СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЖЕЛЕЗОСОДЕРЖАЩЕЙ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ ДОБАВКИ К ПИЩЕ Российский патент 2009 года по МПК A23L1/30 A23L1/304 

Предлагаемое изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к биологически активным добавкам на основе молочного сырья и железа.

Известно, что дефицит железа приводит к повышению ломкости волос и ногтей, воспалению органов рото- и носоглотки, изменению характера вкусовых ощущений, снижению функции щитовидной железы и активности иммунной системы, повышению восприимчивости организма к различным инфекциям и, как следствие, к развитию железодефицитной анемии (ЖДА).

Железодефицитные состояния по-прежнему остаются актуальной, и во многих отношениях не решенной проблемой современной медицины. Для профилактики и лечения железодефицитных состояний принимаются препараты, содержащие железо. В медицинской и ветеринарной практике железосодержащие препараты применяются внутрь и парентерально (внутримышечно или внутривенно).

Препараты для парентерального применения представлены комплексными соединениями - декстраном, декстрином, сахаратом, глюконатом и сорбитолом (см.: Чернов В.М. «Применение внутримышечных препаратов железа в клинической практике» // Гематология и трансфузиология, 2004, т.49, № 3, с.27).

Имеются данные, что многократное введение декстрана железа в один и тот же участок мышцы может способствовать канцерогенезу. Кроме того, ионные парентеральные ферропрепараты вызывают достаточно серьезные побочные проявления: боль в месте введения, вкус железа во рту, снижение аппетита, лихорадку, крапивницу, артралгии, астму, тошноту и расстройства кровообращения (см.: «Дефицит железа у детей: проблемы и решения» Т.В.Казаков и др. // Consillium-Medicum приложение, 2002, т.4, № 3, с.15-17). Глюконат железа для внутривенного введения настолько токсичен, что может применяться только в режиме низких доз. Декстранат железа имеет невысокий, но значительный риск анафилаксии (см.: Чернов В.М. «Применение внутримышечных препаратов железа в клинической практике» // Гематология и трансфузиология, 2004, т.49, № 3, с.27).

Препараты для внутреннего применения представлены сульфатом железа (актиферрин, сорбифер дурулес, конферон, тардиферон, ферроплекс), хлоридом железа (гемофер, сироп алоэ с железом), глюконатом железа (апаферроглюконат), фумаратом железа (ферретоаб), а также препаратом трехвалентного железа - мальтофером (см.: Воробьев П.А. Анемичный синдром в клинической практике. - М.: Ньюдиамед, 2001. - 168 с.).

Лечение пероральными препаратами железа, чаще всего солевыми и двухвалентными, эффективно, просто, дешево, но ограничено побочными эффектами, плохой всасываемостью солевых препаратов железа.

Известен железосодержащий препарат Ферпос для профилактики алиментарной анемии, содержащий катионное двухвалентное железо с концентрацией 1,0±0,15% (см.: Заявка РФ № 92006763, кл. А61K 35/24, 1992 г.).

Однако данный препарат имеет невысокую биологическую активность за счет низкого содержания железа.

Известен железосодержащий препарат Ферокс для профилактики алиментарной анемии с концентрацией двухвалентного железа 1,0±0,15% (см.: Заявка РФ № 92006855, кл. А61K 33/26, 1995).

Однако препарат также имеет невысокую биологическую активность за счет низкого содержания железа.

Недостатком вышеназванных известных решений является то, что железо в этих препаратах, хоть и находится в двухвалентной форме, но в процессе усвоения может подвергнуться быстрому химическому окислению, что впоследствии приведет к образованию нерастворимого Fe³⁺, который не усваивается организмом, накапливается в нем, вызывая тем самым, эффект отравления.

Связывать железо и оставлять его в усвояемой форме способны аминокислоты. Дело в том, что ионы железа, находясь в оболочке аминокислоты, не требуют дополнительных превращений в организме, они являются готовыми к использованию и транспортировке клетками эпителия тонкой кишки, где происходит основной процесс усвоения. Такой процесс называется «хелатированием». Употреблять нехелатированные минеральные вещества (в том числе и железо) означает подвергать организм еще большей нагрузке, так как он пытается выделить дополнительные аминокислоты, необходимые для процесса хелатирования. Другими словами, организм будет пытаться самостоятельно хелатировать минеральные вещества, но этим перегрузит систему и растратит те аминокислоты, которые должны использоваться в других процессах.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому изобретению является получение биологически активной добавки к пище "Magni Fe++", содержащей 20 мг двухвалентного железа в виде аминокислотного хелата (см.: Шарманов Т.Ш. Отчет центра экспертизы БАД по клинической апробации биологически активной добавки "Magni Fe++", 2003 г.).

