ПРЕПАРАТ ДЛЯ ОЧИСТКИ ВОДЫ И ПОЧВЫ ОТ НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2014 года по МПК B01J20/10 B01J20/283 C02F3/34 C02F1/28 B09C1/10 C12R1/125 C12R1/32 C12R1/38 C12R1/40 

Изобретение относится к области биотехнологии, экологии, охране окружающей среды, в частности, к микробиологической утилизации нефтяных загрязнений воды и почвы, дорожных и железнодорожных покрытий, обочин дорог, мостовых конструкций.

В современном развитом экономическом промышленном обществе естественным экосистемам часто угрожают такие загрязнители, как нефтяные углеводороды. Из окружающей среды эти искусственные загрязнители выводятся медленно, путем их сорбции на естественных материалах и перехода их, например, из водной фазы в осадок, где они сохраняются в течение более 25 лет, а в северных районах до 100 лет. В разложении нефтяных углеводородов принимают активное участие многочисленные виды бактерий. Эти и некоторые другие особенности природных процессов самоочищения легли в основу создания препаратов для очистки природных объектов от загрязнений нефтепродуктами.

Известен препарат для очистки сточных вод (Патент РФ 2126714 «Сорбент для очистки вод от нефти и нефтепродуктов», 1999), содержащий смесь торфа, цеолита и пенографита со смесью анионных и неионогенных поверхностно-активных веществ.

Недостатком данного препарата является продолжительное время адсорбции и необходимость последующей утилизации образовавшегося осадка. Более перспективными представляются сорбенты, содержащие природные вещества.

Известен сорбент "Нафтокс", содержащий торф, нормальный парафин C₁₂-C₁₈, аммоний щавелевокислый, воду и Rhodococcus sp. (РФ 2053205, 1996).

Однако, эффективность данного сорбента невысока. Так, за пять суток очистки поверхности она составила только около 60%.

Известен сорбент для очистки природных систем, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, содержащий инертный пористый носитель на основе алюмосиликатного сырья (глины) 90-99,99% и консорциума микроорганизмов - штаммы Rhodococcus sp 367-2, Rhodococcus maris 367-5, Rhodococcus ecugthropolis 367-6, Pseudomonas strutreri 367-1, Yarrowiaipolytica 367-3 (RU 2104249, 1998).

Однако, носитель на глинистой основе не обладает развитой поверхностью пор и легко вымывается из почвы дождем, что снижает эффективность его практического применения в природных условиях.

Известен препарат «Сорбойл», который производится и применяется в промышленных масштабах с 2006 года НПО «Полипром». Способ приготовления препарата «Сорбойл» защищен патентом РФ №2219134 от 20.12.03 г. «Способ очистки водной поверхности от нефтяных загрязнений». В качестве сорбента в препарате применяют торф, который предварительно модифицируют путем высушивания при 100-120°C.

К недостаткам данного препарата можно отнести неопределенность его состава и сильную зависимость от используемого сырья. Кроме того, препарат утилизирует только ограниченную часть нефтепродуктов и не утилизирует другие существенные компоненты нефти.

Известен препарат для очистки природных вод и почвы от нефтяных загрязнений «МОСКАТ» (РФ 2143947, 2000). В качестве носителя "МОСКАТ" содержит термообработанные перлит или вермикулит, дополнительно содержит аммиачную селитру и суперфосфат, содержащий алюмосиликатный носитель, и микроорганизмы рода Rhodococcus sp. Недостатком данного препарата является использование одного вида микроорганизма, что не обеспечивает полной деградации различных нефтяных фракций.

Известен «Экобиопрепарат» для очистки воды от нефтепродуктов», созданный на основе деструктурирующего нефть штамма Pseudomonas fluorescens ВКПМ 6844, искусственно иммобилизованного на сорбенте-носителе (РФ 2393215, 2010).

К недостаткам данного препарата также можно отнести использование лишь одного вида микроорганизма и неполную деградацию различных фракций нефти.

