ШТАММ БАКТЕРИЙ Sinorhizobium meliloti P221, ДЕСТРУКТОР ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ И СТИМУЛЯТОР РОСТА РАСТЕНИЙ ДЛЯ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ФИТОРЕМЕДИАЦИИ Российский патент 2010 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для очистки окружающей среды от загрязнения полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) с помощью микроорганизмов и растений.

Из уровня техники известен бактериальный штамм Burkholderia caryophylii Jap-3, обладающий высокой деструктивной активностью в отношении поликонденсированных ароматических углеводородов. Штамм бактерий Burkholderia caryophylii Jap-3 депонирован в Государственной коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений (ГКМ ВИЗР) под номером 151 от 18.06.2001. Идентификация штамма проведена по "Определителю микроорганизмов" Берги (1997 г.), Штамм бактерий Burkholderia caryophylii Jap-3 выделен из загрязненной поликонденсированными ароматическими углеводородами почвы в префектуре г.Токио, Япония. Штамм выделен на селективной питательной среде, содержащей в качестве единственного источника питания поликонденсированные ароматические углеводороды. Штамм отселектирован и стабилизирован по признаку высокой углеводородокисляющей активности в отношении поликонденсированных ароматических углеводородов (патент RU №2192462, кл. C12N 1/20, 10.11.2002.).

Известный штамм обладает высокой деструктивной активностью, однако бактерии рода Burkholderia часто являются фитопатогенами и их применение в открытой почве нежелательно, вследствие потенциальной опасности для произрастающих растений.

Известен штамм бактерий Pseudomonas putida, продуцирующий поверхностно-активные вещества и подвергающий деградации ПАУ и углеводороды нефти. Штамм бактерий Pseudomonas putida BS3961 был получен в результате селекции из штамма бактерий BS3701, выделенного из загрязненной отходами коксохимического производства почвы Московской области, Россия. Штамм бактерий Pseudomonas putida BS3961 отличается от исходного расширенным спектром утилизируемых углеводородов и конститутивным синтезом ферментов путей биодеградации ПАУ. Штамм бактерий Pseudomonas putida BS3961 отселектирован и стабилизирован по признаку высокой углеводородокисляющей активности в отношении полициклических ароматических углеводородов. Штамм бактерий Pseudomonas putida BS3961 депонирован в Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) под номером ВКМ В-2380Д. Штамм бактерий Pseudomonas putida ВКМ В-2380Д (патент RU 2344170, 20.01.2009, Бюл. №2).

Однако известный штамм не способен продуцировать фитогормон индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) и стимулировать рост растений в присутствии ПАУ.

Известен штамм ризосферных бактерий Bacillus spp. KR-083, используемый для защиты сельскохозяйственных растений от фитопатогенных микроорганизмов и стимуляции их роста. Штамм ризосферных бактерий Bacillus spp. KR-083 был выделен из корней риса, произрастающего в провинции Иенгнам Республики Южная Корея и депонирован под регистрационным номером «148 ВНИИСХМ-Д» от 14.07.2005 г. (патент RU 2295562, 20.03.2007, Бюл. №8).

Штамм бактерий Bacillus spp. KR-083 обладает азотфиксирующими свойствами, т.е. ростстимулирующими свойствами, однако предусмотрен для использования в чистой почве и не способен оказывать стимулирующее воздействие на рост растений в присутствии нефтесодержащих загрязнителей и разрушать ПАУ.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение, является повышение приживаемости и роста растений в условиях загрязнения почвы полициклическими ароматическими углеводородами для улучшения качества ее очистки.

Технический результат, который может быть получен при использовании заявляемого изобретения, заключается в стимуляции роста растений в условиях загрязнения почвы полициклическими ароматическими углеводородами и повышении биодеградации загрязнителя.

