ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS PUTIDA, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫЕ ВЕЩЕСТВА, ДЛЯ ДЕГРАДАЦИИ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ И УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 C02F101/32 B09C1/10 C12R1/40 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к очистке объектов окружающей среды от загрязнения полициклическими ароматическими углеводородами и углеводородов нефти, и может быть использовано для очистки почв и поверхностных вод от нефтяных загрязнений, содержащих высокие концентрации полициклических ароматических углеводородов.

Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), такие как нафталин, фенантрен, антрацен, хризен и т.д., являются компонентами тяжелых фракций нефти и попадают в окружающую среду в результате аварийных разливов нефтепродуктов, при сгорании различных видов топлива при неполном доступе кислорода, а также содержатся в выхлопных газах автомобилей. ПАУ с высоким молекулярным весом имеют тенденцию накапливаться в почве, что связано, в частности, с их низкой растворимостью и, следовательно, с низкой биодоступностью для микроорганизмов.

Известен нефтеокисляющий штамм бактерии Acinetobacter valentis subspecies paraffinicum (патент RU №2053204, кл. C02F 3/34 от 12.04.94 г.), способный к деградации в широком диапазоне температур и рН. Недостатком данного штамма является неспособность деградировать ПАУ.

Известен штамм Burkholderia caryophylii Jap-3, обладающий высокой деструктивной активностью в отношении поликонденсированных ароматических углеводородов (патент RU №2192462, кл. C12N 1/20, 10.11.2002г.). Однако бактерии рода Burkholderia являются фитопатогенами и их применение в открытой почве нежелательно.

Известны штаммы Mycobacterium phlei и Pseudomonas aeruginosa (патент RU №2053206, кл. C02F 3/34, 29.09.94г.), применяемые для биодеструкции углеводородов нефтепродуктов в окружающей среде в теплое время года. Однако эти штаммы неэффективны при температуре ниже 12°С. Кроме того, вид Pseudomonas aeruginosa относится к условно патогенным микроорганизмам и использование в открытых системах недопустимо.

Известны также штаммы Pseudomonas putida ПИ К₀-1, Pseudomonas fluorescens П-896 и Micrococcus sp ПИ К_у-1, которые используются в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий в составе биопрепарата для очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов. Штаммы имеют достаточную активность при рН от 4,5 до 8,5 (патент RU 2122980, кл. C02F 3/34, 12.04.94г.). Однако данные микроорганизмы не способны продуцировать биоэмульгаторы.

Задачей настоящего изобретения является получение бактериального штамма, содержащего плазмиду, для деградации полициклических ароматических углеводородов и углеводородов нефти.

Технический эффект, который может быть получен при использовании предлагаемых объектов, заключается в том, что штамм бактерий обладает высокой деструктивной активностью в отношении полициклических ароматических углеводородов и нефти, а также способен продуцировать поверхностно-активные вещества, повышающие биодоступность гидрофобных соединений, входящих в состав нефти.

Для решения указанной задачи предлагается штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д, деградирующий полициклические ароматические углеводороды и углеводороды нефти, содержащий конъюгативную плазмиду pBS1141 размером 100 т.п.н., несущую гены биодеградации ПАУ и нефти.

Идентификация штамма бактерий проведена по "Определителю микроорганизмов" Берги (1997 г.).

Штамм бактерий Pseudomonas putida BS3961 был получен в результате селекции из штамма бактерий BS3701, выделенного из загрязненной отходами коксохимического производства Московской области, Россия. Штамм бактерий Pseudomonas putida BS3961 отличается от исходного расширенным спектром утилизируемых углеводородов и конститутивным синтезом ферментов путей биодеградации ПАУ.

Штамм бактерий Pseudomonas putida BS3961 отселектирован и стабилизирован по признаку высокой углеводородокисляющей активности в отношении полициклических ароматических углеводородов.

Штамм бактерий Pseudomonas putida BS3961 депонирован в Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) под номером ВКМ В-2380Д.

Штамм бактерий Pseudomonas putida ВКМ В-2380Д.

Культурально-морфологические признаки.

Подвижные прямые или изогнутые палочки размером 0,8-0,9×1,5-3 мкм. На стандартных питательных средах (МПА, LB, King В) образует круглые колонии 2-3 мм в диаметре, плоские, гладкие, края слегка неровные, белые, непрозрачные.