Известен «Способ получения адсорбента для очистки воды от нефтепродуктов» (Патент РФ 2296008, 2005) на основе минеральных носителей, преимущественно алюмосиликатных, и может быть использовано для очистки воды от эмульгированных и растворенных нефтепродуктов, а также от аварийных разливов нефтепродуктов на воде, почве и твердых поверхностях.

К недостаткам этого способа можно отнести низкую степень адсорбции и быстрое вымывание свободных бактерий из почвы.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому изобретению можно отнести бактериальный препарат «Фежел-био», который создан на основе органического субстрата из нефтеокисляющих бактерий Mycobacterium flavesens ВКПМ В-6000, Mycobacterium sp. ИЖ4, Rhodococcus sp. 56д, Acinetobacter sp. HB-1. Органический субстрат содержит воду, тиомочевину и сахар. Входящий в препарат «Фежел-био» сорбент "Фежел" (ТУ 113-07-11.051-90) представляет собой гранулы древесной целлюлозы, покрытые слоями сорбирующего вещества ферроцианида железа (РФ 2191753, 2002).

К основным недостаткам данного препарата следует отнести необходимость предварительного обезвоживания микробной биомассы до смешения с сорбентом-наполнителем в связи с их низкой влагоемкостью, что приводит к существенному повышению стоимости (в 3-4 раза) препарата. Это является важнейшим фактором ограничения широкого промышленного использования полученного препарата. Кроме того, данный препарат эффективен только при положительных температурах выше +5°C.

Задачей настоящего изобретения является создание препарата на основе природных компонентов, обладающего высокой эффективностью биодеградации различных фракций нефти, включая биодеградацию при низких (в том числе отрицательных) температурах.

Поставленная задача решается тем, что предложен препарат для очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений, включающий ассоциацию нефтеокисляющих микроорганизмов: Bacillus subtilis BKM B-81, Pseudomonas spp. ВКМ В-892, Pseudomonas putida ВКМ В-130, Rhodococcus sp. BKM Ac-950, Micobacterium flavescens BKM Ac-141 - 75-85% от общего количества клеток с почвенными бактериями Agrobacteium radiobacter BKM B-1219 - 15-25% от общего числа клеток, содержащий криопротектор - глицерин и микроудобрения (азотнокислый натрий 0,5% и фосфорнокислый калий 0,5%) при следующем соотношении компонентов (масс.%):

Цеолит 94±1 Аэросил А-300 3±0.5 Глицерин 1±0.2 Азотнокислый натрий 0.5±0.2 Фосфорнокислый калий 0.5±0.2 Ассоциация нефтеокисляющих   микроорганизмов с Agrobacteium   radiobacter B-1219 в эффективном   количестве 2-3*10⁸ кл/г 1±0.5

Также, задача решается за счет способа получения препарата, предусматривающего выращивание ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов, причем фракцию почвенных бактерий выращивают отдельно, затем концентрированную суспензию микроорганизмов смешивают с цеолитом, который предварительно дробят до гранул размером 0.1-0.5 мм, выдерживают в печи при температуре 250°C до стадии вспучивания, охлаждают до температуры 20°C при влажности 10-12%, вносят Аэросил А-300 и перемешивают в смесителе. Соотношение полученного сорбента и концентрата бактериальной ассоциации равно 9:1.

Все используемые в препарате штаммы хранятся во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН им. Г.К. Скрябина в г. Пущино по договору №71/11 от 19.10.2011.

Предложенный препарат отличается от прототипа тем, что:

- Используют ассоциацию нефтеокисляющих микроорганизмов (концентрация 1-2*10¹¹ кл/г, 75-85% от общего количества клеток) в совокупности со структурирующими почву ризосферными бактериями (0,4-0,5*10¹¹ кл/г, 15-25% от общего количества клеток). Ассоциация микроорганизмов подобрана так, что различные штаммы деградируют определенные группы углеводородов. По токсикологическим показателям подобранная ассоциация штаммов не обладает токсигенным действием в дозе 10¹¹ микробных тел, кожно-резорбтивным и аллергическим действием в дозе 10⁹ микробных тел.

