СПОСОБ ЛАЗЕРНОГО ФОТОТЕРМОЛИЗА СЕРПОВИДНО-КЛЕТОЧНЫХ ЭРИТРОЦИТОВ Российский патент 2009 года по МПК A61N5/67 

Изобретение относится к области биомедицинских технологий, в частности к созданию неинвазивного селективного оптического гемодиализа элементов крови человека in vivo на основе предлагаемого фототермолиза серповидных эритроцитов, конъюгированных с отрицательно заряженными золотыми наночастицами, облучаемыми лазером с длиной волны, совпадающей с плазменным резонансом наночастиц.

Из медицинской гематологической статистики известно, что более 8% афроамериканцев в США являются носителями такого генетического заболевания, как серповидно-клеточная анемия, приводящего к сердечно-сосудистым патологиям, связанным с кислородным голоданием клеток, и являющегося основной причиной смерти таких больных, особенно при физических нагрузках.

Известен способ инактивации раковых клеток, основанный на введении в кровь фотосенсибилизатора, накопление фотосенсибилизатора в раковой ткани, облучение опухоли лазерным излучением с длиной волны, соответствующей максимуму полосы поглощения фотосенсибилизатора, приводящей к разрушению плазматической мембраны раковых клеток в течение воздействия лазерного излучения, вследствие генерации активных форм молекул кислорода (в частности, синглетного кислорода) путем передачи энергии возбуждения от молекул фотосенсибилизатора, поглотивших лазерные кванты, молекулам кислорода, растворенным в биоткани и находящимся в невозбужденном энергетическом состоянии (см. патент РФ №2184578, МПК A61N 5/06, см. Photodynamic therapy / Ed. T.J.Dougherty // J. Clin. Laser Med. Surg. 1996. V.14. P.219-348).

Однако при таком фотодинамическом механизме инактивации клеток происходит разрушение плазматических мембран как у патологических клеток, так и нормальных, вследствие того, что краситель не обладает селективной избирательностью к тканям, а синглетный кислород генерируется в той пространственной области биоткани, где происходит освещение лазерным пучком. Эксперименты показывают, что в раковых клетках фотосенсибилизатор накапливается в два-три раза больше, чем в нормальных, лишь только за счет того, что в новообразованиях большая плотность кровеносных сосудов.

Известен способ, основанный на введении фотосенсибилизатора типа "Визудин" в кровь, где происходит его захват эндотелиальными клетками аномальных кровеносных сосудов хориоидеи, имеющих высокую концентрацию рецепторов к комплексу липопротеин-визудин. Облучение сетчатки глаза пациента лазерным излучением, попадающим в полосу поглощения красителя, вызывает генерацию синглетного кислорода, приводящего к окклюзии аномальных кровеносных сосудов (Каталог продукции компании "Новартис Фарма САС"). Компания "Карл Цейсс" выпускает полупроводниковый лазер типа "Visulas 690 s" с длиной волны 690 нм и плотностью мощности 600 мВт/см² специально для фотодинамической терапии для активации фермента-фотосенсибилизатора Визудин (каталог продукции компании "Карл Цейсс").

Данный способ обладает фотодинамической селективностью к разрушению только аномальных кровеносных сосудов и не позволяет селективно разрушать патологические форменные элементы крови.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ разрушения патологических (раковых) клеток, основанный на введении в кровь коньюгатов золота, состоящих из наночастиц, химически соединенных с фолатом (витамином В₁₂, являющимся производным фолиевой кислоты), и селективном облучении патологических клеток лазерным излучением, попадающим в полосу поглощения плазменного резонанса наночастиц (см. http://news.bbc.co.uk/hi/russian/sci/tech/newsid_4740000/4740639.stm).

Однако данный способ используется для разрушения только раковых клеток, которые при своем интенсивном и непрерывном делении для производства ДНК используют производные фолиевой аминокислоты, поэтому такой способ не может быть использован для разрушения патологических серповидно-клеточных эритроцитов крови человека, отличающихся от нормальных эритроцитов химической формулой гемоглобина, содержащегося внутри клетки, отражающейся в изменении характерной формы эритроцитов, а также в значении мембранного плазматического потенциала. При этом следует отметить, что иммунная система человека, являющегося носителем такой патологии, не идентифицирует эти эритроциты как патологические и, таким образом, макрофаги и лимфоциты их не уничтожают, в то время как при стандартном значении гематокрита крови (40) организм больного испытывает сильнейшую ишемию (гематокрит 16-20), особенно при физических нагрузках, что является основной причиной смерти.

Задачей изобретения является селективное разрушение патологических эритроцитов крови человека, не способных переносить кислород, на основе избирательного лазерного фототермолиза серповидных эритроцитов, соединенных с наночастицами, в процессе облучения потока крови in vivo импульсным лазерным излучением.

