БИОПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ОТ НЕФТИ И НЕФТЕПРОДУКТОВ Российский патент 1998 года по МПК C02F3/34 B09C1/10 C12P39/00 

Изобретение относится к средствам борьбы с загрязнениями объектов окружающей среды нефтью и нефтепродуктами при помощи микроорганизмов и может быть использовано, например, при ликвидации последствий нефтяных разливов.

Известен биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, содержащий аэробные нефтеокисляющие бактерии Acenitobacter oleovorum, остатки питательных сред, стабилизирующие добавки, минеральные соли и различные наполнители, см. "Препарат бактериальный Биоприн - Б", технические условия ТУ - оп. 11249895-12-22-92, М., 1992.

Недостатком этого препарата является необходимость наличия стабилизирующих добавок для поддержания жизнедеятельности микроорганизмов. Кроме того, бактерии Acenitobacter oleovorum недостаточно активно утилизируют тяжелые фракции нефти.

Известен также биопрепарат для очистки объектов окружающей среды, преимущественно почвы и воды, включающий нефтеокисляющие бактерии, например Mycobacterium, углеводородные добавки - нормальные парафины - C₁₂-C₁₈, минеральные добавки - щавелевокислый аммоний и воду в качестве наполнителя, см. , например, патент Российской Федерации N 2053206 по кл. C 02 F 3/34 от 29.09.94 г.

Данный биопрепарат принят в качестве прототипа настоящего изобретения.

Вследствие биологических особенностей входящих в его состав микроорганизмов он имеет невысокую деструктивную активность в отношение тяжелых фракций нефти, что существенно сужает спектр действия биопрепарата. В частности, при очистке объектов от мазута этот препарат практически неэффективен. Кроме того, его недостатком является узкий диапазон pH и температуры, при которых происходит активное окисление углеводородов нефти. Биопрепарат имеет достаточную активность только при pH в пределах 6 - 7 и 20 - 40^oC.

В основу настоящего изобретения положено решение задачи создания биопрепарата для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, который имел бы более высокую деструктивную активность, в том числе в отношение тяжелых фракций нефти. Кроме того, решается задача расширения диапазона pH среды и температуры, при которых происходит активное окисление нефти и нефтепродуктов.

Согласно изобретению эта задача решается за счет того, что в биопрепарате для очистки от нефти и нефтепродуктов, включающем аэробные нефтеокисляющие бактерии, минеральные добавки и наполнитель, в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий содержится консорциум бактериальных штаммов Pseudomonas putida ПИ K_o-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus species ПИ K_y-1 при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Pseudomonas putida ПИ K_o-1 - 1 - 10
Pseudomonas fluorescens ПИ-896 - 1 - 10
Micrococcus species ПИ K_y-1 - 1 - 10
Минеральные добавки:
источник азота - 0,25 - 0,75
источник фосфора - 0,15 - 0,50
источник калия - 0,1 - 0,25
Наполнитель - Остальное
Указанные выше бактериальные штаммы выделены из почвы.

В первом конкретном примере биопрепарат содержит бактериальные штаммы: Pseudomonas putida ПИ K_o-1 - 7 мас.%, Pseudomonas fluorescens ПИ-896 - 7 мас.%, Micrococcus species ПИ K_y-1 - 7 мас.%. Данные штаммы зарегистрированы в коллекции микроорганизмов Всероссийского института растений КМЗР ВИЗР-760 и хранятся в коллекции "Полиинформ" под номерами Pseudomonas putida ПИ K_o-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus species ПИ K_y-1, на питательной среде следующего состава, г/л:
KH₂PO₄ - 2
Na₂HPO₄ - 3
MgSO₄•7H₂O - 0,5
FeCl₃•6H₂O - 0,05
CaCl₂•2H₂O - 0,01
(NH₄)₂SO₄ - 2
Агар - 20
Вода, л - До 1
При t 4^oC.

Идентификацию штаммов проводили по "Краткому определителю бактерий Берги".- М.: 1980.

Для идентификации штаммы выращивали при 28^oC в течение 36 ч на двух твердых питательных средах следующего состава, г/л:
Среда N 1
KH₂PO₄ - 2
Na₂HPO₄ - 2
MgSO₄•7H₂O - 0,5
CaCl₂•2H₂O - 0,03
NaNO₃ - 1
Агар - 20
Вода, л - До 1
Среда N 2
KH₂PO₄ - 2
MgSO₄•7H₂O - 0,3
CaCl₂ • 2H₂O - 0,03
NH₄Cl - 2
Агар - 20
Вода,л - До 1
Штамм Pseudomonas putida ПИ K_o-1 - мелкие короткие прямые подвижные одиночные палочки, имеют полярные жгутики, размеры: (0,2 - 0,3) • (0,5 - 0,8) мкм; грам (-); аэроб. Колонии штамма круглые, гладкие, с блестящей поверхностью, слегка приподнятые в центре, желтоватые, полупрозрачные, диаметром 4 - 6 мм. Штамм усваивает аммонийный и нитратный азот, каталазоположителен, образует флюоресцирующие пигменты, аргениндигидролазу, не разжижает желатину, не гидролизует крахмал, оксидазная реакция положительна. Использует в качестве источников роста глюкозу, 2-кетоглюконат, L-валин, β- аланин, DL-аргинин, углеводороды.