- В качестве сорбента используют цеолит Бадинского месторождения (ОАО «Бадинские цеолиты», «Компания Велант Консалтинг»). Технология приготовления сорбента включает в себя следующие этапы:

- измельчение и прокаливание исходного сырья цеолита в печи при 250°C в течение 30 мин для получения мелкодисперсного дегидратированного сорбента-носителя, что увеличивает сорбционную способность цеолита в десятки раз.

- опудривание обезвоженного мелкодисперсного цеолита наночастицами Аэросил А-300 для образования псевдо сжиженного состава.

- смешивание полученного сорбента с концентратом бактериальной ассоциации 1-2*10¹¹ кл/мл в соотношении 9:1. Это обеспечивает увеличение срока хранения препарата при положительных температурах.

- В качестве криопротектора используют глицерин для расширения диапазона рабочих температур. В результате применения криопротектора входящие в ассоциацию бактерии утилизируют нефть и ее производные при температуре от -5°C до 30°C. Наличие микроудобрений ускоряет рост ассоциации бактерий.

- в качестве микроудобрения используют азотнокислый натрий (0,5%) и фосфорнокислый калий (0,5%).

Преимуществом предлагаемого препарата перед прототипом является то, что иммобилизованные на природном цеолите с Аэросилом А-300 и криопротектором клетки защищены и менее подвержены неблагоприятным воздействиям окружающей среды, не поддаются быстрому вымыванию из почвы неблагоприятными природными факторами, утилизируют нефть и нефтепродукты даже при отрицательных температурах. Наличие в ассоциации почвенных ризосферных бактерий способствует восстановлению вегетативной продуктивности почвы.

Вышеуказанный состав препарата подобран экспериментально с учетом максимальной эффективности и прочной иммобилизации микроорганизмов на носителе. Входящие в препарат культуры непатогенны, нетоксичны и нетоксигенны.

Готовый препарат используют для покрытия поверхностей почвы, дорожных и железнодорожных покрытий, обочин дорог, мостовых конструкций и проч. Периодически препарат обновляют (2-4 раза в сезон). Процесс очистки почвы идет непрерывно. В случае аварийных разливов нефтепродуктов количество препарата локально увеличивают.

Расход препарата для обработки поверхности почвы, загрязненной нефтепродуктами в концентрации 100 г/м², составляет 100-150 г/м².

Срок хранения - 1,5 года при температуре не выше 25°C.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Препарат получают следующим образом. Цеолит дробят до гранул дисперсностью 0.1-0.5 мм, выдерживают в печи при температуре 250°C до стадии вспучивания, затем охлаждают до температуры 20°C при влажности 10-12%. Затем вносят Аэросил А-300 и перемешивают в смесителе. Приготовленный носитель далее называют сорбентом.

Ассоциацию нефтеокисляющих бактерий выращивают в ферментере БИОР-75 под контролем основных параметров культивирования (pH, Т°C, парциальное давление растворенного молекулярного кислорода, скорость перемешивания, расход воздуха на аэрацию). Отдельно выращивают в ферментере фракцию почвенных бактерий. Процесс культивирования заканчивают по достижении стационарной фазы роста, после чего две полученные культуральные жидкости смешивают (75% ассоциации нефтеокисляющих бактерий и 25% ризосферных почвенных бактерий) и концентрируют на микрофильтрационной установке МР-2,0 до концентрации не менее 2*10¹¹ кл/мл и обезвоживают методом контактной сорбционной сушки. В концентрированную суспензию вносят криопротектор следующего состава: 10% глицерина, 5% азотнокислого натрия, 5% фосфорнокислого калия. Модифицированный цеолит (сорбент) смешивают с полученной суспензией в соотношении 9:1 и проводят процесс контактно-сорбционного обезвоживания КСО. В результате концентрация микроорганизмов и веществ в полученном препарате уменьшается в 10 раз. Сухой препарат фасуют в герметичную тару.

