости от области связывания, может связываться более чем с одной из показанных выше молекул. Это понятно специалисту в данной области техники.
Таким образом, согласно настоящему изобретению уровень иммунореактивного аналита при использовании по меньшей мере одного связывающего вещества, которое связывается с областью в пределах аминокислотной последовательности любого из вышеуказанных пептидов и пептидных фрагментов (т.е., проэнкефалина (PENK) и фрагментов согласно любой из SEQ ID No. от 1 по 12) определяют в жидкости организма, полученной от указанного субъекта; и соотносят с конкретными вариантами осуществления, имеющими клиническую значимость.
В более конкретном варианте осуществления способа по настоящему изобретению определяют уровень MR-PENK (SEQ ID No. 6: проэнкефалин 119-159, среднерегиональный фрагмент проэнкефалина, MR-PENK). В более конкретном варианте осуществления определяют уровень иммунореактивного анализируемого вещества с использованием по меньшей мере одного связывающего вещества, которое связывается с MR-PENK, и его соотносят с вышеупомянутыми вариантами осуществления по изобретению и конкретными вариантами осуществления, имеющими клиническую значимость, например
(a) соотнесение указанного уровня иммунореактивного аналита с функцией почек у субъекта или
(b) соотнесение указанного уровня иммунореактивного аналита с дисфункцией почек, при этом повышенный уровень выше определенного порога является прогностическим или диагностическим признаком дисфункции почек у указанного субъекта, или
(c) соотнесение указанного уровня иммунореактивного аналита с указанным риском нежелательного явления у заболевшего субъекта, где повышенный уровень выше определенного порога является прогностическим фактором повышенного риска указанных нежелательных явлений или
(d) соотнесение указанного уровня иммунореактивного аналита с успехом терапии или вмешательства у заболевшего субъекта, где уровень ниже определенного порога является прогностическим фактором успеха терапии или вмешательства, при этом указанная терапия или вмешательство может представлять собой заместительную почечную терапию или может представлять собой лечение с помощью гиалуроновой кислоты у пациентов, перенесших заместительную почечную терапию, или прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства может представлять собой прогнозирование или мониторинг восстановления функции почек у пациентов с нарушением функции почек до и после заместительной почечной терапии и/или фармацевтических вмешательств,
при этом указанный порог находится в диапазоне 150-1290 пмоль/л,
где указанный субъект является ребенком.
Альтернативно, уровень любого из вышеуказанных аналитов может быть определен другими аналитическими методами, например, посредством масс-спектроскопии.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ (а) диагностики или мониторинга функции почек у субъекта, или (b) диагностики дисфункции почек у субъекта, или (c) прогнозирования или мониторинга риска нежелательных явлений у заболевшего субъекта, где указанное нежелательное явление выбрано из группы, включающей ухудшение функции почек, включая почечную недостаточность, потерю функции почек и терминальную стадию заболевания почек, или смерть вследствие нарушения функции почек, включая почечную недостаточность, потерю функции почек и терминальную стадию заболевания почек, или (d) прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства, включающий в себя
определение уровня иммунореактивного аналита с использованием по меньшей мере одного связывающего вещества, которое связывается с областью в пределах аминокислотной последовательности пептида, выбранного из группы, включающей пептиды проэнкефалина и фрагменты с SEQ ID No. 1-12, в полученной жидкости организма от указанного субъекта; и
соотнесение указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с функцией почек у субъекта или
соотнесение указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с дисфункцией почек, где повышенный уровень выше определенного порога является прогностическим или диагностическим признаком дисфункции почек у указанного субъекта, или
соотнесение указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с указанным риском нежелательного явления у заболевшего субъекта, где повышенный уровень выше определенного порога является прогностическим фактором повышенного риска указанных нежелательных явлений или
соотнесение указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с успехом терапии или вмешательства у заболевшего субъекта, где уровень ниже определенного порога является прогностическим фактором успеха терапии или вмешательства, при этом указанная терапия или вмешательство может представлять собой заместительную почечную терапию или может представлять собой лечение гиалуроновой кислотой у пациентов, перенесших заместительную почечную терапию, или прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства может представлять собой прогнозирование или мониторинг восстановления функции почек у пациентов с нарушением функции почек до и после заместительной почечной терапии и/или фармацевтических вмешательств,
при этом указанный порог находится в диапазоне 150-1290 пмоль/л,
где указанный субъект является ребенком.
В конкретном варианте осуществления уровень иммунореактивного анализируемого вещества определяют с использованием по меньшей мере одного связывающего вещества, которое связывается с областью в пределах аминокислотной последовательности пептида, выбранного из группы, включающей проэнкефалин или его фрагменты, состоящие, по меньшей мере, из 5 аминокислот. В конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с областью, имеющей последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12. В конкретном варианте осуществления указанное связывающее вещество не связывается с пептидами энкефалина Met-энкефалин, SEQ ID No. 3, и Leu-энкефалин, SEQ ID No. 4. В конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с областью, имеющей последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 8, 9, 10 и 11. В другом конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с областью, имеющей последовательности, выбранные из группы, включающей SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 8 и 9. В другом конкретном варианте осуществления указанное связывающее вещество связывается с проэнкефалином 119-159, среднерегиональным фрагментом проэнкефалина, MR-PENK (SEQ ID No. 6). Вышеупомянутое связывающее вещество связывается с указанными пептидами в жидкости организма, полученной от указанного субъекта.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанное связывающее вещество выбрано из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или не-Ig-каркас, связывающийся с проэнкефалином или его фрагментами, состоящими, по меньшей мере, из 5 аминокислот.
В конкретном варианте осуществления уровень проэнкефалина или его фрагментов измеряют с помощью иммунологического анализа с использованием антител или фрагментов антител, связывающихся с проэнкефалином или его фрагментами. Иммуноанализ, который может быть полезен для определения уровня проэнкефалина или его фрагментов, содержащих не менее 5 аминокислот, может включать в себя этапы, описанные в примере 1. Все пороги и значения должны рассматриваться в соответствии с тестом и калибровкой, применяемой в соответствии с примером 1. Специалисту в данной области техники может быть известно, что на абсолютное значение порога может влиять используемая калибровка. Это означает, что все значения и пороги, приведенные в настоящем описании, следует понимать в контексте калибровки, используемой в настоящем описании (пример 1).
Согласно изобретению, диагностическое связывающее вещество для проэнкефалина выбирают из группы, состоящей из антител, например, IgG, типичного полноразмерного иммуноглобулина, или фрагментов антител, содержащих по меньшей мере F-вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, как, например, химически сопряженные антитела (фрагменты, связывающие антиген), включая, но не ограничиваясь указанным, Fab-фрагменты, включая мини-тела Fab, одноцепочечные Fab-антитела, моновалентные Fab-антитела с эпитопными метками, например Fab-V5Sx2; двухвалентное Fab (мини-антитело), димеризованное с доменом CH3; двухвалентное Fab или поливалентное Fab, например, образованный посредством мультимеризации с помощью гетерологичного домена, например, путем димеризации доменов dHLX, например Fab-dHLX-FSx2; F(ab')2-фрагменты, scFv-фрагменты, мультимеризованные поливалентные и/или мультиспецифические scFv-фрагменты, двухвалентные и/или биспецифические диатела, BITE® (привлекающий T-клетки биспецифический активатор), трифункциональные антитела, поливалентные антитела, например, из класса, отличного от G; однодоменные антитела, например, нанотела, полученные из иммуноглобулинов верблюдовых или рыб.
В конкретном варианте осуществления уровень проэнкефалина или его фрагментов измеряют с помощью анализа с применением связывающих веществ, выбранных из группы, включающей аптамеры, каркасы, отличные от Ig, как более подробно описано ниже, связывающиеся с проэнкефалином или его фрагментами.
Связывающее вещество, которое можно использовать для определения уровня проэнкефалина или его фрагментов, демонстрирует константу сродства к проэнкефалину не менее 107 М-1, предпочтительно, 108 М-1, предпочтительная константа сродства превышает 109 М-1, наиболее предпочтительно, превышает 1010 М-1. Специалисту в данной области техники известно, что можно рассматривать возможность компенсации более низкой аффинности путем применения более высокой дозы соединений, и эта мера не выводит за пределы объема изобретения. Аффинность связывания можно определить с применением метода Biacore, предлагаемого в качестве сервисного анализа, например, в Biaffin, Кассель, Германия (http://www.biaffin.com/de/).
В дополнение к антителам в данной области техники хорошо известно, что другие биополимерные каркасы образуют комплексы с молекулой-мишенью и были использованы для получения биополимеров с высокой специфичностью к мишеням. Примерами являются аптамеры, шпигельмеры, антикалины и конотоксины. Не-Ig каркасы могут представлять собой белковые каркасы и могут использоваться в качестве имитаторов антител, поскольку они способны связываться с лигандами или антигенами. Не-Ig каркасы могут быть выбраны из группы, включающей каркасы не-Ig на основе тетранектина (например, описанные в US 2010/0028995), фибронектиновые каркасы (например, описанные в EP 1266025; каркасы на основе липокалина (например, описанные в WO 2011/154420); убиквитиновые каркасы (например, описанные в WO 2011/073214), каркасы для переноса (например, описанные в US 2004/0023334), каркасы из белка А (например, описанные в EP 2231860), каркасы на основе анкириновых повторов (например, описанные в WO 2010/060748) каркасы на основе микробелков, предпочтительно, микробелков, образующих цистеиновый узел (например, описанные в EP 2314308), каркасы на основе домена Fyn SH3 (например, описанные в WO 2011/023685) каркасы на основе домена EGFR-A (например, описанные в WO 2005/040229) и каркасы на основе доменов Кунитца (например, описанные в EP 1941867).
Пороговый уровень представляет собой уровень, который позволяет отнести субъекта к группе субъектов, у которых диагностировано заболевание/дисфункция почек или существует риск нежелательного явления, или в группу субъектов, у которых не диагностировано заболевание почек/дисфункция или риск нежелательного явления. Таким образом, пороговый уровень должен позволять проводить различие между субъектом, у которого диагностировано заболевание/дисфункция почек или имеется риск нежелательного явления, и группой субъектов, у которых не диагностировано заболевание/дисфункция почек или не имеется риска нежелательного явления. В данной области техники известно, как можно определить пороговые уровни. Пороговые уровни являются предварительно определенными значениями и устанавливаются в соответствии с обычными требованиями, например, с точки зрения специфичности и/или чувствительности. Эти требования могут варьироваться. Например, может быть так, что чувствительность или специфичность, соответственно, должны быть установлены в определенных пределах, например, 80%, 90%, 95% или 98%, соответственно.
Чувствительность и специфичность диагностического и/или прогностического теста зависят не только от аналитического «качества» теста, они также зависят от определения того, что представляет собой аномальный результат. На практике кривые соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов (кривые ROC) обычно рассчитывают путем построения графика зависимости значения переменной от ее относительной частоты в «контрольной группе» (т. е., очевидно здоровых и/или без признаков и симптомов почечной недостаточности) и популяции «с заболеванием» (т.е., пациентов, страдающих почечной недостаточностью). Для любого конкретного маркера распределение уровней маркеров у субъектов с заболеванием и без него, вероятно, будет перекрываться. В таких условиях тест не может абсолютно отличить норму от заболевания со 100% точностью, а область перекрытия указывает, где тест не может отличить норму от заболевания. Выбирают порог, выше которого (или ниже которого, в зависимости от того, как меняется маркер при заболевании) тест считается аномальным, и ниже которого тест считается нормальным. Площадь под кривой ROC является мерой вероятности того, что выявленное измерение позволит правильно идентифицировать состояние. Кривые ROC можно использовать, даже если результаты испытаний не обязательно дают точное число. Пока можно ранжировать результаты, можно создать ROC-кривую. Например, результаты теста на образцах «заболевания» могут быть ранжированы в соответствии со степенью (например, 1=низкая, 2=нормальная и 3=высокая). Это ранжирование можно сопоставить с результатами в «контрольной» группе и создать кривую ROC. Эти способы хорошо известны в данной области техники (см., например, Hanley et al. 1982. Radiology 143: 29-36). Предпочтительно, ROC-кривые дают AUC более чем около 0,5, более предпочтительно, более чем около 0,7, еще более предпочтительно, более чем около 0,8, еще более предпочтительно, более чем около 0,85, и, наиболее предпочтительно, более чем около 0,9. Термин «около» в этом контексте относится к +/- 5% от заданного измерения.