Штамм бактерий Sinorhizobium meliloti выделен с поверхности корней тростника южного (Phragmites australis L.), выращенного в почве, загрязненной ПАУ (80 мг/кг), в условиях вегетационного опыта. Растения вместе с комом почвы извлекали из сосуда, отбирали корни, слегка стряхивая прикрепившуюся к ним почву. Навеску корней (около 2 г) отмывали 3 раза в 0,3-литровых колбах Эрленмейера со 100 мл физиологического раствора, последовательно перенося из колбы в колбу. Из последней колбы отбирали 1 мл суспензии и готовили ряд ее последовательных десятикратных разведений. Из разведений 10^-4, 10^-5 и 10^-6 отбирали по 0,1 мл и делали высевы в 3-х повторностях на чашки с LB-агаром и со средой MSM, следующего состава (г/л): К₂НРO₄ - 0,5; КNО₃ - 2,0; NH₄Cl - 1,0; Na₂SO₄ - 2,0; MgSO₄×7Н₂О - 0,2; янтарная кислота - 1,0; FeSO₄ - следы; раствор микроэлементов (Н₃ВО₃ - 0,5; СuSO₄×5Н₂O - 0,04; KI - 0,1; FеСl₃ - 0,2; MnSO₄×H₂O - 0,4; (NН₄)₆Мо₇O₂₄×^.4Н₂O - 0,2; ZnSO₄×7H₂O - 0,4) - 1,0 мл (Muratova A., Hubner Т., Tischer S., Turkovskaya O., Moder M., Kuschk P. Plant-rhizosphere-microflora association during phytoremediation of PAH-contaminated soil. Int. J. Phytoremediation. - 2003b. - V.5, N 2. - P.137-151). Чашки с посевами инкубировали в течение 3 сут при 28°С в термостате. Для выявления микроорганизмов-деструкторов ПАУ по методу Kiyohara (Kiyohara, H., Nagao, К. and Yano, К. Rapid screen for bacteria degrading water-insoluble, soil hydrocarbons on agar plates. Appl. Environ. Microbiol. - 1982. - V.43. - P.454-457) через 3 сут инкубации поверхность среды с появившимися колониями микроорганизмов опрыскивали 3% раствором фенантрена в этиловом эфире. Наличие деструктивной активности бактерий определяли на 3-5 сут по образованию зон просветления вокруг колоний. Колонии микроорганизмов, проявивших деструктивную активность по отношению к фенантрену, отбирали и пересевали на чашки и на столбики с агаризованной средой LB, которые и использовали для кратковременного и длительного хранения культуры при 4°С. Штамм Sinorhizobium meliloti P221 отличался наличием зоны деградации ПАУ вокруг колоний, выращенных на питательной среде LB, тогда как большинство микроорганизмов-деструкторов, выделяемых методом Kiyohara, на полноценной питательной среде не проявляет деструктивной активности по отношению к ксенобиотикам.

Штамм депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ), ФГУП ГосНИИгенетика под номером В-9442 и характеризуется следующими культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими и биотехнологическими признаками.

Морфологические признаки: В мазках суточной культуры присутствуют короткие грамотрицательные палочки, иногда плеоморфные, расположенные поодиночке. Спор не образуют. Подвижные.

Кулътуральные признаки: Аэроб. Температурный оптимум 25-30°С. После инкубации на мясо-пептонном агаре через 2 сут образует округлые, выпуклые, полупрозрачные, слизистые колонии диаметром 2-4 мм. При инкубации на агаризованных средах, содержащих сахара (например, глюкозу, манит), колонии заметно более слизистые. Хорошо растет на средах, содержащих органические кислоты. Рост на скошенном мясо-пептонном агаре отчетливый по штриху на 2 сут. При росте в жидкой среде с сукцинатом (1 г/л) в условиях аэрации на качалке достигает отчетливой плотности на 2 сут.

Физиолого-биохимические признаки: Содержит гранулы поли-β-гидроксибутирата. Продуцирует оксидазу, каталазу. На OF-среде с глюкозой, галактозой, мальтозой, фруктозой, рамнозой, ксилозой, маннозой, лактозой, арабинозой, маннитом и сорбитом наблюдается кислотообразование, газ не образуется; OF-тесты с инозитом и дульцитом - отрицательные. На среде Эшби рост выраженный, сопровождается образованием большого количества слизи. Не использует цитрат (на среде Симонса). Желатину крахмал не гидролизует. Липазу, лецитиназу не образует. Пигментов не образует (в т.ч. на средах Кинг А и Кинг В). В присутствии 2,5; 6,5% NaСl наблюдается рост в мясо-пептонном бульоне.