Недостатком данного препарата является то, что при его изготовлении не предусмотрена подготовка желудочно-кишечного тракта к оптимальному усвоению железа.

Установлено, что существует причинная связь между слизистой желудка и дефицитом железа, что имеет непосредственное отношение к патогенезу железодефицитного состояния. У подавляющего числа больных ЖДА при биопсии слизистой оболочки желудка обнаружены морфологические изменения от поверхностного гастрита до глубокой атрофии железистого аппарата. В настоящее время считается, что морфофункциональные изменения слизистой оболочки желудка при ЖДА носят вторичный характер и являются не причиной, а следствием железодефицита (см.: "Способ лечения железодефицитной анемии" патент RU 2272641 С2, 27.03.2006 Бюл. №9).

С учетом имеющихся недостатков железосодержащих препаратов поиск новых биологически активных добавок для профилактики и лечения железодефицита остается актуальным.

Задачей настоящего изобретения является создание биологически активной добавки к пище, обогащенной усвояемым хелатированным железом, на основе пропионовокислых бактерий для восполнения недостатка железа в организме и профилактики ЖДА.

Технический результат настоящего изобретения состоит в повышении усвояемости железа организмом, сокращении срока усвоения за счет подготовки пропионовокислыми бактериями пищеварительного тракта к приему биодоступного хелатного железа, увеличении количества жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий.

Проведенные исследования по данной проблеме не выявили способов, идентичных предложенному.

Указанный технический результат достигается тем, что согласно изобретению, в приготовленную питательную среду на основе осветленной творожной сыворотки вносят хелатирующий агент в виде раствора казеиновых фосфопептидов в количестве 15-20% от объема питательной среды и сульфат железа в количестве 0,35-0,45 мг/мл, среду стерилизуют, охлаждают, вносят 3-5% активизированных культур пропионовокислых бактерий и проводят культивирование.

Существенными отличительными признаками заявляемого способа являются: использование в качестве хелатирующего агента раствора казеиновых фосфопептидов и культивирование среды активизированными культурами пропионовокислых бактерий. Железо в питательную среду вводится в виде двухвалентной соли (FeSO₄).

Пропионовокислые бактерии (ПКБ) являются представителями нормальной микрофлоры желудочно-кишечного тракта человека и животных, обладают морфокинетическим действием, образуют ферменты, участвующие в метаболизме белков, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот, продуцируют биологически активные соединения, в частности витамин В12, выполняют иммуногенную и антимутагенную функцию, а также участвуют в детоксикации экзо- и эндогенных токсических агентов. Пропионовокислые бактерии положительно влияют на пристеночное пищеварение, абсорбируя промежуточные метаболиты, в состав которых могут входить и микроэлементы, конкурирующие с железом при всасывании (см.: Воробьева Л.И. Пропионовокислые бактерии. М.: Изд-во МГУ, 1995. 380 с). Поэтому использование ПКБ в заявляемом способе позволит подготовить слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта и улучшить всасывание ионов железа и тем самым ускорит темп нормализации гематологических показателей.

В качестве инокулята в заявленном способе использовались активизированные культуры пропионовокислых бактерий разных штаммов: Propionibacterium freudenreichii subsp.shermanii типа AC-2503, Propionibacterium freudenrichii subsp.fredenreichii типа AC-2500 и Propionibacterium cyclohexanicum Kusano типа AC-2260, полученных из фонда BKM Института Биохимии и Физиологии Микроорганизмов (Москва).

Авторами было исследовано влияние различных доз сульфата железа на биохимическую активность указанных микроорганизмов с целью использования их при производстве железосодержащей БАД. Для оценки влияния железа на рост пропионовокислых бактерий сравнивали количество жизнеспособных клеток по окончании процесса культивирования, а также удельные скорости роста культур в каждом варианте опыта. За контроль взята среда без добавления сульфата железа. Результаты представлены в таблице и на фиг.1.