Контрольной группой может являться здоровая популяция, например, без признаков и симптомов заболевания. В другом аспекте изобретения контрольная группа может представлять собой популяцию субъектов, страдающих заболеванием или расстройством, в частности, нетяжелыми заболеваниями, или подвергавшиеся вмешательствам в связи с ними (например, пластике паховой грыжи, ортопедической хирургии, бронхоскопии, гипербилирубинемии, тестом на апноэ во сне), или страдающих тяжелыми заболеваниями (например, дыхательная недостаточность, врожденная диафрагмальная грыжа, сердечная недостаточность, SIRS, сепсис, септический шок или другое тяжелое заболевание) без признаков и симптомов дисфункции почек или ухудшения почечной функции. Контрольная группа может состоять из более чем одного контрольного субъекта.
Горизонтальная ось кривой ROC представляет (1 -специфичность), которая увеличивается с увеличением частоты ложноположительных результатов. Вертикальная ось кривой представляет чувствительность, которая увеличивается с частотой истинных положительных результатов. Таким образом, для конкретного выбранного порога отсечки можно определить значение (1-специфичность) и получить соответствующую чувствительность. Площадь под ROC-кривой является мерой вероятности того, что измеренный уровень маркера позволит правильно идентифицировать заболевание или состояние. Таким образом, площадь под ROC-кривой можно использовать для определения эффективности теста.
Пороговые уровни могут быть дополнительно получены, например, из анализа Каплана-Мейера, где возникновение заболевания коррелирует с квартилями сердечно-сосудистых маркеров в популяции. Согласно этому анализу, субъекты с уровнями сердечно-сосудистых маркеров выше 75-го процентиля имеют значимо повышенный риск развития заболеваний по изобретению. Этот результат дополнительно подтверждается регрессионным анализом Кокса с полной поправкой на классические факторы риска: самый высокий квартиль по сравнению со всеми другими субъектами имеет высокую значимость ассоциации с повышенным риском заболевания по изобретению.
Другими предпочтительными пороговыми значениями являются, например, 90-й, 95-й или 99-й процентиль нормальной популяции. Посредством использования более высокого процентиля, чем 75-й процентиль, можно уменьшить количество идентифицированных ложноположительных субъектов, но можно пропустить идентификацию субъектов с умеренным, хотя и повышенным риском. Таким образом, можно принять пороговое значение в зависимости от того, считается ли более подходящим идентифицировать большинство субъектов, подверженных риску, за счет также выявления «ложноположительных результатов», или считается более подходящим идентифицировать в основном субъектов с высоким риском за счет пропуска нескольких субъектов с умеренным риском.
Например, значения 75-го процентиля, более предпочтительно, 90-го процентиля, еще более предпочтительно, 95-го процентиля, наиболее предпочтительно, 99-го процентиля, можно использовать для верхних пределов нормального диапазона.
Пороговый уровень может варьироваться в зависимости от различных физиологических параметров, таких как возраст, пол или субпопуляция, а также от средств, применяемых для определения проэнкефалина и его фрагментов, упомянутых в настоящем описании.
В конкретном варианте осуществления изобретения указанные пороговые уровни зависят от возраста. Как показано в примерах, значения для MR-PENK выявили использование более одного порогового значения в зависимости от возраста субъекта. Пороговые значения снижались с увеличением возраста испытуемых.
В одном из вариантов осуществления изобретения субъекты могут быть разделены на возрастные группы, и каждой из этих возрастных групп назначен определенный порог.
В одном из вариантов изобретения порог для проэнкефалина или его фрагментов у ребенка находится в диапазоне 150-1290 пмоль/л.
Порог для проэнкефалина или его фрагментов может быть сгруппирован для конкретных возрастных интервалов. В качестве альтернативы, непрерывные пороги могут быть применены для соответствующего возраста детей. Например, порог может быть установлен для детей в интервале возраста один год или ниже между 250 и 1000 пмоль/л, предпочтительно, между 400 и 650 пмоль/л.
В одном конкретном варианте осуществления уровень проэнкефалина или его фрагментов измеряют с помощью иммунологического анализа, и указанное связывающее вещество представляет собой антитело или фрагмент антитела, связывающийся с проэнкефалином или его фрагментами, состоящими, по меньшей мере, из 5 аминокислот.
В одном конкретном варианте осуществления применяемый анализ включал два связывающих вещества, которые связываются с двумя разными областями в пределах области проэнкефалина, которая представляет собой аминокислоты 133-140 (LKELLETG, SEQ ID No. 13) и аминокислоты 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID No. 14), где каждая из указанных областей включает, по меньшей мере, 4 или 5 аминокислот.
В одном из вариантов осуществления изобретения анализы для определения проэнкефалина или фрагментов в образце способны количественно определять проэнкефалин или фрагменты проэнкефалина здоровых детей, которые составляют <15 пмоль/л, предпочтительно, <10 пмоль/л и, наиболее предпочтительно, <6 пмоль/л.
Объектом настоящего изобретения является применение по меньшей мере одного связывающего вещества, которое связывается с областью аминокислотной последовательности пептида, выбранного из группы, включающей пептиды и фрагменты SEQ ID No. №1-12, в жидкости организма, полученной от указанного субъекта в способе для (а) диагностики или мониторинга функции почек у субъекта, или (b) диагностики дисфункции почек у субъекта, или (c) прогнозирования или мониторинга риска нежелательных явлений у заболевшего субъекта, где указанное нежелательное явление выбрано из группы, включающей ухудшение функции почек, включая почечную недостаточность, потерю функции почек и терминальную стадию заболевания почек, или смерть вследствие нарушения функции почек, включая почечную недостаточность, потерю функции почек и терминальную стадию заболевания почек, или (d) прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства, где указанный субъект является ребенком.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанное связывающее вещество выбирают из группы, включающей антитело, фрагмент антитела или не-Ig каркас, связывающийся с проэнкефалином или его фрагментами, состоящими, по меньшей мере, из 5 аминокислот. В конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с областью, имеющей последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12. В конкретном варианте осуществления указанное связывающее вещество не связывается с энкефалиновыми пептидами, Met-энкефалином (SEQ ID No. 3) и Leu-энкефалином (SEQ ID No. 4). В конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с областью, имеющей последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 8, 9, 10 и 11. В другом конкретном варианте осуществления указанное по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с областью, имеющей последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 8 и 9. В другом конкретном варианте осуществления указанное связывающее вещество связывается с проэнкефалином 119-159, среднерегиональным фрагментом проэнкефалина, MR-PENK (SEQ ID No. 6).
В более конкретном варианте осуществления по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с областью в пределах аминокислотной последовательности проэнкефалина 119-159, среднерегиональным фрагментом проэнкефалина, MR-PENK (SEQ ID No. 6) в полученной жидкости организма от указанного субъекта, более конкретно, с аминокислотами 133-140 (LKELLETG, SEQ ID No. 13) и/или аминокислотами 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID No. 14), где каждая из указанных областей содержит, по меньшей мере, 4 или 5 аминокислот.
Таким образом, в соответствии с представленными способами определяют уровень иммунореактивности вышеуказанного связывающего вещества в жидкости организма, полученной от указанного субъекта. Уровень иммунореактивности означает концентрацию аналита, определяемую количественно, полуколичественно или качественно по реакции связывания связывающего вещества с таким аналитом, где, предпочтительно, связывающее вещество имеет константу аффинности для связывания с аналитом, составляющую, по меньшей мере, 108 М-1, и связывающее вещество может представлять собой антитело или фрагмент антитела, или каркас, отличный от Ig, а реакция связывания представляет собой иммуноанализ.
Представленные способы с применением PENK и его фрагментов, особенно MR-PENK, намного превосходят способы и биомаркеры, применяемые в соответствии с предшествующим уровнем техники для (а) диагностики или мониторинга функции почек у субъекта или (b) диагностики дисфункции почек у субъекта или (c) прогнозирования или мониторинга риска нежелательного явления у заболевшего субъекта, где указанное нежелательное явление выбрано из группы, включающей ухудшение функции почек, включая почечную недостаточность, потерю функции почек и терминальную стадию заболевания почек, или смерть вследствие дисфункции почек, включая почечную недостаточность, потерю функции почек и терминальную стадию заболевания почек, или (d) прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства.
Объектом настоящего изобретения также является способ (а) диагностики или мониторинга функции почек у субъекта, или (b) диагностики дисфункции почек у субъекта, или (c) прогнозирования или мониторинга риска нежелательных явлений у заболевшего субъекта, где указанное нежелательное явление выбрано из группы, включающей ухудшение функции почек, включая почечную недостаточность, потерю функции почек и терминальную стадию заболевания почек, или смерть вследствие нарушения функции почек, включая почечную недостаточность, потерю функции почек и терминальную стадию заболевания почек, или (d) прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства, поддерживающего или заменяющего функцию почек, включающего различные способы заместительной почечной терапии, включая, помимо прочего, гемодиализ, перитонеальный диализ, гемофильтрацию и трансплантацию почки в соответствии с любым из предыдущих вариантов осуществления, где уровень проэнкефалина или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот в жидкости организма, полученной от указанного субъекта, используется по отдельности, либо в сочетании с другими прогностически полезными лабораторными или клиническими параметрами, которые могут быть выбраны из следующих альтернатив:
- сравнение с медианой уровня проэнкефалина или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот в жидкости организма, полученной от указанного субъекта в совокупности предварительно определенных образцов в популяции «здоровых» или «очевидно здоровых» субъектов,
- сравнение с квантилем уровня проэнкефалина или его фрагментов, содержащих по меньшей мере 5 аминокислот, в жидкости организма, полученной от указанного субъекта в совокупности предварительно определенных образцов в популяции «здоровых» или «очевидно здоровых» субъектов,
- вычисление на основе анализа пропорциональных рисков Кокса или с использованием расчетов индекса риска, таких как NRI (остаточный индекс реклассификации) или IDI (интегрированный индекс дискриминации),
где указанный субъект является ребенком.
Указанный дополнительно по меньшей мере один клинический параметр, который может быть определен, выбирают из группы, включающей: бета-следовой белок (BTP), цистатин C, KIM-1, TIMP-2, IGFBP-7, азот мочевины крови (BUN), NGAL, клиренс креатинина, сывороточный креатинин (SCr), показатель риска летального исхода в педиатрии III [PRISM-III] для мочевины, показатель педиатрического индекса летальности 2 [PIM-II] и показатель Apache.
В одном из вариантов осуществления изобретения указанный способ выполняют более одного раза для мониторинга функции, дисфункции или риска указанного субъекта или для мониторинга курса лечения почек и/или заболевания. В одном конкретном варианте осуществления указанный мониторинг проводят для оценки реакции указанного субъекта на предпринятые профилактические и/или терапевтические меры.
В одном из вариантов осуществления изобретения способ применяют для стратификации указанных субъектов по группам риска.
Объектом изобретения также является анализ для определения проэнкефалина и фрагментов проэнкефалина в образце, содержащем два связывающих вещества, которые связываются с двумя разными областями в пределах области проэнкефалина, которая представляет собой аминокислоты 133-140 (LKELLETG, SEQ ID No. 13) и аминокислоты 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID No. 14), где каждая из указанных областей содержит, по меньшей мере, 4 или 5 аминокислот.
В одном из вариантов осуществления изобретения это может быть так называемый POC-тест (point-of-care, у постели больного), то есть, технология тестирования, которая позволяет проводить тест менее чем за 1 час рядом с пациентом без необходимости использования полностью автоматизированной системы анализа. Одним из примеров этой технологии является технология иммунохроматографического тестирования.
В одном из вариантов осуществления изобретения такой анализ представляет собой сэндвич-иммуноанализ с использованием любой технологии обнаружения, включая, но не ограничиваясь указанным, ферментную метку, хемилюминесцентную метку, электрохемилюминесцентную метку, предпочтительно, полностью автоматизированный анализ. В одном из вариантов осуществления изобретения такой анализ представляет собой сэндвич-анализ с меченым ферментом. Примеры автоматизированного или полностью автоматизированного анализа включают анализы, которые можно использовать для одной из следующих систем: Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptor®, Biomerieux Vidas®, Alere Triage®.
Известны различные иммунологические анализы, которые могут быть применены в анализах и способах по настоящему изобретению, и они включают: радиоиммуноанализ («RIA»), гомогенный иммуноферментный анализ («EMIT»), твердофазный иммуноферментный анализ («ELISA»), иммуноанализ реактивации апоферментов («ARIS»), иммуноанализы с полосками и иммунохроматографические анализы.