Штамм Pseudomonas fluorescens ПИ-896 - мелкие короткие одиночные палочки, имеют полярные жгутики, размеры: (0,1 - 0,4) • (0,6 - 0,7) мкм; грам (-), аэроб. Колонии штамма круглые, гладкие, с блестящей поверхностью, слабовыпуклые, полупрозрачные, бесцветные, диаметром 3 - 5 мм. Штамм усваивает аммонийный и нитратный азот, каталазоположителен, образует флюоресцирующие пигменты, оксидазная реакция положительна, гидролизует желатину, не гидролизует крахмал, образует аргининдидролазу. Использует в качестве источников роста глюкозу, трегалозу, 2-кетоглюконат, мезо-инозит, углеводороды, L-арабинозу, сахарозу, этиловый спирт.

Штамм Micrococcus species ПИ K_y-1 - кокки, сферические неподвижные клетки, диаметром 0,6-1,0 мкм; образуют неправильные группы или встречаются поодиночке. Колонии штамма круглые с ровным краем, теплого цвета, непрозрачные, гладкие, блестящие, диаметром 2-5 мм. Штамм усваивает аммонийный и нитратный азот, каталазоположителен, образует желтый пигмент, не гидролизует крахмал, не образует индол, образует гидролазы. Использует в качестве источников роста глюкозу, L-валин, β- аланин, углеводороды.

Для выращивания указанных микроорганизмов использована питательная среда следующего состава, г/л:
KH₂PO₄ - 2
Na₂HPO₄ - 3
MgSO₄• 7H₂O - 0,5
FeCl₃ • 6H₂O - 0,05
CaCl₂ • 2H₂O - 0,01
(NH₄)₂SO₄ - 2
Соевая мука - 5
Меласса - 20
Вода - До 1
Процесс культивирования проводился в ферментерах при 28^oC, pH 6,8 - 7,2 в течение 72 ч в аэробных условиях. В качестве индуктора использована 0,01% сырая нефть.

В качестве минеральных добавок в первом примере использованы, мас.%:
Источник
азота - карбамид - 0,6
фосфора - суперфосфат двойной - 0,30
калия - калий сернокислый для сельского хозяйства - 1,5
Наполнителем служит стерильный торф.

Титр биопрепарата 1 • 10¹² жизнеспособных клеток в 1 г препарата.

Препарат при испытаниях был внесен в керамические сосуды, наполненные почвой с различным pH (в пределах 4,5 - 8,2) и содержанием мазута 11,3 - 12,1 г/кг. Количество внесенного препарата - 1 г на 1 кг почвы. Сосуды выдерживались в термостатах в диапазоне 10 - 40^oC в течение 90 сут. Содержание мазута в почве контролировалось 1 раз в 30 дней, опыт проведен в трех повторностях. Результаты испытаний биопрепарата приведены в табл. 1.

В другом примере биопрепарат содержит, мас.%:
Pseudomonas putida ПИ K_o-1 - 6
Pseudomonas fluorescens ПИ-896 - 10
Micrococcus species ПИ K_y-1 - 1
Микроорганизмы выращены на той же питательной среде, что и в первом примере.

Минеральные добавки содержат, мас.%:
Источник
азота - сульфат аммония - 0,7
фосфора - простой суперфосфат - 0,4
калия - сульфат калия технический - 0,2
Наполнителем служит стерильный торф. Титр препарата 5 • 10¹¹ жизнеспособных клеток в 1 г препарата. Почва, подлежащая очистке, содержала сырой нефти 11,4 - 12,6 г/кг. Опыт проведен в трех повторностях. Результаты испытаний приведены в табл. 2.

В результате проведенных опытов можно констатировать весьма высокую деструктивную активность заявленного биопрепарата (70 - 90%), в том числе и в отношение тяжелых фракций нефти. При этом препарат эффективен в широком диапазоне pH и температуры очищаемой среды (pH 4,5 - 8,2, 10 - 40^oC).

Биопрепарат может быть изготовлен промышленным способом с использованием стандартного биотехнологического оборудования с применением доступных сырьевых компонентов.

Изобретение относится к средствам борьбы с загрязнениями объектов окружающей среды нефтью и нефтепродуктами. Биопрепарат включает аэробные нефтеокисляющие бактерии, минеральные добавки и наполнитель. В качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий содержится консорциум бактериальных штаммов Pseudomonas putida ПИ K_o-1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus species ПИ K_у-1 при следующем соотношении компонентов, мас.%: Pseudomonas putida ПИ K_o-1-1-10; Pseudomonas fluorescens ПИ-896-1-10; Мicrococcus spesels ПИ K_у-1-1-10, минеральные добавки: источник азота-0,25-0,75; источник фосфора-0,15-0,50; источник калия-0,1-0,25; наполнитель - остальное. Препарат эффективен в широком диапазоне температур и рН среды. 2 табл.

1. Биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов, включающий аэробные нефтеокисляющие бактерии, минеральные добавки и наполнитель, отличающийся тем, что в качестве аэробных нефтеокисляющих бактерий содержится консорциум бактериальных штаммов Pseudomonas putida ПИ К_о - 1, Pseudomonas fluorescens ПИ-896, Micrococcus species ПИ К_у - 1 при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Pseudomonas putida ПИ К_о - 1 - 1 - 10
Pseudomonas fluorescens ПИ-896 - 1 - 10
Pseudomonas species ПИ К_у - 1 - 1 - 10
Минеральные добавки:
источник азота - 0,25 - 0,75
источник фосфора - 0,15 - 0,50
источник калия - 0,1 - 0,25
Наполнитель - Остальноер