 Влияние железа на рост пропионовокислых бактерийШтаммКоличество жизнеспособных клеток (КОЕ/см³) при добавлении FeSO₄ в питательную среду в следующих количествах:контроль0,15 мг/мл0,25 мг/мл0,35 мг/мл0,45 мг/мл0,55 мг/млPropionibacterium freudenrichii subsp.fredenreichii АС-25003·10¹⁰2·10¹⁰3·10¹¹2·10¹¹1·10¹¹1·10¹⁰Propionibacterium cyclohexanicum Kusano AC-22601·10¹⁰3·10¹⁰2·10¹¹3·10¹¹4·10¹¹3·10¹⁰Propionibacteriumfreudenreichii subsp.shermanii AC-25033·10¹⁰4·10¹⁰2·10¹¹3·10¹¹1·10¹²3·10¹⁰

Из данных таблицы видно, что при концентрации железа в среде 0,25-0,45 мг/мл количество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий повышается и составляет в среднем 2,5·10¹¹ КОЕ/см³, что на порядок выше, чем в среде без железа (см. контроль). Поскольку количество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий почти во всех опытных образцах было выше контрольного, можно утверждать о возможности интенсификации микробиологического роста ПБК посредством сульфата железа.

Из фиг.1 видно, что повышение концентрации FeSO₄ в среде до 0,35 мг/мл для P. freudenrichii subsp. fredenreichii АС-2500 и 0,45 мг/мл для остальных штаммов приводит к значительному увеличению скорости роста (почти в 2 раза). Стимулирующее действие сульфата железа вероятно связано с тем, что при таких концентрациях ионы Fe²⁺ создают в среде низкий окислительно-восстановительный потенциал - необходимое условие развития пропионовокислых бактерий, а также с детоксикацией продуктов метаболизма кислорода. Увеличение концентрации сульфата железа в среде до 0,55 мг/мл приводит к замедлению скорости роста культур, можно предположить, что происходит перенасыщение среды ионами железа.

Следует отметить, что наибольшее стимулирующее воздействие сульфат железа проявил по отношению к Propionibacterium freudenreichii subsp.shermanii типа AC-2503.

С учетом удовлетворения суточной потребности взрослого человека в железе, количество вносимого в питательную среду FeSO₄ установлено из расчета 0,35-0,45 мг/мл, что, при дозированном приеме добавки составляет 30% от суточной нормы потребления железа. При этом наблюдается активный рост пропионовокислых бактерий (см. фиг.1 и табл.1).

Для предотвращения окисления железа и сохранения его в усвояемой двухвалентной форме в заявленном способе используют раствор казеиновых фосфопептидов.

Казеиновые фосфопептиды (CPP_S) - это фосфолированные пептиды, образующиеся из казеинов коровьего молока при их переваривании пищеварительными протеинадами. CPP_S способны связывать минеральные вещества и поддерживать их в растворимом состоянии в щелочной зоне рН тонкой кишки. Кроме того, казеиновые фосфопептиды устойчивы к интенсивному протеолизу и накапливаются в дистальном отделе тонкой кишки, где усиливают пассивный транспорт минеральных элементов в циркуляцию. Способность CCP_S связывать (хелатировать) железо обусловлена присутствием в структуре входящих аминокислот анионного гидрофильного участка (см.: Гаппаров М.М, Стан Е.Я. Влияние казеиновых фосфопептидов на биодоступность алиментарных минералов // Вопросы питания, № 6, 2003, с.41-44).

Авторами изучено влияние различного количества в среде раствора CPP_S на биодоступность железа (сохранение его в растворенной, хелатной, двухвалентной форме). За процессом связывания железа следили по количеству железа, которое не подвергнулось химическому окислению, а осталось в усвояемой, двухвалентной форме от первоначальной дозы внесения. За контроль взята среда без добавления CPP_s. Результаты исследований представлены на фиг.2.

Как видно из фиг.2, наличие в среде казеиновых фосфопептидов значительно способствует хелатированию железа и сохранению его в виде растворимых ионов Fe²⁺. Так, в средах, содержащих CPP_s, в органической растворенной форме осталось почти в 4 раза больше вносимого сульфата железа, чем в среде, не содержащей фосфопептиды. Следовательно, железо в таких БАДах усвоится намного лучше и основное его количество останется в тканях организма.