В одном из вариантов осуществления изобретения по меньшей мере одно из двух указанных связывающих веществ метят для того, чтобы его можно было обнаружить.
Предпочтительные способы обнаружения включают иммунологические анализы в различных форматах, таких как, например, радиоиммунный анализ (RIA), хемилюминесцентный и флуоресцентный иммуноанализы, иммуноферментные анализы (ELISA), массивы шариков на основе Luminex, анализ белковых микрочипов и форматы экспресс-тестов, такие как, например, иммунохроматографические стрип-тесты.
В предпочтительном варианте осуществления указанная метка выбрана из группы, включающей хемилюминесцентную метку, ферментную метку, флуоресцентную метку, радиойодную метку.
Анализы могут быть гомогенными или гетерогенными, конкурентными и неконкурентными. В одном из вариантов осуществления анализ представляет собой сэндвич-анализ, который представляет собой неконкурентный иммуноанализ, в котором молекула, подлежащая обнаружению и/или количественному определению, связана с первым антителом и со вторым антителом. Первое антитело может быть связано с твердой фазой, например, шариком, поверхностью лунки или другого контейнера, чипом или полоской, а второе антитело представляет собой антитело, которое помечено, например, красителем, радиоизотопом, или реакционно способной или каталитически активной молекулой. Затем соответствующим способом измеряют количество меченого антитела, связанного с аналитом. Общий состав и процедуры, связанные с «сэндвич-тестами», являются общепринятыми и известны специалистам в данной области техники.
В другом варианте осуществления анализ включает две захватывающие молекулы, предпочтительно, антитела, обе из которых присутствуют в форме дисперсий в жидкой реакционной смеси, где первый метящий компонент присоединен к первой захватывающей молекуле, при этом указанный первый метящий компонент является частью системы мечения, основанной на гашении или усилении флуоресценции или хемилюминесценции, а второй метящий компонент указанной системы мечения присоединяют ко второй захватывающей молекуле, так что при связывании обеих захватывающих молекул с аналитом генерируется измеримый сигнал, который позволяет обнаруживать образованные сэндвич-комплексы в растворе, содержащем образец.
В другом варианте осуществления указанная система мечения включает криптаты редкоземельных элементов или хелаты редкоземельных элементов в сочетании с флуоресцентным красителем или хемилюминесцентным красителем, в частности, с красителем цианинового типа.
В контексте настоящего изобретения анализы на основе флуоресценции включали использование красителей, которые могут быть, например, выбраны из группы, включающей FAM (5- или 6-карбоксифлуоресцеин), VIC, NED, флуоресцеин, флуоресцеин-изотиоцианат (FITC), IRD-700/800, цианиновые красители, такие как CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, Cy7, ксантен, 6-карбокси-2', 4', 7', 4,7-гексахлорфлуоресцеин (HEX), ТЕТ, 6-карбокси-4', 5'-дихлор-2', 7'-диметодиплуоресцеин (JOE), N, N,N',N'-тетраметил-6-карбоксиродамин (TAMRA), 6-карбокси-X-родамин (ROX), 5-карбоксиродамин-6G (R6G5), 6-карбоксиродамин-6G (RG6), родамин, родамин зеленый, родамин красный, родамин 110, красители BODIPY, такие как BODIPY TMR, Oregon Green, кумарины, такие как умбеллиферон, бензимиды, такие как Hoechst 33258, фенантридины, такие как техасский красный, якима желтый, Alexa Fluor, PET, этидийбромид, акридиновые красители, карбазоловые красители, феноксазиновые красители, порфириновые красители, полиметиновые красители и т.п.
В контексте настоящего изобретения анализы на основе хемилюминесценции включали использование красителей, основанных на физических принципах, описанных для хемилюминесцентных материалов в (Kirk-Othmer, Encyclopedia of Chemical Technology, 4-е изд., ответственный редактор JI Kroschwitz; редактор M. Howe-Grant, John Wiley & Sons, 1993, т. 15, стр. 518-562, включенные в настоящее описание посредством ссылки, включая ссылки на стр. 551-562). Хемилюминесцентная метка может представлять собой метку на основе сложного эфира акридиния, стероидную метку, включающую изолюминоловые метки и т.п. Предпочтительными хемилюминесцентными красителями являются сложные эфиры акридиния.
Как упоминалось в настоящем описании, «анализ» или «диагностический анализ» может относиться к любому типу, применяемому в области диагностики. Такой анализ может быть основан на связывании определяемого аналита с одним или более зондами захвата с определенной аффинностью. Что касается взаимодействия между захватывающими молекулами и молекулами-мишенями или представляющими интерес молекулами, константа сродства предпочтительно превышает 108 М-1.
В контексте настоящего изобретения «связывающие молекулы» представляют собой молекулы, которые могут быть использованы для связывания молекул-мишеней или молекул, представляющих интерес, т.е. аналитов (т.е., в контексте настоящего изобретения, PENK и его фрагменты) из образца. Таким образом, молекулы связывающего вещества должны иметь адекватную форму как в пространственном отношении, так и с точки зрения свойств поверхности, таких как поверхностный заряд, гидрофобность, гидрофильность, наличие или отсутствие доноров и/или акцепторов Льюиса, для специфического связывания молекул-мишеней или молекул, представляющих интерес. Таким образом, связывание, например, может быть опосредовано взаимодействиями на основе ионных, ван-дер-Ваальсовых, пи-пи, сигма-пи, гидрофобных или водородных связей, или комбинации двух или более из указанных выше взаимодействий между молекулами захвата и молекулами-мишенями или молекулами, представляющими интерес. В контексте настоящего изобретения, связывающие молекулы могут быть, например, выбраны из группы, включающей молекулу нуклеиновой кислоты, молекулу углевода, молекулу пептиднуклеиновой кислоты, белок, антитело, пептид или гликопротеин. Предпочтительно, молекулы связывающего вещества представляют собой антитела, в том числе их фрагменты с достаточной аффинностью к мишени или молекуле, представляющей интерес, и в том числе рекомбинантные антитела или фрагменты рекомбинантных антител, а также химически и/или биохимически модифицированные производные указанных антител или фрагментов, полученные из цепи варианта с длиной, составляющей по меньшей мере 12 аминокислот указанных антител или фрагментов.
Хемилюминесцентная метка может представлять собой метку на основе сложного эфира акридиния, стероидную метку, включающую изолюминоловые метки и т.п.
Ферментные метки могут представлять собой лактатдегидрогеназу (LDH), креатинкиназу (CPK), щелочную фосфатазу, аспартатаминотрансферазу (AST), аланинаминотрансферазу (ALT), кислую фосфатазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу, пероксидазу хрена (HRP) и т. д.
В одном из вариантов осуществления изобретения по меньшей мере одно из указанных двух связывающих веществ связано с твердой фазой в форме магнитных частиц и полистирольных поверхностей.
В одном из вариантов анализов для определения проэнкефалина или фрагментов проэнкефалина в образце по настоящему изобретению такой анализ представляет собой сэндвич-анализ, предпочтительно, полностью автоматизированный анализ. Это может быть полностью автоматизированный или выполняемый вручную ИФА-анализ. Это может быть так называемый POC-тест (point-of-care, у постели больного). Примеры автоматизированного или полностью автоматизированного анализа включают анализы, которые можно использовать для одной из следующих систем: Roche Elecsys®, Abbott Architect®, Siemens Centauer®, Brahms Kryptor®, Biomerieux Vidas®, Alere Triage®, Ortho Vitros®. Примеры форматов тестов приведены выше.
В одном из вариантов анализов для определения проэнкефалина или фрагментов проэнкефалина в образце по настоящему изобретению по меньшей мере одно из указанных двух связывающих веществ метят для того, чтобы его можно было обнаружить. Примеры меток приведены выше.
В одном из вариантов анализов для определения проэнкефалина или фрагментов проэнкефалина в образце по настоящему изобретению по меньшей мере одно из указанных двух связывающих веществ связано с твердой фазой. Примеры твердых фаз приведены выше.
В одном из вариантов анализов для определения проэнкефалина или фрагментов проэнкефалина в образце по настоящему изобретению указанная метка выбрана из группы, включающей хемилюминесцентную метку, ферментную метку, флуоресцентную метку, радиойодную метку. Еще одним объектом настоящего изобретения является набор, включающий анализ согласно настоящему изобретению, в котором компоненты указанного анализа могут находиться в одном или более контейнерах.
В одном из вариантов осуществления объектом настоящего изобретения является устройство формата «у постели больного» для выполнения способа согласно изобретению, при этом указанное устройство формата «у постели больного» включает по меньшей мере одно антитело или фрагмент антитела, направленный на аминокислоты 133-140. (LKELLETG, SEQ ID No. 13) или аминокислоты 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID No. 14), где каждая из указанных областей содержит, по меньшей мере, 4 или 5 аминокислот.
В одном из вариантов осуществления объектом настоящего изобретения является устройство формата «у постели больного» для осуществления способа согласно изобретению, при этом указанное устройство формата «у постели больного» включает по меньшей мере два антитела или фрагмента антитела, направленные на аминокислоты 133-140 (LKELLETG, SEQ ID No. 13) и аминокислоты 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID No. 14), где каждая из указанных областей содержит, по меньшей мере, 4 или 5 аминокислот.
В одном из вариантов осуществления объектом настоящего изобретения является набор для осуществления способа согласно изобретению, где указанное устройство формата «у постели больного» включает по меньшей мере одно антитело или фрагмент антитела, направленный на аминокислоты 133-140 (LKELLETG, SEQ ID No. 13) или аминокислоты 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID No. 14), где каждая из указанных областей содержит, по меньшей мере, 4 или 5 аминокислот.
В одном из вариантов осуществления объектом настоящего изобретения является набор для осуществления способа согласно изобретению, в котором указанное устройство формата «у постели больного» включает по меньшей мере два антитела или фрагмента антител, направленные на аминокислоты 133-140 (LKELLETG, SEQ ID No. 13) и аминокислоты 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID No. 14), где каждая из указанных областей содержит, по меньшей мере, 4 или 5 аминокислот.
В вышеприведенном контексте следующие последовательно пронумерованные варианты осуществления обеспечивают дополнительные конкретные аспекты изобретения:
1. Способ (а) диагностики или мониторинга функции почек у субъекта, или (b) диагностики дисфункции почек у субъекта, или (c) прогнозирования или мониторинга риска нежелательного явления у заболевшего субъекта, где указанное нежелательное явление выбрано из группы, включающей ухудшение функции почек, включая почечную недостаточность, потерю функции почек и терминальную стадию заболевания почек, или смерть вследствие нарушения функции почек, включая почечную недостаточность, потерю функции почек и терминальную стадию заболевания почек, или (d) прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства, включающий в себя
определение уровня проэнкефалина или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот в жидкости организма, полученной от указанного субъекта; и
соотнесение указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с функцией почек у субъекта или
соотнесение указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с дисфункцией почек, при этом повышенный уровень выше определенного порога является прогностическим или диагностическим признаком дисфункции почек у указанного субъекта, или
соотнесение указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с указанным риском нежелательного явления у заболевшего субъекта, где повышенный уровень выше определенного порога является прогностическим фактором повышенного риска указанных нежелательных явлений, или
соотнесение указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с успехом терапии или вмешательства у заболевшего субъекта, где уровень ниже определенного порога является прогностическим фактором успеха терапии или вмешательства, при этом указанная терапия или вмешательство может представлять собой заместительную почечную терапию или может представлять собой лечение гиалуроновой кислотой у пациентов, перенесших заместительную почечную терапию, или прогнозирование или мониторинг успеха терапии или вмешательства может представлять собой прогнозирование или мониторинг восстановления функции почек у пациентов с нарушением функции почек до и после заместительной почечной терапии и/или фармацевтических вмешательств,
где указанный проэнкефалин или его фрагмент выбраны из группы, включающей SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10 и SEQ ID No. 11,
при этом указанный порог находится в диапазоне 150-1290 пмоль/л,
и при этом указанный субъект является ребенком.
2. Способ диагностики или мониторинга функции почек у субъекта, включающий в себя:
определение уровня проэнкефалина или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот в жидкости организма, полученной от указанного субъекта; и
при этом во время последующего измерения относительное изменение уровня проэнкефалина и его фрагментов, которое является снижением, коррелирует с улучшением функции почек у субъекта, или
при этом во время последующего измерения относительное изменение проэнкефалина и его фрагмента, которое является повышением, коррелирует с ухудшением функции почек у субъекта,
где указанный проэнкефалин или его фрагмент выбран из группы, включающей SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10 и SEQ ID No. 11; и
при этом указанное определение проэнкефалина или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот проводят более одного раза у одного пациента,
где субъектом является ребенок.