На основании изучения указанных выше признаков, а также анализа 16 S РНК, штамм идентифицирован как Sinorhizobium meliloti.

Биотехнологические признаки:

- Способность стимулировать рост растений за счет продукции фитогормона ИУК. Синтезирует ИУК в концентрации 30-40 мкг/мл за 30 сут культивирования в среде, содержащей предшественник фитогормона аминокислоту триптофан. Продукция ИУК штаммом определяется с использованием ВЭЖХ по появлению и накоплению фитогормона.

- Способность к деградации полициклических ароматических углеводородов.

Разрушает фенантрен в концентрации 0,1-1,0 г/л за 5 сут на 90-30% соответственно при культивировании в жидкой минеральной среде, содержащей янтарную кислоту (1 г/л) или без нее. Разрушает флуорен в концентрации 0,05 г/л за 14 сут на 30% при культивировании в жидкой минеральной среде, содержащей янтарную кислоту (1 г/л) или без нее. Активность, связанная с деградацией ПАУ, определяется по убыли субстрата из среды культивирования. Остаточное содержание ПАУ определяется с использованием газовой хроматографии.

Чувствительность к антибактериальным препаратам: Штамм устойчив к ампициллину, оксациллину, линкомицину, гентамицину, карбенициллину, канамицину (до 100 мкг/мл); чувствителен к неомицину, полимиксину, тетрациклину, рифампицину, стрептомицину, мономицину.

В лабораторных условиях (не в коллекции) культуру хранят при 4°С на столбиках агаризованной среды (0,6%) LB (г): агар - 6; бактотриптон - 10; дрожжевой экстракт - 5; NaCl - 5; дистиллированная вода - 1 л; рН 7.0-7.2.

Пример 1. Влияние штамма Sinorhizobium meliloti P221 на рост и развитие растений сорго веничного (Sorghum bicolor L. Moench.), используемого для очистки грунта от ПАУ.

Бактеризацию растений сорго веничного (Sorghum bicolor L. Moench) штаммом S. meliloti P221 проводили на 4 сут после посева семян растений в вегетационные сосуды с кварцевым песком. В эксперименте использовали варианты загрязнения песка фенантреном в концентрациях 0, 10 и 100 мг/кг. Проростки сорго поливали суспендированной в среде для полива растений культурой микроорганизма до конечной концентрации микробных клеток в грунте - 10⁶ КОЕ/г. Для приготовления суспензии 3-суточную LB-агаровую культуру штамма отмывали в фосфатном (рН 7.2) буфере и ресуспендировали в среде для полива растений. Через 1 мес культивирования корневую систему растений вместе с грунтом извлекали из сосудов и отмывали 1 л деионизованной воды в течение 2 мин. Для определения биомассы растений побеги отделяли от корней, высушивали при 70°С в течение 7-9 ч до сухого состояния, определяли вес сухой наземной и подземной биомассы. Определение площади поверхности корней растений проводили с использованием метиленового синего (Sattelmacher В., Klotz F., Marschner H. Vergleich von zwei nicht-destruktiven Methoden zur bestimmung von Wurzeloberflachen. Z.Pflanzenernaehr. Bodenk. - 1983. - V.146. - P.449-459). Определение содержания ИУК в ризосферном растворе проводили с использованием ВЭЖХ. Содержание фенантрена в песке определяли после предварительной экстракции хлороформом методом ВЭЖХ на La Chrom® HPLC system (Merck, Германия) с флуоресцентным детектором и колонкой Aqua С 18 (Phenomenex, Torrance, США). В загрязненном грунте бактеризация штаммом Sinorhizobium meliloti P221 повышала приживаемость сорго на 13% и увеличивала прирост биомассы корней и побегов по сравнению с небактеризованным вариантом на 11 и 44% соответственно. Особенно отчетливо эффект инокуляции проявлялся на изменении площади корневой поверхности сорго, которая увеличивалась на 86%. Это коррелировало с увеличением в ризосфере сорго концентрации ИУК (R²=0,6981). Количество фитогормона в грунте под растениями снижалось под влиянием загрязнителя, но увеличивалось в присутствии штамма P221 в загрязненном (100 мг/кг) грунте. На основании полученных данных можно заключить, что изменение морфологии корней у бактеризованных растений являлось следствием фитогормональной активности S. meliloti P221 в ризосфере сорго, наблюдаемой в загрязненном фенантреном грунте.