Следует отметить, что в зависимости от дозы вносимого FeSO₄, казеиновые фосфопептиды в средах проявили различную способность связывать железо. Так, было установлено, что добавление в питательную среду 0,45 мг/мл FeSO₄ и 15-20% раствора казеиновых фосфопептидов позволит оставить в усвояемой форме до 70-80% вносимого сульфата железа; тогда как при внесении 10% CPP_s в усвояемой форме остается только 45-50% вносимого FeSO₄. Это объясняется тем, что молекулы CPP_s могут связывать только ограниченное число молекул железа, то есть количество ионизированного (свободного) минерала не должно превышать количество имеющихся анионных гидрофильных участков аминокислот казеиновых фосфопептидов.

В качестве основы питательной среды в заявленном способе выбрана осветленная творожная сыворотка, которая является сравнительно дешевым вторичным сырьем при производстве творога. Кроме того, творожная сыворотка содержит необходимые для культивирования пробиотических микроорганизмов факторы роста: аминокислоты, витамины и микроэлементы.

Таким образом, именно выявленная совокупность отличительных признаков изобретения, заключающаяся в ведении в питательную среду раствора казеиновых фосфопептидов и культивировании среды активизированными культурами пропионовокислых бактерий, влияют на достижение технического результата, выражающегося в повышении усвояемости железа организмом, сокращении срока усвоения за счет подготовки ПКБ пищеварительного тракта к приему биодоступного хелатного железа, увеличении количества жизнеспособных клеток ПКБ.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

В качестве питательной среды для культивирования пробиотических микроорганизмов используют осветленную творожную сыворотку, в которую добавляют компоненты среды: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон и агар.

В приготовленную питательную среду вносят заранее приготовленный раствор казеиновых фосфопептидов.

Раствор казеиновых фосфопептидов готовили известным способом (см.: Kunst A. Process to isolate phosphopeptides. European Patent Application EPO 476199 A1 1990). Казеиновые фосфопептиды выделяли из обезжиренного молока путем кислотной коагуляции с последующей обработкой щелочью до получения казеината натрия. Далее казеинат Na подвергали ферментативному гидролизу с последующим подкислением и осаждением. Ниже представлена технологическая схема приготовления раствора казеиновых фосфопептидов:

Обезжиренное молоко (М.д. жира не более 0,05%)

↓

Кислотная коагуляция + CaCI₂

↓

Прессование, центрифугирование (влажность зерен 80%)

↓

Обработка реагентом - щелочь (рН 6,6-7,0)

↓

Na-казеинат

↓

Эндопротеиназа переваривание (рН 8,0)

↓

Гидролизат (подкисление рН 4,6)

↓

Удаление непептидного материала (центрифугирование)

↓

CaCI₂-агрегация, фильтрация

↓

Раствор, обогащенный CCP_s.

Раствор CCP_s вносят в количестве 15-20% от объема питательной среды.

Добавляют в подготовленную питательную среду двухвалентную соль сульфата железа FeSO₄ из расчета 0,35-0,45 мг/мл.

Устанавливают рН в пределах (7±0,1). Затем стерилизуют при температуре 121±1°С в течение 23±2 мин, охлаждают до 30±2°С, вносят 3-5% активизированных культур пропионовокислых бактерий.

Наращивание клеток пропионовокислых бактерий осуществляют при температуре 30°С в течение 24 часов, в условиях периодического культивирования при однократной нейтрализации среды через 12 часов насыщенным стерильным раствором углекислого натрия (NaCO₃). Полученную суспензию клеток охлаждают и разливают в асептических условиях в стерильные флаконы по 10-12 см³.

Укупоривают стерильно в асептических условиях резиновыми пробками, охлаждают до температуры 4±2°С и хранят при этой температуре не более 90 суток.

Пример 1.

В качестве питательной среды для культивирования пробиотических микроорганизмов используют осветленную творожную сыворотку, в которую добавляют компоненты среды: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон и агар.

В приготовленную питательную среду вносят приготовленный раствор казеиновых фосфопептидов в количестве 20% от объема питательной среды.

Добавляют в подготовленную питательную среду двухвалентную соль сульфата железа FeSO₄ из расчета 0,45 мг/мл.