3. Способ в соответствии с вариантами осуществления 1 и 2, где указанный субъект представляет собой ребенка в возрасте 18 лет или младше, более предпочтительно, в возрасте 14 лет или младше, еще более предпочтительно, в возрасте 12 лет или младше, еще более предпочтительно, в возрасте 8 лет или младше, еще более предпочтительно, в возрасте 5 лет или младше, еще более предпочтительно, в возрасте 2 лет или младше, наиболее предпочтительно, в возрасте одного года или младше.
4. Способ в соответствии с вариантами осуществления 1-3, в котором указанный ребенок является тяжелобольным.
5. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-4, включающий в себя
определение уровня иммунореактивного аналита с использованием по меньшей мере одного связывающего вещества, которое связывается с областью аминокислотной последовательности проэнкефалина (PENK) или его фрагментов в жидкости организма, полученной от указанного субъекта; и
соотнесение указанного уровня иммунореактивного аналита с функцией почек у субъекта или
соотнесение указанного уровня иммунореактивного аналита с дисфункцией почек, при этом повышенный уровень выше определенного порога является прогностическим или диагностическим признаком дисфункции почек у указанного субъекта, или
соотнесение указанного уровня иммунореактивного аналита с указанным риском нежелательного явления у заболевшего субъекта, где повышенный уровень выше определенного порога является прогностическим фактором повышенного риска указанных нежелательных явлений или
соотнесение указанного уровня иммунореактивного аналита с успехом терапии или вмешательства у заболевшего субъекта, где уровень ниже определенного порога является прогностическим фактором успеха терапии или вмешательства.
6. Способ по любому из вариантов осуществления 1-5, в котором указанное по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с областью в пределах аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 8, 9, 10 и 11, предпочтительно, указанное по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с областью, имеющей последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 8 и 9, предпочтительно, указанное по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с SEQ ID No. №6.
7. Способ по любому из предшествующих вариантов осуществления, в котором уровень проэнкефалина измеряют с помощью иммунологического анализа, а указанное связывающее вещество представляет собой антитело или фрагмент антитела, связывающийся с проэнкефалином или его фрагментами, состоящими, по меньшей мере, из 5 аминокислот.
8. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-7, в котором применяют анализ, включающий два связывающих вещества, которые связываются с двумя разными областями в пределах области проэнкефалина, которая представляет собой аминокислоты 133-140 (LKELLETG, SEQ ID No. 13) и аминокислоты 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID No. 14), где каждая из указанных областей содержит, по меньшей мере, 4 или 5 аминокислот.
9. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-8, в котором анализ применяют для определения уровня проэнкефалина или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот, и где чувствительность указанного анализа позволяет количественно определить проэнкефалин или фрагменты проэнкефалина у здоровых субъектов и составляет <15 пмоль/л.
10. Способ согласно любому из вариантов осуществления 1-9, в котором указанная жидкость организма может быть выбрана из группы, включающей цельную кровь, сыворотку, плазму, мочу, спинномозговую жидкость (CSF) и слюну.
11. Способ по вариантам осуществления 1-10, в котором дополнительно определяют по меньшей мере один клинический параметр, выбранный из группы, включающей: бета-следовой белок (ВТР), цистатин С, KIM-1, TIMP-2, IGFBP-7, азот мочевины крови (BUN), NGAL, клиренс креатинина, креатинин сыворотки (SCr), мочевину, оценку риска летального исхода в педиатрии III [PRISM-III], оценку педиатрического индекса летальности 2 [PIM-II] и оценку Apache.
12. Способ по любому из вариантов осуществления 1-11, в котором указанное определение проэнкефалина или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот проводят более одного раза у одного пациента.
13. Способ по любому из вариантов осуществления 1-12, в котором указанный мониторинг проводят для оценки реакции указанного субъекта на предпринятые профилактические и/или терапевтические меры.
14. Способ по любому из вариантов осуществления 1-13 для стратификации указанных субъектов по группам риска.
15. Устройство формата «у постели больного» для осуществления способа в соответствии с любым из вариантов осуществления 1-14, где указанное устройство формата «у постели больного» включает по меньшей мере два антитела или фрагмента антител, направленных на аминокислоты 133-140 (LKELLETG, SEQ ID No. 13) и аминокислоты 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID No. 14).
16. Набор для осуществления способа по любому из вариантов осуществления 1-15, где указанный набор содержит по меньшей мере два антитела или фрагмента антител, направленных на аминокислоты 133-140 (LKELLETG, SEQ ID No. 13) и аминокислоты 152-159.
(SDNEEEVS, SEQ ID No. 14).
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Разработка антител
Пептиды
Пептиды были синтезированы (JPT Technologies, Берлин, Германия).
Пептиды/конъюгаты для иммунизации:
Пептиды для иммунизации (таблица 3) были синтезированы (JPT Technologies, Берлин, Германия) с дополнительным N-концевым остатком цистеина для конъюгации пептидов с бычьим сывороточным альбумином (BSA). Пептиды были ковалентно связаны с BSA с использованием Sulfo-SMCC (Perbio Science, Бонн, Германия). Процедура соединения проводилась в соответствии с руководством Perbio.
Таблица 3: названия пептидов для иммунизации и антител
Антитела были получены в соответствии со следующим способом:
Мышь BALB/c была иммунизирована 100 мкг конъюгата пептид-BSA на 0 и 14 день (эмульгированного в 100 мкл полного адъюванта Фрейнда) и 50 мкг на 21 и 28 день (в 100 мкл неполного адъюванта Фрейнда). За три дня до проведения эксперимента по слиянию животному вводили 50 мкг конъюгата, растворенного в 100 мкл физиологического раствора, в форме одной внутрибрюшинной и одной внутривенной инъекции.
Спленоциты иммунизированной мыши и клетки миеломной клеточной линии SP2/0 сливали с 1 мл 50% полиэтиленгликоля в течение 30 с при 37°С. После промывки клетки высевали в 96-луночные планшеты для культивирования клеток. Гибридные клоны отбирали путем выращивания в среде HAT [питательная среда RPMI 1640 с добавлением 20% фетальной телячьей сыворотки и добавки HAT]. Через две недели среду HAT заменяли средой HT на три пассажа с последующим возвратом к нормальной среде для культивирования клеток.
Супернатанты клеточных культур подвергали первичному скринингу на антиген-специфические антитела IgG через три недели после слияния. Положительные протестированные микрокультуры переносили в 24-луночные планшеты для размножения. После повторного тестирования отобранные культуры клонировали и повторно клонировали с использованием метода лимитирующих разведений и определяли изотипы.
(Lane, RD 1985 J. Immunol. Meth. 81: 223-228; Ziegler, B. et al. 1996. Horm. Metab. Res. 28: 11-15).
Продуцирование моноклональных антител
Антитела получали стандартными способами получения антител (Marx et al. 1997. ATLA 25, 121) и очищали с помощью хроматографии с белком А. Чистота антител составляла >95% на основании анализа гель-электрофореза с SDS.
Мечение и покрытие антител
Все антитела метили сложным эфиром акридиния в соответствии со следующей процедурой:
Меченое соединение (индикатор): 100 мкг (100 мкл) антитела (1 мг/мл в PBS, pH 7,4) смешивали с 10 мкл NHS-эфира акридиния (1 мг/мл в ацетонитриле, InVent GmbH, Германия) (ЕР 0353971) и инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре. Меченое антитело очищали посредством гель-фильтрационной HPLC (ВЭЖХ) на Bio-Sil SEC 400-5 (Bio-Rad Laboratories, Inc., США). Очищенное меченое антитело разводили в (300 ммоль/л фосфата калия, 100 ммоль/л NaCl, 10 ммоль/л Na-EDTA, 5 г/л бычьего сывороточного альбумина, рН 7,0). Конечная концентрация составляла приблизит. 800000 относительных световых единиц (RLU) меченого соединения (примерно 20 нг меченого антитела) на 200 мкл. Хемилюминесценцию эфира акридиния измеряли с использованием AutoLumat LB 953 (Berthold Technologies GmbH & Co. KG).
Твердофазное антитело (покрытое антитело): полистироловые пробирки (Greiner Bio-One International AG, Австрия) покрывали (18 ч при комнатной температуре) антителом (1,5 мкг антитела/0,3 мл 100 ммоль/л NaCl, 50 ммоль/л Трис/ HCl, рН 7,8). После блокирования 5% бычьим сывороточным альбумином пробирки промывали PBS, pH 7,4, и подвергали вакуумной сушке.
Специфичность антител
Перекрестную реактивность антител определяли следующим образом: 1 мкг пептида в 300 мкл PBS, pH 7,4 пипеткой вносили в полистироловые пробирки и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. После инкубации пробирки промывали 5 раз (каждый по 1 мл) 5% BSA в PBS, рН 7,4. Добавляли каждое из меченых антител (300 мкл в PBS, pH 7,4, 800000 RLU/300 мкл) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. После пятикратного промывания (каждый раз 1 мл промывочного раствора 20 ммоль/мл PBS, pH 7,4, 0,1% Triton X 100), остаточную люминесценцию (меченое антитело) определяли количественно с помощью AutoLumat Luminometer 953. В качестве контрольного вещества использовали синтетический пептид MR-PENK (100%).
Перекрестная реактивность различных антител указана в таблице 4.
Таблица 4: Перекрестная реактивность различных PENK-антител
Все антитела связывали пептид MR-PENK сравнимо с пептидами, которые использовали для иммунизации. За исключением NT-MR-PENK-антитела (10% перекрестной реакции с EEDDSLANSSDLLK), ни одно антитело не показало перекрестной реакции с фрагментами MR-PENK, не использованными для иммунизации индивидуальным антителом.
Иммуноанализ на проэнкефалин:
50 мкл образца (или калибратора) пипетировали в пробирки с покрытием, после добавления меченого антитела (200 мкл) пробирки инкубировали 2 ч при 18-25°С. Несвязавшийся индикатор удаляли посредством пятикратной промывки (каждая по 1 мл) промывочным раствором (20 ммоль/л PBS, pH 7,4, 0,1% Triton X 100). Меченое антитело, связанное с пробиркой, измеряли с помощью Luminometer 953. Использовали фиксированную концентрацию 1000 пмоль/MR-PENK. Отношение сигнала (RLU при 1000 пмоль MR-PENK/л) к шуму (RLU без MR-PENK) для различных комбинаций антител приведено в таблице 5. Все антитела были способны образовывать сэндвич-комплекс с любым другим антителом. Неожиданно, самое лучшее отношение сигнал/шум (наилучшая чувствительность) было получено при объединении антител MR-MR-PENK и CT-MR-PENK. Впоследствии мы использовали эту комбинацию антител для проведения MR-PENK-иммуноанализа для дальнейших исследований. Антитело MR-MR-PENK использовали в качестве антитела в пробирке с покрытием, а антитело CT-MR-PENK использовали в качестве меченого антитела.
Таблица 5: Отношение сигнал-шум для различных комбинаций антител
Калибровка:
Анализ был откалиброван с использованием разведений синтетического MR-PENK, разведенного в 20 мМ K2PO4, 6 мМ EDTA, 0,5% BSA, 50 мкМ амастатина, 100 мкМ лейпептина, рН 8,0. На фигуре 1 показана типичная кривая доза/сигнал проэнкефалина. Чувствительность анализа составила 20 определений нуля калибратора (без добавления MR-PENK) + 2SD) 5,5 пмоль/л.
Пример 2:
Контрольные значения и эффективность проэнкефалина А 119-159 в качестве биомаркера острого повреждения почек у детей в возрасте до одного года.
Введение:
Острое повреждение почек (AKI) часто встречается у госпитализированных детей, при этом распространенность в педиатрическом отделении и педиатрическом отделении интенсивной терапии (PICU) находится в пределах 5-51%1-3. AKI независимо связано с заболеваемостью и смертностью, что частично связано с накоплением (токсичных) растворенных веществ в плазме, в том выводимых почками лекарственных препаратов4-6.