Окраска по Граму и реакция по Граму методом Gregersen (1978) - грамотрицательные.

Физиолого-биохимические признаки.

Аэроб. Хемоорганотроф. Не нуждается в факторах роста. Оксидазный тест положительный. Каталазный тест положительный. Образует флуоресцирующий пигмент. Не растет при +4°С. Не растет при +41°С. Не обладает способностью к денитрификации с образованием азота. Желатин не гидролизует. Крахмал не гидролизует. Использует в качестве единственного источника углерода глюкозу, глутамат, сукцинат, а также углеводороды нефти, бензоат, салицилат, нафталин, фенантрен. Оптимум рН для роста 6,0-8,0.

Генетические признаки штамма.

Штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д содержит две плазмиды pBS1141 и pBS1142 размером 100 т.п.н. и 50 т.п.н. соответственно (Фиг.1).

Плазмида pBS1141 (100 т.п.н.) содержит гены биодеградации нафталина и фенантрена, конъюгативна и относится к Р9 группе несовместимости.

Плазмида pBS1142 (50 т.п.н) является криптической и не содержит генов биодеградации.

Наличие конъюгативной плазмиды pBS1141 важно, так как она содержит гены биодеградации ПАУ, что способствует распространению данных генов среди аборигенных микроорганизмов и, как результат, ускоряет процесс очистки почв.

Предлагаемый штамм бактерий хорошо растет на средах, содержащих нафталин, фенантрен, салицилат, дибензотиофен, мазут, нефть, дизельное топливо, октан, гексадекан, способен к трансформации антрацена, пирена, аценафтена, а также продуцирует поверхностно-активные вещества (биосурфактанты), табл.1.

Максимальная удельная скорость роста штамма бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д в минимальной среде, содержащей нафталин в качестве единственного источника роста, составляет 0,41 ч^-1. Максимальная удельная скорость роста штамма бактерий в минимальной среде, содержащей фенантрен в качестве единственного источника роста, для штамма бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д составляет 0,07 ч^-1.

Штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д деградирует нафталин в почве до нуля за 3 суток, а фенантрен в почве - до нуля за 20 суток.

Степень деградации нефти указанным штаммом бактерий при 6°С оказалась выше (29%), чем при 24°С (17%). Поэтому штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д можно использовать в составе биопрепарата для очистки нефти в различных климатических условиях, в том числе и в регионах с холодным климатом.

Анализ функционального состава неполярной фракции культуральной жидкости штамма бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д при росте на минеральной среде с гексадеканом (табл.2) позволяет сделать заключение, что в предстационарной фазе роста в культуральной жидкости содержатся преимущественно окисленные продукты деструкции гексадекана (спирты и кислоты). На это указывают их относительно высокие концентрации и наличие в функциональном составе окси- и гидрокси-метиновых и метиленовых групп. Средняя длина цепи продуктов деструкции гексадекана составляет 7-8 углеродных атомов. При росте в минимальной среде Эванса, содержащей гексадекан (20 г/л) в качестве единственного источника роста, штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д деградировал гексадекан до С7-С8 - жирных кислот и спиртов, которые выполняют роль поверхностно-активных веществ.

Функциональный состав неполярных фракций органических соединений культуральной жидкости штамма бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д при росте на среде с нафталином (табл.3) представляет собой набор алкильных радикалов, карбоксиметиленовых групп и непредельных фрагментов.

Отсутствие в составе фрагментов гидроксиметиленовых групп, как это наблюдалось в случае роста бактерий на среде с гексадеканом (табл.2), указывает на то, что штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д при росте на минеральной среде с нафталином выделяет в среду только одноосновные жирные кислоты непредельного характера, что позволяет сделать вывод о том, что штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д выделяет в среду непредельный аналог каприловой кислоты с одной двойной связью. Каприловая кислота относится к поверхностно-активным соединениям, которые повышают растворимость и, как следствие, биодоступность гидрофобных соединений (ПАУ, н-алканы и др.), входящих в состав нефти.