Таким образом, бактеризация штаммом Sinorhizobium meliloti P221 растений сорго, используемого для фиторемедиации ПАУ-загрязненного грунта, способствовала преодолению растением поллютантного стресса, увеличивая его приживаемость и прирост биомассы в условиях загрязнения.

Содержание фенантрена в песке с небактеризованными растениями через 1 мес культивирования снизилось на 54%, а с бактеризованным штаммом Sinorhizobium meliloti P221 - на 78%. Таким образом, использование штамма для инокуляции растений-фиторемедиантов повышало эффективность очистки грунта на 24%.

Таким образом, выделенный штамм обладает свойствами деградировать ксенобиотик фенантрен и продуцировать фитогормон ИУК, что позволяет рассматривать его как перспективный инокулянт для растений, используемых в технологии фиторемедиации почв, загрязненных ПАУ. Сочетание указанных свойств может обеспечить как приживаемость и стимуляцию роста высаженных в загрязненную почву растений, так и биодеградацию загрязнителя в грунте.

Пример 2. Влияние штамма Sinorhizobium meliloti P221 на рост и развитие растений люцерны посевной (Medicago sativa L.), используемого для очистки грунта от ПАУ.

Бактеризацию растений люцерны посевной (Medicago sativa L.) штаммом S. meliloti P221 проводили на 7 сут после посева семян растений в вегетационные сосуды с кварцевым песком. В эксперименте использовали варианты загрязнения песка фенантреном в концентрациях 0, 10 и 100 мг/кг. Проростки сорго поливали суспендированной в среде для полива растений культурой микроорганизма до конечной концентрации микробных клеток в грунте - 10⁶ КОЕ/г. Для приготовления суспензии 3-суточную LB-агаровую культуру штамма отмывали в фосфатном (рН 7.2) буфере и ресуспендировали в среде для полива растений. Через 2 мес культивирования корневую систему растений вместе с грунтом извлекали из сосудов и отмывали. Для определения биомассы растений побеги отделяли от корней, высушивали при 70°С в течение 7-9 ч до сухого состояния, определяли вес сухой надземной и подземной биомассы. Содержание фенантрена в песке определяли после его предварительной экстракции хлороформом методом газовой хроматографии на хроматографе Shimadzu 2010 с использованием неполярной капиллярной колоки "Equty - 1" (Supelco, USA).

Бактеризация люцерны штаммом Sinorhizobium meliloti P221 увеличивала прирост биомассы корней по сравнению с небактеризованным вариантом на 7% - в чистом грунте и на 4 и 15% соответственно при загрязнении фенантреном в концентрациях 10 и 100 мг/кг. В чистом грунте штамм практически не оказывал влияния на прирост надземной биомассы люцерны, тогда как в грунте, загрязненном фенантреном в концентрациях 10 и 100 мг/кг надземная биомасса была на 8 и 27% больше у бактеризованных растений по сравнению с небактеризованными. Таким образом, бактеризация штаммом Sinorhizobium meliloti P221 растений люцерны, используемой для фиторемедиации ПАУ-загрязненного грунта, способствовала преодолению растением поллютантного стресса, увеличивая прирост ее биомассы в условиях загрязнения.