В большинстве отделений интенсивной терапии AKI диагностируется с использованием концентрации креатинина в сыворотке (SCr) в качестве суррогатного маркера скорости клубочковой фильтрации (GFR). Хотя SCr обеспечивает недорогую, минимально инвазивную и быструю оценку GFR, он имеет несколько недостатков в качестве биомаркера GFR у детей раннего возраста: он показывает отсроченное повышение GFR после AKI, может завышать GFR из-за канальцевой секреции, продукция зависит от мышечной массы и отражает материнскую GFR в первые дни жизни вследствие трансплацентарной передачи7-10.
Другие биомаркеры, такие как цистатин C (CysC) и бета-следовой белок (BTP), точно оценивают GFR как функциональные маркеры11-13. CysC позволяет выявить AKI у пациентов в критическом состоянии на два дня раньше, чем SCr14, но на концентрацию влияет воспаление и возраст15,16. BTP в меньшей степени зависит от возраста, расы или пола, но является менее точным, чем другие биомаркеры11,17. В дополнение к этим функциональным биомаркерам для быстрого выявления AKI были предложены мочевые биомаркеры повреждения канальцев, такие как липокалин, ассоциированный с желатиназой нейтрофилов (NGAL), и молекула повреждения почек-1 (KIM-1), но на обе из них влияет несколько патофизиологических факторов14,15,18. Следовательно, все эти биомаркеры имеют ограничения для использования в качестве точных, эндогенных и надежных биомаркеров для диагностики AKI.
Проэнкефалин А 119-159 (PENK) представляет собой эндогенный мономерный пептид, отщепляемый от препроэнкефалина А вместе с энкефалиновыми пептидами19. Энкефалины связываются с опиоидными рецепторами и вырабатываются в центральной нервной системе, почках, мышцах, легких, кишечнике и сердце20. Поскольку почки обладают наибольшей плотностью опиоидных рецепторов, энкефалины участвуют в регуляции функции почек21. Кроме того, PENK обладает несколькими характеристиками идеального биомаркера GFR: он является эндогенным, свободно фильтруется клубочками вследствие своего небольшого молекулярного размера (4,5 кДа), не имеет известной тубулярной обработки или внепочечного клиренса, не связывается с белками плазмы и демонстрирует стабильное продуцирование при различных состояниях заболевания, независимо от воспаления и других непочечных факторов22.
На сегодняшний день исследования PENK у здоровых и больных взрослых подтверждают, что PENK является маркером функции почек; PENK является ранним индикатором AKI, независимо предсказывает ухудшение функции почек в будущем и показывает высокую корреляцию с предполагаемой и измеренной GFR после операции на сердце и у пациентов с сепсисом22-32.
В настоящее время данные по PENK для детей отсутствуют. В педиатрической популяции исследования биомаркеров должны быть сосредоточены на определении контрольных значений с поправкой на возраст33, поскольку функция почек у детей быстро меняется, особенно в первый год жизни9. Поэтому важно знать влияние возраста на концентрацию PENK. Целью данного исследования является определение контрольных значений PENK у здоровых детей в возрасте от 0 до 1 года, выявление изменений концентрации PENK при AKI у тяжелобольных детей и сравнение PENK с другими биомаркерами плазмы для GFR и AKI.
Материалы и методы
Обзор
Это проспективное когортное исследование является частью исследовательского проекта биомаркеров AKI у тяжелобольных детей (фонд научных исследований Софии, грант № 633)34-37. Основная цель проекта состоит в установлении контрольных значений биомаркеров AKI у здоровых детей в возрасте от 0 до 1 года и определении их прогностических возможностей для AKI у тяжелобольных детей.
Условия
В исследование были включены здоровые, доношенные дети без (пред)почечной патологии и дети в критическом состоянии, находящиеся на искусственной вентиляции легких в возрасте от 0 до 1 года. Были исключены пациенты с ранее существовавшим заболеванием почек, быстро ожидаемой смертью или лечением ECMO. Подробную информацию о критериях включения и исключения, собранных данных о пациентах, сборе и анализе образцов можно найти в предыдущих публикациях. Исследование было одобрено Советом по медицинской этике Erasmus MC. Отсроченное информированное согласие было получено от родителей и/или опекунов всех субъектов исследования.
Клинические данные пациентов
Демографические параметры (пол, диагноз, постнатальный возраст, этническая принадлежность, вес) были собраны для каждого субъекта. Кроме того, были собраны данные о внутриутробном возрасте, массе тела при рождении, тяжести заболевания (оценка риска летального исхода в педиатрии [PRISM-III] и оценка педиатрического индекса летальности [PIM-II]), искусственной вентиляции легких, вазопрессорной терапии, продолжительности пребывания в стационаре и смертности были собраны для тяжелобольных пациентов.
Сбор и анализ образцов
Образцы крови были получены из постоянного внутриартериального катетера или путем капиллярной или венозной пункции. У здоровых детей было получено не менее 1 образца до хирургического вмешательства или других медицинских процедур. У пациентов в критическом состоянии были получены множественные образцы крови в течение 7 дней после включения. Образцы плазмы измеряли в отношении SCr (ферментативный анализ), CysC (иммуноанализ) и BTP (анализ белка) в предшествующих исследованиях34-36. PENK измеряли с использованием коммерчески доступного двойного моноклонального сэндвич-иммуноанализа (sphingotec GmbH, Hennigsdorf, Germany)38.
Диагностика AKI
Здоровые дети рассматривались как не имеющие AKI, что контролировалось по z-значениям SCr с поправкой на возраст, адаптированным из литературы9. Z-значения SCr от -2 до +2 считались нормальными, пациенты с z-значениями за пределами этого диапазона были исключены.
Пациенты в критическом состоянии были разделены на две подгруппы (с AKI и без AKI) в соответствии с их наивысшим баллом по шкале RIFLE, полученным в течение 48 часов после интубации39, на основе контрольных значений SCr9 с поправкой на возраст9. Пациенты с увеличением SCr <150% были определены как не имеющие AKI, тогда как пациенты с увеличением 150-200%, 200-300% и >300% были отнесены к категориям риска, повреждения или отказа, соответственно39. Пациенты без образца плазмы достаточного объема для анализа PENK или без образца в течение 48 часов после интубации были исключены. Кроме того, поскольку функция почек может изменяться во время госпитализации, для динамического учета функции почек у тяжелобольных пациентов был проведен анализ смешанной модели и кривой соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов (ROC) с использованием балла RIFLE во время забора крови.
Статистический анализ
Непрерывные данные представлены в виде средних или медианных значений с 95% значениями доверительных интервалов (CI, ДИ) или межквартильными диапазонами (IQR), в зависимости от их характера распределения. Категориальные переменные представлены в виде дробей с процентами (%).
Контрольные значения PENK были рассчитаны у здоровых детей с использованием пакета обобщенных аддитивных моделей для для местоположения, масштаба и формы (GAMLSS) в R40. Значения информационного критерия Акаике (AIC) использовали для определения оптимальной модели для этих контрольных значений и для выявления возрастных закономерностей концентраций PENK. Эти контрольные значения были преобразованы в z-значения, соответствующие нормальному распределению, которые впоследствии использовали для анализа смешанной модели в когорте тяжелобольных.
Для тяжелобольных детей исходные и клинические характеристики сравнивались между подгруппами AKI и без AKI с использованием U-критерия Манна-Уитни для непрерывных переменных и критерия хи-квадрат Пирсона для категориальных переменных. Категориальные данные с несколькими категориями сравнивали с использованием теста Крускала-Уоллиса с апостериорным тестом Данна с p-значениями с поправкой Бонферрони, для оценки различий между категориями.
Анализ смешанной модели
У тяжелобольных пациентов было взято различное количество образцов с концентрацией PENK. Таким образом, анализ линейной смешанной модели был использован для учета повторных измерений и независимых переменных с использованием всех образцов в течение всего периода исследования. Этот анализ был использован для определения того, является ли значимым различие PENK между здоровыми и тяжелобольными детьми с разной степенью тяжести AKI. Зависимая переменная (концентрация PENK) была преобразована в z-значения, чтобы обеспечить приблизительно нормальное распределение показателей статистической ошибки модели. Независимыми переменными в этой модели были балл по шкале RIFLE во время забора крови, пол, постнатальный возраст, время после интубации, использование вазопрессоров и категории диагноза, основанные на их возможном влиянии на зависимую переменную. Случайный свободный коэффициент был включен для учета внутрисубъектных корреляций. Результаты представлены с использованием оценочных предельных средних, которые представляют собой прогнозируемые значения результата (z-значение PENK) с поправкой на отсутствующие данные и влияние независимых переменных. Эти оценочные предельные средние преобразуются обратно с использованием обратной формулы z-значения, что дает оценочный прогноз медианных значений PENK и его 95% CI. Расчетные предельные средние значения z-значения PENK у тяжелобольных детей сравнивали со здоровыми детьми с использованием Т-критерия Стьюдента.
Исследовательский анализ - ассоциация PENK и других биомаркеров с диагнозом AKI
Кривые соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов (ROC) использовали для оценки связи концентраций биомаркеров с AKI в разные периоды времени после интубации (0-6 часов, 6-12 часов, 12-24 часа, 24-36 часов и 36-48 часов). Для этого анализа был включен только первый образец от каждого пациента в каждом временном интервале в целях корректировки повторной выборки, за исключением отсутствующих значений. Площадь под ROC-кривой (AUROC) и ее 95% CI определяли для PENK, CysC и BTP. Поскольку диагноз AKI был основан на SCr, этот биомаркер не был включен.
Статистический анализ проводили с применением пакета SPSS версии 25.0 (IBM, Чикаго, Иллинойс, США), GraphPad Prism версии 5.03 (GraphPad Software Inc., Ла-Хойя, Калифорния, США) и R версии 3.5.1 (R Core Team 2013). Двустороннее значение p, равное 0,05, считалось ограничением статистической значимости.
Результаты
Здоровые дети
Из 116 здоровых детей, изначально включенных в исследование, 16 были исключены вследствие отсутствия достаточного количества образцов плазмы для измерения PENK или вследствие того, что z-значения SCr выходили за пределы предварительно заданного диапазона. Характеристики пациентов для 100 оставшихся детей представлены в таблице 1.
Не было четкой связи между PENK и возрастом в течение первого года у здоровых детей. Модели GAMLSS, включающие возраст в качестве независимой переменной, показали лишь незначительно лучшие результаты, чем модели без учета возраста, на что указывает разница AIC всего в 0,952. Поэтому мы использовали модель GAMLSS, которая предполагает, что концентрации PENK были нормально распределены после преобразования Бокса-Кокса в течение первого года. Z-значения PENK рассчитывали по следующей формуле, полученной из модели GAMLSS:
Концентрации PENK были измерены в общей сложности в 145 образцах. Полученные из этого медианные концентрации PENK составили 517,3 пмоль/л (95% CI 488,9-547,4, 2,5-й и 97,5-й процентили составили 265,2 и 1017,1 пмоль/л соответственно), как показано на фигуре 2.
Тяжелобольные дети - характеристики пациентов
Из 101 тяжелобольного ребенка в предшествующих исследованиях 10 были исключены: у шести пациентов был недостаточный объем плазмы для анализа PENK, а у четырех пациентов не было образцов в течение 48 часов после интубации, в результате чего остался 91 тяжелобольной ребенок. Характеристики пациентов для всех пациентов, подгрупп с AKI и без AKI представлены в таблице 6.
В течение 48 часов после интубации 40 пациентов (44%) были отнесены к подгруппе AKI; 20, 11 и 9 пациентов с риском, повреждением и отказом в качестве наивысшего балла по шкале RIFLE соответственно. Не было каких-либо значимых различий по полу, возрасту, этнической принадлежности и массе тела между подгруппами без AKI и AKI. Показатели тяжести заболевания, продолжительности пребывания в стационаре и смертности были выше в подгруппе AKI, но различия не были статистически значимыми (таблица 6).
Таблица 6: Характеристики пациентов для здоровых и тяжелобольных когорт, включая анализ подгрупп между подгруппами с AKI и подгруппами без AKI.