Возможность осуществления изобретения подтверждается следующими примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1

Оценку максимальной удельной скорости роста штамма бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д проводят в колбах Эрленмейера с 100 мл минеральной средой Эванса, содержащей в качестве источника углерода нафталин в концентрации 0,5 г/л. Инокулят (посевная доза - 10⁶ кл/мл) вносят в колбу. После засева колбы помещают на круговую качалку (120 об/ мин) и выращивают в течение 24-48 часов при температуре 24°С. Периодически с интервалом 3 часа стерильно отбирают пробы для определения КОЕ. Пробы после соответствующих разведений в фосфатном буфере высевают на богатую агаризованную среду (LB). Чашки инкубируют при 24°С в течение 24-48 часов. Затем проводят подсчет КОЕ. Максимальная удельная скорость роста штамма бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д в минимальной среде, содержащей нафталин в качестве единственного источника роста, составляет 0,41 ч^-1.

Пример 2

Оценку максимальной удельной скорости роста штамма бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д проводят аналогично описанному в Примере 1, за исключением того, что минеральная среда Эванса содержит в качестве источника углерода фенантрен. Максимальная удельная скорость роста в минимальной среде, содержащей фенантрен в качестве единственного источника роста, для штамма бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д составляет 0,07 ч^-1.

Пример 3

Оценку способности к росту на различных субстратах проводят при 4° и 24°С на агаризованной среде Эванса с добавлением индивидуальных субстратов в качестве источника углерода. Результаты представлены в табл.1.

Штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д хорошо растет на средах, содержащих нафталин, фенантрен, салицилат, дибензотиофен, мазут, нефть, дизельное топливо, октан, гексадекан, способен к трансформации антрацена, пирена, аценафтена, а также продуцирует поверхностно-активные вещества (биосурфактанты).

Пример 4

Оценка продукции поверхностно-активных веществ предлагаемым штаммом бактерий при росте на среде с гексадеканом.

Штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д выращивают на минеральной среде Эванса, содержащей гексадекан (15 г/л) в качестве единственного источника углерода и энергии, при температуре 24°С в колбах Эрленмейсра на стационарной качалке (200 об/мин). Идентификацию экзометаболитов проводят методом ядерного магнитного резонанса высокого разрешения (ЯМР).

Для этого в работе используют лиофильно высушенные образцы супернатантов культуральных жидкостей, полученных при выращивании микрорганизмов на нафталине или гексадекане до стационарной или предстационарной фаз роста. Органические компоненты культуральной жидкости разделяют на условно неполярную и полярную фракции путем экстракции лиофилизата культуральной жидкости сухим хлороформом и экстракции сухим метиловым спиртом остатка лиофилизата культуральной жидкости после экстракции хлороформом.

Спектры ЯМР регистрируют на импульсном Фурье-спектрометре ЯМР типа WP80SY (Brucker, FRG) при стандартных условиях в режиме подавления сигналов протонов остаточной воды в тяжеловодных образцах.

Полученные результаты демонстрируют, что в культуральной жидкости накапливаются С7-С8 - жирные кислоты и спирты в концентрации свыше 200 мг/ л, которые играют роль поверхностно-активных веществ, что способствует растворимости гидрофобных соединений, таких как нефть и ПАУ.

Пример 5

Оценка продукции поверхностно-активных веществ при росте на среде с нафталином.

Оценку продукции поверхностно-активных веществ штаммом бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д проводят аналогично описанному в Примере 4, за исключением того, что минеральная среда Эванса содержит в качестве источника углерода нафталин (1 г/л).

Штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д выделяет в среду непредельный аналог каприловой кислоты с одной двойной связью.

Пример 6

Оценка деградации нафталина в почве.

Штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д в концентрации 10⁶ кл/г сухой почвы вносят в емкости с серой лесной почвой, загрязненной нафталином в концентрации 2,5 г/кг сухой почвы. Емкости с почвой выдерживают при температуре от 24°С в течение 10 суток. Концентрацию нафталина в почве определяют с помощью ВЭЖХ, используя в качестве стандарта нафталин фирмы «Serva» (Germany).

Штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д деградирует нафталин до нуля за 3 суток.

Пример 7

Оценка деградации фенантрена в почве.

Деградацию фенантрена оценивают в емкостях с почвой, загрязненной фенантреном в концентрации 1 г/кг сухой почвы.

Концентрацию фенантрена в почве определяют с помощью ВЭЖХ, используя в качестве стандарта фенантрен фирмы «Serva» (Germany).