Устанавливают рН в пределах 7,0. Затем стерилизуют при температуре 12°С в течение 23 мин, охлаждают до 30°С, вносят 5% активизированных культур пропионовокислых бактерий штамма Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii AC-2503.

Наращивание клеток пропионовокислых бактерий осуществляют при температуре 30°С в течение 24 часов, в условиях периодического культивирования при однократной нейтрализации среды через 12 часов насыщенным стерильным раствором углекислого натрия (Na₂СО₃). Полученную суспензию клеток охлаждают и разливают в асептических условиях в стерильные флаконы по 12 см³.

Укупоривают стерильно в асептических условиях резиновыми пробками, охлаждают до температуры 4°С и хранят при этой температуре не более 90 суток.

Пример 2.

В качестве питательной среды для культивирования пробиотических микроорганизмов используют осветленную творожную сыворотку, в которую добавляют компоненты среды: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон и агар.

В приготовленную питательную среду вносят приготовленный раствор казеиновых фосфопептидов в количестве 15% от объема питательной среды.

Добавляют в подготовленную питательную среду двухвалентную соль сульфата железа FeSO₄ из расчета 0,35 мг/мл.

Устанавливают рН в пределах 7,0. Затем стерилизуют при температуре 12°С в течение 23 мин, охлаждают до 30°С, вносят 5% активизированных культур пропионовокислых бактерий штамма Propionibacterium freudenrichii subsp. fredenreichii типа АС-2500.

Наращивание клеток пропионовокислых бактерий осуществляют при температуре 30°С в течение 24 часов, в условиях периодического культивирования при однократной нейтрализации среды через 12 часов насыщенным стерильным раствором углекислого натрия (Na₂CO₃). Полученную суспензию клеток охлаждают и разливают в асептических условиях в стерильные флаконы по 12 см³.

Укупоривают стерильно в асептических условиях резиновыми пробками, охлаждают до температуры 6°С и хранят при этой температуре не более 90 суток.

Пример 3.

В качестве питательной среды для культивирования пробиотических микроорганизмов используют осветленную творожную сыворотку, в которую добавляют компоненты среды: буферные соли, аскорбиновую кислоту, пептон и агар.

В приготовленную питательную среду вносят приготовленный раствор казеиновых фосфопептидов в количестве 20% от объема питательной среды.

Добавляют в подготовленную питательную среду двухвалентную соль сульфата железа FeSO₄ из расчета 0,45 мг/мл.

Устанавливают рН в пределах 7,0. Затем стерилизуют при температуре 12°С в течение 23 мин, охлаждают до 30°С, вносят 5% активизированных культур пропионовокислых бактерий штамма Propionibacterium cyclohexanicum Kusano типа AC-2260.

Наращивание клеток пропионовокислых бактерий осуществляют при температуре 30°С в течение 24 часов, в условиях периодического культивирования при однократной нейтрализации среды через 12 часов насыщенным стерильным раствором углекислого натрия (Na₂CO₃). Полученную суспензию клеток охлаждают и разливают в асептических условиях в стерильные флаконы по 12 см³.

Укупоривают стерильно в асептических условиях резиновыми пробками, охлаждают до температуры 4°С и хранят при этой температуре не более 90 суток.

Изобретение относится к микробиологической промышленности и биотехнологии, а именно к БАД на основе молочного сырья и железа. В приготовленную питательную среду на основе осветленной творожной сыворотки вносят хелатирующий агент в виде раствора казеиновых фосфопептидов в количестве 15-20% от объема среды и сульфат железа в количестве 0,35-0,45 мг/мл. Среду стерилизуют, охлаждают и вносят 3-5% активизированных культур пропионовокислых бактерий, проводят культивирование. Изобретение позволяет повысить усвояемость железа организмом, сократить срок его усвоения за счет подготовки пропионовокислыми бактериями пищеварительного тракта к приему биодоступного железа, увеличить количество жизнеспособных клеток пропионовокислых бактерий. 2 ил., 1 табл.

Способ получения железосодержащей биологически активной добавки к пище, характеризующийся тем, что в приготовленную среду на основе осветленной творожной сыворотки вносят хелатирующий агент в количестве 15-20% от объема питательной среды в виде раствора казеиновых фосфопептидов и сульфат железа в количестве 0,35-0,45 мг/мл, среду стерилизуют, охлаждают, вносят 3-5% активизированных культур пропионовокислых бактерий и проводят культивирование.