(n=100)
Все пациенты
(n=91)
Без AKIb
(n=51)
AKIb
(n=40)
без-AKI в сравнении с AKI
отсутствует: 2
отсутствует: 2
отсутствует: 6
отсутствует: 2
отсутствует: 4
(57,4-165,9)
(0,9-76,6)
(0,9-61,6)
(0,7-99,0)
отсутствует: 3
Пластика паховой грыжи
Ортопедическая хирургия
Бронхоскопия
Гипербилирубинемия
Тест на апноэ во сне
Другой
Диагноз когорта тяжелобольных: n
Нарушение дыхания
CDH
Сердечная недостаточность
Сепсис
Другое тяжелое
13/98 (13%)
9/98 (9%)
7/98 (7%)
6/98 (6%)
16/98 (16%)
отсутствует: 2
23/91 (25%)
14/91 (15%)
14/91 (15%)
8/91 (9%)
12/51 (24%)
5/51 (10%)
9/51 (18%)
6/51 (12%)
11/40 (27,5%)
9/40 (23%) 5/40 (13%)
2/40 (5%)
0,329
Предсказанная смертность PIM-II: %; медиана (IQR)
Оценка PRISM-III: баллы; медиана (IQR)
отсутствует: 6
34,5 (15,7-64,6)
отсутствует: 6
отсутствует: 2
33,8 (11,0-54,6)
отсутствует: 2
отсутствует: 4
41,8 (19,5-75,0)
отсутствует: 4
0,107
дни; медиана IQR)
Смертность в ОРИТ
14/91 (15,4%)
6/51 (11,8%)
8/40 (20%)
0,446
(444,4-700,5)
(367,7-754,1)
(316,4-557,6)
(434,3-982,3)
(-0,71-0,64)
(-0,58-1,70)
(-1,0-0,21)
(0,92-3,1)
P-значения показывают различия между подгруппами без AKI и AKI в когорте тяжелобольных
а: не собрано в здоровой когорте
b: тяжелобольные дети были разделены на подгруппы с AKI и без AKI в соответствии с наивысшим баллом, полученным по шкале RIFLE в течение 48 часов после интубации.
c: Исходные значения представляют собой первый образец после интубации, который был доступен для анализа
Тяжелобольные дети - концентрации PENK
В общей сложности 578 образцов плазмы анализировали на PENK у тяжелобольных детей. Медианные (IQR) исходные концентрации PENK в подгруппе без AKI составили 416,5 (316,4-557,6) пмоль/л по сравнению с 669,4 (434,3-982,3) пмоль/л у пациентов с AKI (р <0,001). Для временных периодов до 48 часов после интубации, концентрация PENK была значимо выше в AKI подгруппе (р <.01 для каждого периода времени, за исключением 36-48 часов после интубации (р=0,123)) (фигура 3).
Тяжелобольные дети - Анализ смешанной модели
Из включенных независимых переменных в конечной модели только возраст показал значимое влияние на концентрации PENK. Обзор прогнозируемых значений (подвергнутые обратной трансформации оцененные пределы средних) PENK у тяжелобольных детей изображен на фигуре 4, где они сравниваются с концентрацией у здоровых детей. Медианные концентрации PENK были значимо ниже у тяжелобольных детей без AKI (432,2 пмоль/л [95% CI 398,2-469,2]) по сравнению со здоровыми детьми (517,3 пмоль/л [95% CI 488,9-547,4], р <0,001). Тяжелобольные с AKI имели значимо более высокие медианные концентрации PENK, чем у здоровых детей (за исключением пациентов со значением «Риск» в качестве наивысшего балла по шкале RIFLE) и тяжелобольных детей без AKI (Риск 507,9 пмоль/л [95% CI 454,3-567,9], Повреждение 704,0 пмоль/L [595,8-832,3] и Отказ 930,5 пмоль/л [763,2-1135,2], р <0,01 между всеми подгруппами, кроме Риска в сравнении со здоровыми детьми (р=0,746)).
Тяжелобольные дети - корреляция с другими биомаркерами
Для того, чтобы сравнить ассоциацию PENK и других биомаркеров с диагнозом AKI, кривые ROC были созданы для пяти временных периодов после интубации (фигуры 5 A-E). AUROC для AKI по PENK был самым высоким во всех временных периодах, кроме одного, до 48 часов после интубации, а CysC имел вторую по величине ассоциацию с AKI. Только на 12-24-часовом временном периоде PENK показал более низкий показатель AUROC, чем BTP. Список значений AUROC, 95% CI и количества образцов для каждого биомаркера показаны в таблице 7.
Таблица 7: Площадь под кривыми соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов (AUROC) с 95% доверительным интервалом (CI) и количеством образцов для PENK, цистатина С (CysC) и бета-следового белка (BTP) в различные временные периоды после интубации для выявления ассоциации с острой почечной недостаточностью на момент взятия образца. Биомаркеры ранжируются сверху вниз от самой большой к самой меньшей AUROC в каждом временном периоде.
Обсуждение
Мы представляем первые данные по PENK как биомаркеру AKI у детей. У взрослых этот биомаркер показал многообещающие результаты, сильно коррелирующие с GFR, AKI и ухудшением функции почек22,24,26,28. В данном исследовании мы представляем контрольные значения этого биомаркера у здоровых детей в возрасте от 0 до 1 года. Несмотря на очень высокие концентрации у детей, концентрации PENK позволяют четко различить тяжелобольных детей с AKI и без AKI. Более того, наши данные свидетельствуют о том, что он может превосходить другие часто используемые биомаркеры AKI.
При разработке педиатрических биомаркеров возрастные контрольные значения являются ключевыми для их реализации, так как игнорирование возрастных изменений нормальных значений может привести к неточным показателям у детей33. В нашем исследовании эта важность очевидна, так как контрольные значения для PENK у детей до 1 года более чем в десять раз выше, чем у здоровых взрослых (медиана 45 пмоль/л, 99-й процентиль составляет 80 пмоль/л)26. Кроме того, наши контрольные значения PENK не показали возрастных изменений в течение первого года, в отличие от SCr9 и (в меньшей степени) CysC16,41. Тем не менее, при сравнении контрольных значений PENK у взрослых и детей становится очевидным, что концентрации PENK будут снижаться в течение детства, как это также было замечено в нашем предыдущем исследовании для BTP34, которое показало (немного) более высокие контрольные значения в течение первого года по сравнению со взрослыми42.
Эти более высокие концентрации можно объяснить более низким (абсолютным) клиренсом у детей раннего возраста вследствие созревания функции почек в течение первых лет жизни43. Однако, поскольку GFR маленьких детей не в десять раз ниже GFR здоровых взрослых, то у детей может быть повышена продукция энкефалинов. Концентрации Met-энкефалина, другого эндогенного опиоида, полученного из того же предшественника, что и PENK, также были более чем в десять раз выше у детей, чем у взрослых44. Кроме того, более высокие концентрации PENK в спинномозговой жидкости (CSF) наблюдались у 12 детей с болезнью Мойя-Мойя (в возрасте от 1 до 16 лет), хотя концентрации в CSF не отражали концентрации PENK в сыворотке45.
Несмотря на эти более высокие медианные концентрации PENK у здоровых детей, его связь с AKI у тяжелобольных детей является заметной. Это согласуется с отчетами у взрослых, где PENK сильно коррелировал с измеренной GFR у 24 септических пациентов интенсивной терапии25 и был независимо связан со стадиями RIFLE в другой когорте из 101 пациента с сепсисом26. В нашем исследовании концентрации PENK также были значимо повышены, так как AKI было более тяжелым, даже при поправке на повторные выборки и ковариаты. Поскольку это первые данные о PENK в качестве биомаркера AKI у детей, решающее значение имеет сравнение с другими биомаркерами. По сравнению с другими биомаркерами PENK продемонстрировал более высокую корреляцию с GFR по сравнению с клиренсом креатинина у взрослых (R2 0,91 против 0,68, соответственно)25 и более высокую прогностическую ценность для AKI, чем NGAL (AUROC 0,73 против 0,68, соответственно)24. У детей CysC и BTP считаются одними из лучших биомаркеров для диагностики AKI41,46,47, но в нашем исследовательском анализе PENK показал наибольшую ассоциацию с AKI. Кроме того, большая ассоциация в этой популяции с относительно легким AKI может свидетельствовать о более высокой чувствительности PENK по сравнению с CysC, что делает его более подходящим биомаркером для раннего скрининга AKI. Эти многообещающие результаты требуют дальнейшего изучения диагностического потенциала PENK при AKI у детей.
Интересно, что концентрации PENK были ниже у пациентов в критическом состоянии без AKI по сравнению с контрольными значениями для здоровых детей. Это можно объяснить несколькими патофизиологическими процессами во время критического состояния. Почечный клиренс может быть повышен вследствие увеличения сердечного выброса и почечной перфузии, что представляет собой явление, называемое «повышенный почечный клиренс», которое хорошо задокументировано у взрослых48 и детей49. Кроме того, обширные проблемы с жидкостью и отеки могут снизить концентрацию PENK в плазме у тяжелобольных пациентов. Тот факт, что эта картина наблюдалась для всех других биомаркеров плазмы в нашем исследовании (SCr, CysC и BTP), подтверждает указанное выше (данные не показаны).
В этом исследовании мы использовали AKI в первые 48 часов после интубации в качестве меры исхода, в отличие от 48 часов после госпитализации, поскольку несколько пациентов не были набраны напрямую и для них имелись концентрации PENK только через несколько дней после госпитализации. Это привело к несколько большему количеству пациентов с AKI, чем сообщалось ранее36. У этих дополнительных пациентов в основном наблюдалось умеренное и временное повышение SCr. Это более широкое представительство пациентов с легкой формой AKI могло привести к менее выраженным различиям в жестких конечных точках между подгруппами с AKI и без AKI, чем в нашей группе и других группах при использовании AKI после госпитализации в качестве исходов4-6,36.
Наше исследование также имеет некоторые ограничения. В когорты входили дети до 1 года, что ограничивает экстраполяцию на другие педиатрические возрастные группы. Кроме того, мы не смогли подтвердить PENK в качестве биомаркера GFR у детей или возможности прогнозирования AKI, поскольку формулы GFR для детей, использующие SCr и/или CysC, не были валидированы у детей в возрасте до 1 года50,51, измерения, являющиеся золотым стандартом измерения GFR, не выполнялись, и у большинства пациентов перед интубацией были выявлены признаки AKI36. Наконец, в больничных картах отсутствовала подробная информация о диурезе, которая могла бы позволить поставить более надежный диагноз AKI с использованием критериев KDIGO52. Хотя наши результаты PENK как нового биомаркера AKI являются многообещающими, будущие исследования PENK у детей должны быть сосредоточены на определении его контрольных значений во всем педиатрическом возрастном диапазоне, чтобы выяснить любые (долгосрочные) возрастные закономерности. Кроме того, необходимо провести дополнительные сравнения между измеренными концентрациями GFR и PENK у (тяжелобольных) детей, как это делается у взрослых23,27,38, чтобы установить PENK в качестве нового биомаркера GFR и AKI в этой популяции.
Выводы
В настоящем исследовании представлены первые данные о PENK как биомаркере AKI у детей. Концентрации PENK, по-видимому, являются стабильными в течение первого года жизни, но демонстрируют большую вариабельность между индивидами, при этом контрольные значения значительно выше у детей, чем у взрослых. Несмотря на это, результаты применения этого биомаркера для диагностики AKI у детей являются весьма многообещающими. PENK показал самую сильную связь с диагнозом AKI, превосходя другие биомаркеры плазмы, которые считаются лучшими из доступных в настоящее время. Текущие исследования должны подтвердить, может ли этот биомаркер, отдельно или в сочетании с другими, улучшить диагностику и лечение детей с AKI.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. McGregor TL, Jones DP, Wang L, et al. Acute Kidney Injury Incidence in Noncritically Ill Hospitalized Children, Adolescents, and Young Adults: A Retrospective Observational Study. Am J Kidney Dis. 2016;67(3):384-390.
2. Sutherland SM, Kwiatkowski DM. Acute Kidney Injury in Children. Adv Chronic Kidney Dis. 2017;24(6):380-387.
3. Lameire N, Van Biesen W, Vanholder R. Epidemiology of acute kidney injury in children worldwide, including developing countries. Pediatr Nephrol. 2017;32(8):1301-1314.
4. Alkandari O, Eddington KA, Hyder A, et al. Acute kidney injury is an independent risk factor for pediatric intensive care unit mortality, longer length of stay and prolonged mechanical ventilation in critically ill children: a two-center retrospective cohort study. Crit Care. 2011;15(3):R146.
5. Kaddourah A, Basu RK, Bagshaw SM, Goldstein SL, Investigators A. Epidemiology of Acute Kidney Injury in Critically Ill Children and Young Adults. N Engl J Med. 2017;376(1):11-20.
6. Goldstein SL. Acute kidney injury in children and its potential consequences in adulthood. Blood Purif. 2012;33(1-3):131-137.