Конечный состав полученного препарата включает (масс.%):

Цеолит 94±1 Аэросил А-300 3±0.5 Глицерин 1±0.2 Азотнокислый натрий 0.5±0.2 Фосфорнокислый калий 0.5±0.2 Ассоциация нефтеокисляющих   микроорганизмов с Agrobacteium   radiobacter В-1219 в эффективном   количестве 2-3*10⁸ кл/г 1±0.5

В 100 мл колбы с физраствором вносят по 20 г модельной нефти, содержащей бензин, керосин, нафталин, пентакан, гексадекан, фенилдекан, пристан, фирен, фенантрен, аценафтен. Одна колба была контрольной. В три другие колбы с таким же содержанием модельной нефти добавляли соответственно препараты «МОСКАТ», «Фежел-био» и предлагаемый в весовом количестве 1%. Опыт повторили 3 раза. Все три колбы культивировали при 28°C со встряхиванием на качалке в течение 3 дней. Результаты опыта показали, что в колбе с препаратом «МОСКАТ» нефть утилизировалась на 50-55% (линейные углеводороды) и 5-10% (циклические углеводороды), «Фежел-био» - на 70-75% (линейные углеводороды) и 40-45% (циклические углеводороды), тогда как в колбе с предлагаемым препаратом на 90-95% (линейные углеводороды) и 80-85% (циклические углеводороды).

Эксперименты показали, что повышение концентрации нефтеокисляющих бактерий в ассоциации до 10⁹ кл/мл не приводит к повышению эффективности препарата, тогда как сложность и затраты на приготовление препарата резко возрастают. Наоборот, снижение концентрации бактерий в ассоциации до 10⁶ кл/мл заметно снижает его эффективность. Таким образом, концентрация 2-3*10⁸ кл/г в ассоциации является оптимальной как с точки зрения эффективности, так и себестоимости приготовления препарата (Табл.1).

Таблица 1. Степень деградации нефти в модельном эксперименте при использовании разных концентраций микроорганизмов в предлагаемом препарате. Концентрация микроорганизмов в ассоциации препарата Степень деградации линейных углеводородов (%) Степень деградации циклических углеводородов (%) 2-3*10⁸ кл/г 90-95 80-85 5*10⁶ кл/г 40-45 35-40 1*10⁹ кл/г 90-95 80-85

Пример 2. Препарат следующего состава (масс.%):

Цеолит 94±1 Аэросил А-300 3±0.5 Глицерин 1±0.2 Азотнокислый натрий 0.5±0.2 Фосфорнокислый калий 0.5±0.2 Ассоциация нефтеокисляющих   микроорганизмов с Agrobacteium   radiobacter B-1219 в эффективном   количестве 2-3*10⁸ кл/г 1±0.5

Испытывали в мае 2010 года на берегу реки Оки после разлива мазутного топлива возле Симферопольского моста в зоне добычи и вывоза речного песка. Препарат наносили на сильно загрязненные участки земли в количестве от 100 до 200 г/м2. Концентрация нефтепродуктов местами достигала 100%. После 3 дней очистки мазут практически полностью впитался в адсорбент и утилизировался (на 90-95%). Количество нефтеокисляющих бактерий на поверхности почвы составило 10⁸-10⁹ кл/мл, что свидетельствует о микробиологической природе очистки. Аналогичное применение препарата «МОСКАТ» продемонстрировало более низкую его эффективность (нефть утилизировалась на 60-65%), «Фежел-био» - 80-85%

Пример 3. Испытания препарата следующего состава (масс.%):

Цеолит 94±1 Аэросил А-300 3±0.5 Глицерин 1±0.2 Азотнокислый натрий 0.5±0.2 Фосфорнокислый калий 0.5±0.2 Ассоциация нефтеокисляющих   микроорганизмов с Agrobacteium   radiobacter В-1219 в эффективном   количестве 2-3*10⁸ кл/г 1±0.5

проводили в октябре 2010 года на автозаправочной станции 9 км Балабановского шоссе с целью оценки эффективности очистки почвы вокруг бензозаправки. После сравнения через месяц (в ноябре 2010 г.) обработанной и необработанной препаратом территориальных зон вокруг автозаправки, было показано отсутствие загрязнений в обработанной зоне, тогда как бензопродукты в необработанной зоне многократно превышали допустимую норму.