Штамм бактерии Pseudomonas putida BKM В-2380Д деградирует фенантрен до нуля за 20 суток.

Пример 8

Оценка деградации нефти.

Штамм Pseudomonas putida BKM В-2380Д выращивают в колбах Эрленмейера со 100 мл минимальной среды Эванса с добавлением нефти до конечной концентрации 1,5% весовых. Инокулирование колб с нефтью проводят суспензией микроорганизмов (10 мл на 100 мл среды, посевная доза 1-5×10⁷ кл/мл). После засева колбы помещают на круговую качалку (120 об/мин) и выращивают в течение 10 суток при температуре 24°С или в течение 10 суток при температуре 4-6°С. В качестве контроля используют стерильную колбу со средой и нефтью. Степень деградации нефти определяют с помощью гравиметрического метода. Степень деградации нефти штаммом бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д при 6°С оказалась выше (29%), чем при 24°С (17%).

Таким образом, предложен плазмидосодержащий штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д, который обладает высокой деструктивной активностью в отношении полициклических ароматических углеводородов и нефти, а также способен продуцировать поверхностно-активные вещества при росте на нефти и ПАУ. Штамм бактерий Pseudomonas putida BKM В-2380Д можно использовать для очистки нефти в различных климатических условиях, в том числе и в регионах с холодным климатом.

Предложенная конъюгативная плазмида pBS1141, содержащая гены биодеградации ПАУ, способствует распространению этих генов среди аборигенных микроорганизмов и, как результат, ускоряет процесс очистки почв. На фиг.2 приведена схема организации генов катаболизма ПАУ в штамме бактерий Pseudomonas putida ВКМ В-2380Д.

Таблица 1Некоторые физиолого-морфологические свойства штамма Pseudomonas putida BKM В-2380ДРост на различных агаризованных средахСинтез сурфактантовLB (4°С)LB (24°С)LB (41°С)Сахароза (4°С)Сахароза (24°С)Сахароза (41°С)Глюкоза (4°С)Глюкоза (24°С)Глюкоза (41°С)Нефть (4°С)Нефть (24°С)Нефть (41°С)Мазут (4°С)Мазут (24°С)Мазут (41°С)Дизтопливо (24°С)Гексадекан (24°С)Октан (24°С)Фенол (24°С)Нафталин (24°С)Сацилат (24°С)Гентизат (24°С)Антрацен (24°С)Пирен (24°С)Аценафтен (24°С)Фенантрен (24°С)Дибензотиофен (24°С)-+--+--+-К+-С+-+++-++-КкК+++(-) - отсутствие роста; (С) - слабый рост; (К) - отдельные колонии; (+) - хороший рост; (++) - очень хороший рост

Таблица 2
Функциональный состав неполярных фракций органических соединений в культуральной жидкости штамма Pseudomonas putida BKM В-2380Д при росте на минеральной среде с гексадеканом.ШтаммСодержание неполярной фракции, мг/лСодержание функциональных групп, %Алкил-/структураОкси-Гидрокси-НепредельныеPseudomonas putida BKMB-2380Д210,0059/СН₃(СН₂)₆12227

Таблица 3
Функциональный состав неполярных фракций органических соединений в культуральной жидкости штамма BS3961 при росте на минеральной среде с нафталином.ШтаммСодержание неполярной фракции, мг/лСодержание функциональных групп, %Алкил-/структураОкси-Гидрокси-НепредельныеPseudomonas putida BKMB-2380Д6,0074/СН₃(СН₂)₃9,3-9,4

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к очистке объектов окружающей среды от загрязнения полициклическими ароматическими углеводородами и углеводородов нефти. Предложен штамм бактерий Pseudomonas putida ВКМ В-2380Д, продуцирующий поверхностно-активные вещества при росте на полициклических ароматических углеводородах и углеводородах нефти, для деградации полициклических ароматических углеводородов и углеводородов нефти. Штамм Pseudomonas putida ВКМ В-2380Д обладает высокой деструктивной активностью, способен к очистке почв и поверхностных вод от нефтяных загрязнений, содержащих высокие концентрации полициклических ароматических углеводородов в различных климатических условиях. 2 ил., 3 табл.

Штамм бактерий Pseudomonas putida ВКМ В-2380Д, продуцирующий поверхностно-активные вещества, для деградации полициклических ароматических углеводородов и углеводородов нефти.