7. Soveri I, Berg UB, Bjork J, et al. Measuring GFR: a systematic review. Am J Kidney Dis. 2014;64(3):411-424.
8. Guignard JP, Drukker A. Why do newborn infants have a high plasma creatinine? Pediatrics. 1999;103(4):e49.
9. Boer DP, de Rijke YB, Hop WC, Cransberg K, Dorresteijn EM. Reference values for serum creatinine in children younger than 1 year of age. Pediatr Nephrol. 2010;25(10):2107-2113.
10. Gross JL, Prowle JR. Perioperative acute kidney injury. BJA Education. 2015;15(4):213-218.
11. Inker LA, Tighiouart H, Coresh J, et al. GFR Estimation Using beta-Trace Protein and beta2-Microglobulin in CKD. Am J Kidney Dis. 2016;67(1):40-48.
12. Schwartz GJ, Schneider MF, Maier PS, et al. Improved equations estimating GFR in children with chronic kidney disease using an immunonephelometric determination of cystatin C. Kidney Int. 2012;82(4):445-453.
13. Deng F, Finer G, Haymond S, Brooks E, Langman CB. Applicability of estimating glomerular filtration rate equations in pediatric patients: comparison with a measured glomerular filtration rate by iohexol clearance. Transl Res. 2015;165(3):437-445.
14. Ashraf M, Shahzad N, Irshad M, Hussain SQ, Ahmed P. Pediatric acute kidney injury: A syndrome under paradigm shift. Indian J Crit Care Med. 2014;18(8):518-526.
15. Buijs EA, Zwiers AJ, Ista E, Tibboel D, de Wildt SN. Biomarkers and clinical tools in critically ill children: are we heading toward tailored drug therapy? Biomark Med. 2012;6(3):239-257.
16. Bokenkamp A, Domanetzki M, Zinck R, Schumann G, Brodehl J. Reference values for cystatin C serum concentrations in children. Pediatr Nephrol. 1998;12(2):125-129.
17. Vynckier LL, Flore KM, Delanghe SE, Delanghe JR. Urinary beta-trace protein as a new renal tubular marker. Clin Chem. 2009;55(6):1241-1243.
18. Mahmoodpoor A, Hamishehkar H, Fattahi V, Sanaie S, Arora P, Nader ND. Urinary versus plasma neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL) as a predictor of mortality for acute kidney injury in intensive care unit patients. J Clin Anesth. 2018;44:12-17.
19. Ernst A, Kohrle J, Bergmann A. Proenkephalin A 119-159, a stable proenkephalin A precursor fragment identified in human circulation. Peptides. 2006;27(7):1835-1840.
20. Denning GM, Ackermann LW, Barna TJ, et al. Proenkephalin expression and enkephalin release are widely observed in non-neuronal tissues. Peptides. 2008;29(1):83-92.
21. Zoccali C, Ciccarelli M, Mallamaci F, Maggiore Q, Lotti M, Zucchelli GC. Plasma met-enkephalin and leu-enkephalin in chronic renal failure. Nephrol Dial Transplant. 1987;1(4):219-222.
22. Beunders R SJ, Wu A, Zarbock A, Di Somma S, Mehta R. Pickkers P. Proenkephalin (PENK) as a Novel Biomarker for Kidney Function. Journal of Applied Laboratory Medicine. 2017;2(3):400-412.
23. Kieneker LM, Hartmann O, Struck J, et al. Plasma Proenkephalin and Poor Long-Term Outcome in Renal Transplant Recipients. Transplant Direct. 2017;3(8):e190.
24. Kim H, Hur M, Lee S, et al. Proenkephalin, Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin, and Estimated Glomerular Filtration Rates in Patients With Sepsis. Ann Lab Med. 2017;37(5):388-397.
25. Leijte G, Beunders R, Van Groenendael R, Peters E, Kox M, Pickkers P. Proenkephalin, the new marker for kidney function on the Intensive care unit? Intensive Care Medicine Experimental Conference: 30th Annual Congress of the European Society of Intensive Care Medicine, ESICM. 2017;5(2 Supplement 1).
26. Marino R, Struck J, Hartmann O, et al. Diagnostic and short-term prognostic utility of plasma pro-enkephalin (pro-ENK) for acute kidney injury in patients admitted with sepsis in the emergency department. Journal of nephrology. 2015;28(6):717-724.
27. Matsue Y, Ter Maaten JM, Struck J, et al. Clinical Correlates and Prognostic Value of Proenkephalin in Acute and Chronic Heart Failure. J Card Fail. 2017;23(3):231-239.
28. Ng LL, Squire IB, Jones DJ, et al. Proenkephalin, Renal Dysfunction, and Prognosis in Patients With Acute Heart Failure: A GREAT Network Study. J Am Coll Cardiol. 2017;69(1):56-69.
29. Schulz CA, Christensson A, Ericson U, et al. High Level of Fasting Plasma Proenkephalin-A Predicts Deterioration of Kidney Function and Incidence of CKD. J Am Soc Nephrol. 2017;28(1):291-303.
30. Shah KS, Taub P, Patel M, et al. Proenkephalin predicts acute kidney injury in cardiac surgery patients. Clin Nephrol. 2015;83(1):29-35.
31. Siong Chan DC, Cao TH, Ng LL. Proenkephalin in Heart Failure. Heart Fail Clin. 2018;14(1):1-11.
32. Hollinger A, Wittebole X, Francois B, et al. Proenkephalin A 119-159 (PENKid) Is an Early Biomarker of Septic Acute Kidney Injury: The Kidney in Sepsis and Septic Shock (Kid-SSS) Study. Kidney Int Rep. 2018;3(6):1424-1433.
33. Greenberg JH, Parikh CR. Biomarkers for Diagnosis and Prognosis of AKI in Children: One Size Does Not Fit All. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12(9):1551-1557.
34. Zwiers AJ, Cransberg K, de Rijke YB, et al. Reference ranges for serum beta-trace protein in neonates and children younger than 1 year of age. Clin Chem Lab Med. 2014;52(12):1815-1821.
35. Zwiers AJ, de Wildt SN, de Rijke YB, et al. Reference intervals for renal injury biomarkers neutrophil gelatinase-associated lipocalin and kidney injury molecule-1 in young infants. Clin Chem Lab Med. 2015;53(8):1279-1289.
36. Zwiers AJ, de Wildt SN, van Rosmalen J, et al. Urinary neutrophil gelatinase-associated lipocalin identifies critically ill young children with acute kidney injury following intensive care admission: a prospective cohort study. Crit Care. 2015;19:181.
37. Zwiers AJ, Cransberg K, de Rijke YB, van Rosmalen J, Tibboel D, de Wildt SN. Urinary Neutrophil Gelatinase-Associated Lipocalin Predicts Renal Injury Following Extracorporeal Membrane Oxygenation. Pediatr Crit Care Med. 2015;16(7):663-670.
38. Donato LJ, Meeusen JW, Lieske JC, Bergmann D, Sparwasser A, Jaffe AS. Analytical performance of an immunoassay to measure proenkephalin. Clin Biochem. 2018;58:72-77.
39. Bellomo R, Ronco C, Kellum JA, Mehta RL, Palevsky P, Acute Dialysis Quality Initiative w. Acute renal failure - definition, outcome measures, animal models, fluid therapy and information technology needs: the Second International Consensus Conference of the Acute Dialysis Quality Initiative (ADQI) Group. Crit Care. 2004;8(4):R204-212.
40. Rigby RA, Stasinopoulos, D. M. Generalized additive models for location, scale and shape. Appl Statis. 2005;54(3):507-554.
41. Bai Z, Fang F, Xu Z, et al. Serum and urine FGF23 and IGFBP-7 for the prediction of acute kidney injury in critically ill children. BMC Pediatr. 2018;18(1).
42. Pottel H, Schaeffner E, Ebert N. Evaluating the diagnostic value of rescaled beta-trace protein in combination with serum creatinine and serum cystatin C in older adults. Clin Chim Acta. 2018;480:206-213.
43. Kearns GL, Abdel-Rahman SM, Alander SW, Blowey DL, Leeder JS, Kauffman RE. Developmental pharmacology--drug disposition, action, and therapy in infants and children. N Engl J Med. 2003;349(12):1157-1167.
44. Martinez AM, Padbury JF, Burnell EE, Thio SL. Plasma methionine enkephalin levels in the human newborn at birth. Biol Neonate. 1991;60(2):102-107.
45. Yokoyama K, Maruwaka M, Yoshikawa K, et al. Elevation of Proenkephalin 143-183 in Cerebrospinal Fluid in Moyamoya Disease. World Neurosurg. 2018;109:e446-e459.
46. McCaffrey J, Coupes B, Chaloner C, Webb NJ, Barber R, Lennon R. Towards a biomarker panel for the assessment of AKI in children receiving intensive care. Pediatr Nephrol. 2015;30(10):1861-1871.
47. Safdar OY, Shalaby M, Khathlan N, et al. Serum cystatin is a useful marker for the diagnosis of acute kidney injury in critically ill children: prospective cohort study. BMC Nephrol. 2016;17(1):130.
48. Udy AA, Jarrett P, Stuart J, et al. Determining the mechanisms underlying augmented renal drug clearance in the critically ill: use of exogenous marker compounds. Crit Care. 2014;18(6):657.
49. Dhont E, Van Der Heggen T, De Jaeger A, Vande Walle J, De Paepe P, De Cock PA. Augmented renal clearance in pediatric intensive care: are we undertreating our sickest patients? Pediatr Nephrol. 2018.
50. Bouvet Y, Bouissou F, Coulais Y, et al. GFR is better estimated by considering both serum cystatin C and creatinine levels. Pediatr Nephrol. 2006;21(9):1299-1306.
51. Pottel H, Dubourg L, Goffin K, Delanaye P. Alternatives for the Bedside Schwartz Equation to Estimate Glomerular Filtration Rate in Children. Adv Chronic Kidney Dis. 2018;25(1):57-66.
52. Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO): Clinical Practice Guideline for Acute Kidney Injury. Kidney Int Suppl. 2012;2(1):1-138.
Пример 3:
PENK у здоровых детей
Здоровые дети без известной почечной недостаточности (n=38, 55,3% женщин, средний [диапазон] возраст 11,3 [1-20] лет, SCr 49,7 [23-98] мкмоль/л) были измерены с помощью анализа МР-PENK.
Уровни PENK снижались в зависимости от возраста (фиг. 6). Между PENK и возрастом была сильная корреляция (r=-0,86, p <0,0001).
ОПИСАНИЕ ФИГУР:
Фигура 1: Типичная кривая доза/сигнал проэнкефалина.
Фигура 2: Контрольные процентили для проэнкефалина А 119-159 (PENK) как линейная функция постнатального возраста у здоровых детей.
Квадраты представляют все измеренные концентрации PENK (145 образцов) всех здоровых пациентов (n=100) в нашей здоровой когорте. Контрольные процентили для PENK указаны для 2,5-го (штрихпунктирный, нижний), 25-го (штриховой, нижний), 50-го (сплошной), 75-го (штриховой, верхний) и 97,5-го (штрихпунктирный, верхний) процентилей.
Фигуры 3: Концентрации PENK у тяжелобольных пациентов с AKI по сравнению с пациентами без AKI в первые 48 часов после интубации.
Уровни PENK в плазме представлены как медиана и межквартильный диапазон для 5 временных периодов после интубации. Исходы стратифицированы как «нет AKI» (зеленый) или «AKI» (красный) в течение 48 часов после интубации, по одному образцу на пациента за временной диапазон. Цифры в скобках над каждым временным интервалом представляют количество пациентов в каждой категории. **: р<0,01; ***: р<0,001; ns: статистически незначимо (p > 0,05).
Фигура 4: Концентрации PENK у здоровых и тяжелобольных детей с различными уровнями AKI.
Обзор медианных концентраций PENK с доверительными интервалами 95% у 100 здоровых детей (145 образцов) и 91 тяжелобольного ребенка с различной степенью AKI во время забора образцов на основе баллов RIFLE (всего 561 образец: 422 без AKI, 86 с риском, 28 с повреждением, 25 с отказом). 17 образцов PENK не использовались из-за отсутствия соответствующих баллов RIFLE.