Пример 4. Испытание препарата «Эконефтосил», следующего состава (масс.%):

Цеолит 94±1 Аэросил А-300 3±0.5 Глицерин 1±0.2 Азотнокислый натрий 0.5±0.2 Фосфорнокислый калий 0.5±0.2 Ассоциация нефтеокисляющих   микроорганизмов с Agrobacteium   radiobacter В-1219 в эффективном   количестве 2-3*10⁸ кл/г 1±0.5

проводили в октябре 2010 г. на базе нефтеперерабатывающего комбината г. Дзержинск с целью оценки эффективности очистки почвы от нефти. Испытания проводили на специально оборудованной для этого площадке. Препарат вносили на очищаемую почву в количестве 150 г/м. Концентрация нефти в почве составляла 100 мг/кв.м и 1000 мг/кв.м. После трехдневной очистки почвы химические анализы показали, что уровень нефти в очищенной почве снизился соответственно до 6,5 и 45 мг/л, что говорит о том, что уровень очистки почвы составил соответственно 94 и 95%.

Пример 5. Испытания биопрепарата «Эконефтосил», следующего состава (масс.%):

Цеолит 94±1 Аэросил А-300 3±0.5 Глицерин 1±0.2 Азотнокислый натрий 0.5±0.2 Фосфорнокислый калий 0.5±0.2 Ассоциация нефтеокисляющих   микроорганизмов с Agrobacteium   radiobacter В-1219 в эффективном   количестве 2-3*10⁸ кл/г 1±0.5

проводились в октябре 2010 г. на базе Серпуховской бумажной фабрики с целью очистки от нефтепродуктов на поверхности почвы. Масло, разлитое по поверхности почвы, сверху засыпалось препаратом, который наносили в количестве 150 г/м. После 3 суток действия препарата химический анализ показал, что количество остаточного масла в почве снизилось до 0,002 г/л, а степень очистки почвы составила 98,8%.

Расчетная стоимость 1 тонны предлагаемого препарата составляет 70 тысяч рублей, что необходимо для обработки 2500 м² загрязненной нефтепродуктами поверхности и в два раза эффективнее по сравнению с существующими аналогами.

Таким образом, преимуществом предлагаемого препарата, по сравнению с препаратом «Фежел-био», является то, что за счет использования криопротектора, он эффективно (на 90-98%) и в короткий срок (2-3 суток) утилизирует простые линейные, ароматические, полиароматические, циклические, непредельные, изопреновые углеводороды нефти, а также бензин, дизельное топливо, мазут, керосин при температурах до -5°C, а включение в ассоциацию почвенных бактерий способствует процессу биоремедиации (восстановления плодородия) зараженных участков почвы. Себестоимость препарата «Эконефтосил» существенно (в 3-4 раза) ниже, чем «Фежел-био» за счет использования природных цеолитов качестве сорбента.

Выбранный способ обезвоживания позволяет увеличить срок хранения препарата и способствует снижению себестоимости продукта.

Препарат непатогенен, нетоксичен, не загрязняет окружающую среду.

Срок хранения - 1,5 года при температуре не выше 25°C.