Через 2 мес культивирования содержание фенантрена в песке (10 и 100 мг/кг) с небактеризованными растениями снизилось на 84% и 90% соответственно, а с бактеризованным штаммом Sinorhizobium meliloti P221 - на 99% и 100% соответственно. Таким образом, использование штамма для инокуляции растений-фиторемедиантов повышало эффективность очистки грунта на 10-15%.

Пример 3. Деградация флуорена штаммом Sinorhizobium meliloti P221.

При культивировании в жидкой минеральной среде MSM, содержащей янтарную кислоту (1 г/л) или без нее, с добавлением флуорена в концентрации 0,05 г/л исследовалась деградация ПАУ (флуорена) в течение 14 сут. Анализ остаточного содержания ПАУ в среде культивирования показал, что в качестве единственного источника углерода и энергии штамм утилизировал 15% флуорена, а в присутствии косубстрата - около 30%. С использованием методов тонкослойной и газовой хроматографий было установлено, что флуорен подвергается деградации штаммом с образованием 9-гидроксифлуорена и 9-флуоренона. Таким образом, подтверждена способность штамма к деградации другого представителя ПАУ.

Пример 4. Влияние штамма Sinorhizobium meliloti P221 на рост и развитие люцерны посевной (Medicago sativa L.) и на фиторемедиацию загрязненного флуореном грунта.

Бактеризацию растений люцерны посевной (Medicago sativa L.) штаммом S.meliloti P221 проводили на 7 сут после посева семян растений в вегетационные сосуды с кварцевым песком. В эксперименте использовали загрязненный флуореном в концентрации 50 мг/кг и незагрязненный песок. Проростки люцерны поливали суспендированной в среде для полива растений культурой микроорганизма до конечной концентрации микробных клеток в грунте - 10⁶ КОЕ/г. Для приготовления суспензии 3-суточную LB-агаровую культуру штамма отмывали в фосфатном (рН 7.2) буфере и ресуспендировали в среде для полива растений. Через 2 мес культивирования корневую систему растений вместе с грунтом извлекали из сосудов и отмывали. Для определения биомассы растений побеги отделяли от корней, высушивали при 70°С в течение 7-9 ч до сухого состояния, определяли вес сухой надземной и подземной биомассы. Содержание флуорена в песке определяли после его предварительной экстракции хлороформом методом газовой хроматографии на хроматографе Shimadzu 2010 с использованием неполярной капиллярной колонки "Equty - 1" (Supelco, USA). Бактеризация люцерны штаммом Sinorhizobium meliloti P221 увеличивала прирост биомассы корней по сравнению с небактеризованным вариантом на 6% в чистом и на 10% - в загрязненном флуореном грунте. В загрязненном флуореном грунте надземная биомасса люцерны была на 14% больше у бактеризованных растений по сравнению с небактеризованными. Таким образом, бактеризация штаммом Sinorhizobium meliloti P221 люцерны, используемой для фиторемедиации ПАУ-загрязненного грунта, способствовала преодолению растением поллютантного стресса, увеличивая прирост ее биомассы в условиях загрязнения. Через 2 мес культивирования содержание флуорена в песке с небактеризованными растениями снизилось на 80%, а с бактеризованным штаммом Sinorhizobium meliloti P221 - на 97%. Таким образом, использование штамма для инокуляции люцерны посевной повышало эффективность фиторемедиации ПАУ-загрязненного грунта на 17%.

Изобретение относится к области биотехнологии и предназначено для очистки окружающей среды от загрязнения полициклическими ароматическими углеводородами (ПАУ) с помощью микроорганизмов. Штамм бактерий Sinorhizobium meliloti P221 выделен из корней тростника, выросшего в почве, загрязненной ПАУ, депонирован под регистрационным номером В-9442 в ВКПМ. Штамм является деструктором полициклических ароматических углеводородов и стимулятором роста растений, может быть использован для очистки почвы. Штамм обеспечивает повышение фиторемедиации ПАУ-загрязненной почвы.

Штамм бактерий Sinorhizobium meliloti P221, депонирован с регистрационным номером В-9442 во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, деструктор полициклических ароматических углеводородов и стимулятор роста растений для повышения эффективности фиторемедиации.