Статистическая значимость у тяжелобольных детей основана на результатах предполагаемых предельных средних значений анализа линейной смешанной модели, скорректированных на повторную выборку и все независимые переменные (балл RIFLE, пол, постнатальный возраст, время после интубации, использование вазопрессоров и категории диагноза), с использованием всех образцов в течение всего исследования у 91 тяжелобольного ребенка (561 образец) и соответствующей стадии RIFLE на момент забора крови. Различия между оценочными предельными средними значениями у тяжелобольных детей и средними концентрациями PENK у здоровых детей (145 образцов) были определенны с использованием Т-критерия Стьюдента. **:р<0,01; ***: р<0,001; ns: статистически не значимо (p > 0,05)
Фигура 5 AE: эффективность PENK, цистатина C и BTP для диагностики AKI. Кривые соотношений правильного и ложного обнаружения сигналов (ROC) для PENK, CysC и BTP на предмет их связи с AKI во время забора крови в 5 временных периодах: A (0-6ч), B (6-12 ч), C (12-24 ч), D (24-36 ч) и Е (36-48 ч) после интубации. Список значений AUROC, доверительных интервалов и количества образцов в каждом временном периода для каждого биомаркера показаны в таблице 7.
Фигура 6: Концентрации PENK у здоровых детей (до 20 лет).
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> СФИНГОТЕК ГМБХ
<120> Способ для диагностики или мониторинга функции почек или
диагностики дисфункции почек у пациентов детского возраста
<130> S75215WO
<160> 19
<170> PatentIn версия 3.3
<210> 1
<211> 243
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 1
Glu Cys Ser Gln Asp Cys Ala Thr Cys Ser Tyr Arg Leu Val Arg Pro
1 5 10 15
Ala Asp Ile Asn Phe Leu Ala Cys Val Met Glu Cys Glu Gly Lys Leu
20 25 30
Pro Ser Leu Lys Ile Trp Glu Thr Cys Lys Glu Leu Leu Gln Leu Ser
35 40 45
Lys Pro Glu Leu Pro Gln Asp Gly Thr Ser Thr Leu Arg Glu Asn Ser
50 55 60
Lys Pro Glu Glu Ser His Leu Leu Ala Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met
65 70 75 80
Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Lys Lys Met Asp Glu Leu Tyr Pro Met
85 90 95
Glu Pro Glu Glu Glu Ala Asn Gly Ser Glu Ile Leu Ala Lys Arg Tyr
100 105 110
Gly Gly Phe Met Lys Lys Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Leu Ala Asn
115 120 125
Ser Ser Asp Leu Leu Lys Glu Leu Leu Glu Thr Gly Asp Asn Arg Glu
130 135 140
Arg Ser His His Gln Asp Gly Ser Asp Asn Glu Glu Glu Val Ser Lys
145 150 155 160
Arg Tyr Gly Gly Phe Met Arg Gly Leu Lys Arg Ser Pro Gln Leu Glu
165 170 175
Asp Glu Ala Lys Glu Leu Gln Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met Arg Arg
180 185 190
Val Gly Arg Pro Glu Trp Trp Met Asp Tyr Gln Lys Arg Tyr Gly Gly
195 200 205
Phe Leu Lys Arg Phe Ala Glu Ala Leu Pro Ser Asp Glu Glu Gly Glu
210 215 220
Ser Tyr Ser Lys Glu Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Tyr Gly Gly Phe
225 230 235 240
Met Arg Phe
<210> 2
<211> 73
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 2
Glu Cys Ser Gln Asp Cys Ala Thr Cys Ser Tyr Arg Leu Val Arg Pro
1 5 10 15
Ala Asp Ile Asn Phe Leu Ala Cys Val Met Glu Cys Glu Gly Lys Leu
20 25 30
Pro Ser Leu Lys Ile Trp Glu Thr Cys Lys Glu Leu Leu Gln Leu Ser
35 40 45
Lys Pro Glu Leu Pro Gln Asp Gly Thr Ser Thr Leu Arg Glu Asn Ser
50 55 60
Lys Pro Glu Glu Ser His Leu Leu Ala
65 70
<210> 3
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 3
Tyr Gly Gly Phe Met
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 4
Tyr Gly Gly Phe Leu
1 5
<210> 5
<211> 20
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Asp Glu Leu Tyr Pro Met Glu Pro Glu Glu Glu Ala Asn Gly Ser
1 5 10 15
Glu Ile Leu Ala
20
<210> 6
<211> 41
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 6
Asp Ala Glu Glu Asp Asp Ser Leu Ala Asn Ser Ser Asp Leu Leu Lys
1 5 10 15
Glu Leu Leu Glu Thr Gly Asp Asn Arg Glu Arg Ser His His Gln Asp
20 25 30
Gly Ser Asp Asn Glu Glu Glu Val Ser
35 40
<210> 7
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 7
Tyr Gly Gly Phe Met Arg Gly Leu
1 5
<210> 8
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 8
Ser Pro Gln Leu Glu Asp Glu Ala Lys Glu Leu Gln
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 9
Val Gly Arg Pro Glu Trp Trp Met Asp Tyr Gln
1 5 10
<210> 10
<211> 22
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 10
Phe Ala Glu Ala Leu Pro Ser Asp Glu Glu Gly Glu Ser Tyr Ser Lys
1 5 10 15
Glu Val Pro Glu Met Glu
20
<210> 11
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 11
Phe Ala Glu Ala Leu Pro Ser Asp Glu Glu Gly Glu Ser Tyr Ser Lys
1 5 10 15
Glu Val Pro Glu Met Glu Lys Arg Tyr Gly Gly Phe Met
20 25
<210> 12
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 12
Tyr Gly Gly Phe Met Arg Phe
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 13
Leu Lys Glu Leu Leu Glu Thr Gly
1 5
<210> 14
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 14
Ser Asp Asn Glu Glu Glu Val Ser
1 5
<210> 15
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 15
Asp Ala Glu Glu Asp Asp
1 5
<210> 16
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 16
Glu Glu Asp Asp Ser Leu Ala Asn Ser Ser Asp Leu Leu Lys
1 5 10
<210> 17
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 17
Leu Lys Glu Leu Leu Glu Thr Gly
1 5
<210> 18
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 18
Thr Gly Asp Asn Arg Glu Arg Ser His His Gln Asp Gly Ser Asp Asn
1 5 10 15
Glu
<210> 19
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 19
Ser Asp Asn Glu Glu Glu Val Ser
1 5
<---
Предложенная группа изобретений относится к медицине, а именно к педиатрии. Предложен способ диагностики дисфункции почек у ребенка, включающий определение уровня проэнкефалина или его фрагментов, выбранных из группы, включающей SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10 и SEQ ID No. 11, в жидкости организма, и соотнесение указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с дисфункцией почек, где повышенный уровень выше порога, находящегося в диапазоне 150-1290 пмоль/л, является диагностическим признаком дисфункции почек у ребенка. Предложено применение набора для осуществления вышеуказанного способа, где указанный набор содержит по меньшей мере два антитела или фрагмента антител, направленных на аминокислоты 133-140 (LKELLETG, SEQ ID No. 13) и аминокислоты 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID No. 14). Предложенная группа изобретений обеспечивает эффективную диагностику дисфункции почек у детей за счет определения уровня проэнкефалина или его фрагментов в жидкости организма. 2 н. и 10 з.п. ф-лы, 6 ил., 7 табл., 3 пр.
1. Способ диагностики дисфункции почек у субъекта, включающий в себя
определение уровня проэнкефалина или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот в жидкости организма, полученной от указанного субъекта, и
соотнесение указанного уровня проэнкефалина или его фрагментов с дисфункцией почек, при этом повышенный уровень выше определенного порога является диагностическим признаком дисфункции почек у указанного субъекта,
где указанный проэнкефалин или его фрагмент выбраны из группы, включающей SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10 и SEQ ID No. 11,
при этом указанный порог находится в диапазоне 150-1290 пмоль/л,
и при этом указанный субъект является ребенком.
2. Способ по п. 1, где указанный субъект представляет собой ребенка в возрасте 18 лет или младше, более предпочтительно в возрасте 14 лет или младше, еще более предпочтительно в возрасте 12 лет или младше, еще более предпочтительно в возрасте 8 лет или младше, еще более предпочтительно в возрасте 5 лет или младше, еще более предпочтительно в возрасте 2 лет или младше, наиболее предпочтительно в возрасте одного года или младше.
3. Способ по п. 1 или 2, в котором указанный ребенок является тяжелобольным.
4. Способ по любому из пп. 1-3, включающий в себя
определение уровня иммунореактивного аналита с использованием по меньшей мере одного связывающего вещества, которое связывается с областью аминокислотной последовательности проэнкефалина (PENK) или его фрагментов в жидкости организма, полученной от указанного субъекта, и
соотнесение указанного уровня иммунореактивного аналита с дисфункцией почек, при этом повышенный уровень выше определенного порога является диагностическим признаком дисфункции почек у указанного субъекта.
5. Способ по п. 4, в котором указанное по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с областью в пределах аминокислотной последовательности, выбранной из группы, включающей SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 8, 9, 10 и 11, предпочтительно, указанное по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с областью, имеющей последовательность, выбранную из группы, включающей SEQ ID No. 1, 2, 5, 6, 8 и 9, предпочтительно, указанное по меньшей мере одно связывающее вещество связывается с SEQ ID No. 6.
6. Способ по п. 4 или 5, в котором уровень проэнкефалина измеряют с помощью иммунологического анализа, а указанное связывающее вещество представляет собой антитело или фрагмент антитела, связывающийся с проэнкефалином или его фрагментами, состоящими, по меньшей мере, из 5 аминокислот.
7. Способ по любому из пп. 4-6, в котором применяют анализ, включающий два связывающих вещества, которые связываются с двумя разными областями в пределах области проэнкефалина, которая представляет собой аминокислоты 133-140 (LKELLETG, SEQ ID No. 13) и аминокислоты 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID No. 14), где каждая из указанных областей содержит, по меньшей мере, 4 или 5 аминокислот.
8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором анализ применяют для определения уровня проэнкефалина или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот, и где чувствительность указанного анализа позволяет количественно определить проэнкефалин или фрагменты проэнкефалина у здоровых субъектов и составляет <15 пмоль/л.
9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором указанная жидкость организма может быть выбрана из группы, включающей цельную кровь, сыворотку, плазму, мочу, спинномозговую жидкость (CSF) и слюну.
10. Способ по пп. 1-9, в котором дополнительно определяют по меньшей мере один клинический параметр, выбранный из группы, включающей: бета-следовой белок (ВТР), цистатин С, KIM-1, TIMP-2, IGFBP-7, азот мочевины крови (BUN), NGAL, клиренс креатинина, креатинин сыворотки (SCr), мочевину, оценку риска летального исхода в педиатрии III [PRISM-III], оценку педиатрического индекса летальности 2 [PIM-II] и оценку Apache.
11. Способ по любому из пп. 1-10, в котором указанное определение проэнкефалина или его фрагментов, состоящих, по меньшей мере, из 5 аминокислот, проводят более одного раза у одного пациента.
12. Применение набора для осуществления способа по любому из пп. 1-11, где указанный набор содержит по меньшей мере два антитела или фрагмента антител, направленных на аминокислоты 133-140 (LKELLETG, SEQ ID No. 13) и аминокислоты 152-159 (SDNEEEVS, SEQ ID No. 14).
| СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ИЛИ МОНИТОРИНГА ПОЧЕЧНОЙ ФУНКЦИИ ИЛИ ДИАГНОСТИКИ ПОЧЕЧНОЙ ДИСФУНКЦИИ | 2013 |
|
RU2679913C2 |
| СПОСОБ КАТАЛИТИЧЕСКОГО ЖИДКОФАЗНОГО ГИДРИРОВАНИЯ 2',4',4-ТРИНИТРОБЕНЗАНИЛИДА В ИЗОПРОПАНОЛЕ НА ВЫСОКОПОРИСТОМ ЯЧЕИСТОМ ПАЛАДИЙСОДЕРЖАЩЕМ КАТАЛИЗАТОРЕ (ВПЯПК) | 2005 |
|
RU2293079C1 |
| MCCAFFREY J | |||
| et al | |||
| Towards a biomarker panel for the assessment of AKI in children receiving intensive care | |||
| Pediatr Nephrol | |||
| Устройство для закрепления лыж на раме мотоциклов и велосипедов взамен переднего колеса | 1924 |
|
SU2015A1 |
| Устройство для закрепления лыж на раме мотоциклов и велосипедов взамен переднего колеса | 1924 |
|
SU2015A1 |
| BEUNDERS R | |||
| et al | |||
| Proenkephalin (PENK) as a Novel Biomarker for Kidney Function | |||
| J Appl Lab Med | |||
| Автомобиль-сани, движущиеся на полозьях посредством устанавливающихся по высоте колес с шинами | 1924 |
|
SU2017A1 |