Группа изобретений относится к области биохимии, экологии, охране окружающей среды. Предложен препарат для очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений, содержащий микроорганизмы - деструкторы нефти, сорбент, криопротектор - глицерин, микроудобрения - азотнокислый натрий 0,5% и фосфорнокислый калий 0,5%. В качестве деструкторов нефти он содержит ассоциацию нефтеокисляющих микроорганизмов: Bacillus subtilis ВКМ В-81, Pseudomonas spp. BKM B-892, Pseudomonas putida BKM В-1301, Rhodococcus sp. BKM Ac-950, Mycobacterium flavescens BKM Ac-1415 в количестве 75-85% от общего числа клеток, а также почвенные бактерии Agrobacteium radiobacter BKM В-1219 в количестве 15-25% от общего числа клеток. Сорбент в препарате представляет собой мелкодисперсный дегидратированный цеолит с размером гранул 0,1-0,5 мм, опудренный наночастицами Аэросила А-300. При этом соотношение компонентов в препарате (масс.%) следующее: цеолит - 94±1, Аэросил А-300 - 3±0.5, глицерин - 1±0.2, азотнокислый натрий - 0.5±0.2, фосфорнокислый калий - 0.5±0.2, ассоциация нефтеокисляющих микроорганизмов с Agrobacteium radiobacter в эффективном количестве 2-3*10⁸ кл/г - 1±0.5. Также предложен способ получения препарата. Выращивают отдельно ассоциацию нефтеокисляющих бактерий и фракцию почвенных бактерий. После чего две полученные культуральные жидкости смешивают в соотношении 75-85% ассоциации нефтеокисляющих бактерий от общего количества клеток и 15-25% почвенных бактерий от общего количества клеток. Концентрируют суспензию до концентрации 2*10¹¹ кл/мл. Цеолит предварительно дробят до гранул размером 0.1-0.5 мм, выдерживают в печи при температуре 250°C до стадии вспучивания, охлаждают до температуры 20°C при влажности 10-12% и смешивают с Аэросилом А-300. В концентрированную суспензию вносят глицерин, азотнокислый натрий, фосфорнокислый калий, затем смешивают с цеолитом. При этом полученный цеолит и концентрированную суспензию смешивают в соотношении 9:1. Затем проводят процесс контактно-химического обезвоживания. Изобретения позволяют на 90-98% и в короткий срок (2-3 суток) утилизировать углеводороды нефти, а также бензин, дизельное топливо, мазут, керосин при температурах до -5°C. Сухая форма препарата позволяет увеличить срок его хранения до 1,5 года при температуре не выше 25°C. 2 н.п. ф-лы, 1 табл., 5 пр.

1. Препарат для очистки воды и почвы от нефтяных загрязнений, содержащий микроорганизмы - деструкторы нефти, сорбент, микроудобрения, отличающийся тем, что в качестве деструкторов нефти он содержит 75-85% от общего количества клеток ассоциацию нефтеокисляющих микроорганизмов: Bacillus subtilis ВКМ В-81, Pseudomonas spp. ВКМ В-892, Pseudomonas putida ВКМ В-1301, Rhodococcus sp. ВКМ Ac-950, Mycobacterium flavescens ВКМ Ac-1415, a также почвенные бактерии Agrobacteium radiobacter ВКМ В-1219 - 15-25% от общего числа клеток, криопротектор - глицерин, сорбент, представляющий собой мелкодисперсный дегидратированный цеолит с размером гранул 0,1-0,5 мм, опудренный наночастицами Аэросила А-300, микроудобрения - азотнокислый натрий 0,5% и фосфорнокислый калий 0,5%, при следующем соотношении компонентов (масс.%):
Цеолит 94±1 Аэросил А-300 3±0.5 Глицерин 1±0.2 Азотнокислый натрий 0.5±0.2 Фосфорнокислый калий 0.5±0.2 Ассоциация нефтеокисляющих   микроорганизмов с Agrobacteium   radiobacter ВКМ В-1219 в эффективном   количестве 2-3*10⁸ кл/г 1±0.5

2. Способ получения препарата по п.1, предусматривающий выращивание ассоциации нефтеокисляющих микроорганизмов, смешивание с сорбентом, отличающийся тем, что выращивают отдельно ассоциацию нефтеокисляющих бактерий и фракцию почвенных бактерий, после чего две полученные культуральные жидкости смешивают в соотношении 75-85% ассоциации нефтеокисляющих бактерий от общего количества клеток и 15-25% почвенных бактерий от общего количества клеток, концентрируют до концентрации 2*10¹¹ кл/мл, в концентрированную суспензию вносят криопротектор - глицерин, азотнокислый натрий, фосфорнокислый калий, затем смешивают с цеолитом, который предварительно дробят до гранул размером 0.1-0.5 мм, выдерживают в печи при температуре 250°C до стадии вспучивания, охлаждают до температуры 20°C при влажности 10-12% и смешивают с Аэросилом А-300, при этом полученный сорбент и концентрированную суспензию смешивают в соотношении 9:1, затем проводят процесс контактно-химического обезвоживания.