Поставленная задача решается тем, что в способе селективного разрушения патологических клеток, включающем введение в кровь наночастиц из золота и облучение лазерным излучением с длиной волны, совпадающей со спектральным максимумом поглощения плазменного резонанса наночастиц, вызывающим фототермолиз клеток, отличающемся тем, что перед введением наночастиц в кровь их поверхность заряжают отрицательным зарядом, соизмеримым с мембранным потенциалом нормальных эритроцитов, для обеспечения физической адгезии к плазматической мембране патологических клеток, а именно серповидно-клеточных эритроцитов, с концентрацией наночастиц в рН нейтральном физиологическом растворе порядка концентрации эритроцитов, облучению подвергают венозную кровь, проходящую через катетер, содержащую серповидно-клеточные эритроциты крови человека, при этом наночастицы имеют плазменный резонанс в области прозрачности биотканей 700-1100 нм, а длительность лазерных импульсов должна лежать в диапазоне 10 мкс-100 нс при плотности энергии в лазерном импульсе не более 100 мДж/ см² и скважности лазерных импульсов не менее 3. Наночастицы представляют собой ядра из окиси кремния диаметром 50-140 нм из двуокиси кремния, покрытые оболочкой из золота или серебра толщиной в диапазоне 2-20 нм, или золотые или серебряные наностержни с отношением длины к диаметру от 2.5 до 5 при диаметре 10-40 нм.

Изобретение поясняется чертежами.

На фиг.1 представлена блок-схема устройства для реализации предлагаемого способа селективного лазерного фототермолиза серповидно-клеточной анемии при использовании резонансных наночастиц.

На фиг.2 представлены результаты лазерного (810 нм) фототермолиза нормальных нативных эритроцитов крови человека при наличии селективных золотых нанооболочек SiO₂/Au со спектральным максимумом плазменного резонанса (800 нм) и нейтральным электрическим зарядом на внешней оболочке: (а) - обычная и (б) - темнопольная цифровая микрофотография при воздействии непрерывного лазерного излучения мощностью 2 Вт в течение двух минут.

На фиг.3 представлены результаты адгезии золотых наночастиц, имеющих нейтральный заряд к мембране нативных нормальных эритроцитов крови человека.

На фиг.4 представлены результаты фототермолиза физиологического раствора золотых нанооболочек, облучаемых резонансным лазерным излучением (810 нм) при фиксированной средней мощности (2 Вт) для различных длительностей лазерных импульсов 10 мс, 1 мс, 200 мкс при их скважности, равной 1.

На фиг.5 представлены результаты дефрагментации золотых нанооболочек (кремниевое ядро диаметром 140 нм и золотой оболочки толщиной 15 нм) при воздействии сфокусированного излучения твердотельного YAG:Nd лазера (1064 нм) при энергии импульса 10 мДж при длительности 4 нс, проявляющейся в разрушении золотых оболочек при импульсном лазерном фототермолизе, что отражается в смещении плазменного резонанса с длины волны 900 нм до воздействия до длины волны 530 нм после лазерного воздействия, что отражается в окрашивании области воздействия в малиновый цвет, обусловленной соответствующим плазменным резонансом, характерном для золотых частиц размером менее 50 нм, что и подтвердили исследования размера и формы наночастиц с помощью электронного микроскопа с увеличением от 30 до 500 тысяч.

На фиг.6 представлены результаты экспериментального исследования спектра пропускания плазменно-резонансных нанооболочек до воздействия лазерных импульсов (кривая 1) и после (кривая 2). В результате дефрагментации максимум плазменного резонанса смещается с 900 нм к 540 нм (по оси абсцисс - длины волн в обратных сантиметрах).

Позициями на чертежах обозначены:

1 - блок питания полупроводникового инжекционного гетеролазера, работающего в режиме импульсной генерации;

2 - полупроводниковый инжекционный гетеролазер;

3 - оптический световод с системой формирования цилиндрически облучающего лазерного пучка;

4 - оптически прозрачный в ближней ИК-области катетер, внутри которого протекает венозная кровь с наночастицами in vivo;

5 - серповидный эритроцит с адгезированной на его плазматической мембране наночастицей;

6 - серповидный эритроцит с наночастицей, облучаемый импульсным лазерным излучением;

7 - фрагменты разрушенного патологического серповидного эритроцита в результате фототермолиза;

8 - нормальный эритроцит без наночастиц, который не подвергается лазерному фототермолизу;

9 - устройство для гемофильтрации, применяемое при стандартном гемодиализе крови;

10 - золотые наночастицы;

11 - разрушенные вследствие фототермолиза эритроциты;

12 - нормальные эритроциты;

13 - длительность лазерного импульса 10 мс при скважности 2 (ромбики на фиг.4);

14 - длительность лазерного импульса 1 мс при скважности 2 (квадратики на фиг.4);

15 -длительность лазерного импульса 200 мкс при скважности 2 (треугольнички на фиг.4);

16 - кривая спектра пропускания плазменно-резонансных нанооболочек до воздействия лазерных импульсов;

17 - кривая спектра пропускания плазменно-резонансных нанооболочек после воздействия лазерных импульсов.

Способ осуществляется следующим образом: пациенту вводится в вену физиологический раствор с золотыми наночастицами с концентрацией порядка концентрации эритроцитов (5·10⁹ см^-3) в крови, при этом наночастицы представляют собой, например, ядра диаметром 80-140 нм из двуокиси кремния, покрытые оболочкой из золота толщиной в диапазоне 10-25 нм с поверхностным потенциалом не менее - 50 мВ. Часть венозного кровотока отводится в катетер, прозрачный для ближней ИК-области спектра, который просвечивается лазерным пучком, прошедшим цилиндрическую линзу, которая формирует протяженный пучок света вдоль катетера. Длину волны лазера выбирают из области биологической прозрачности биоткани (700-1100 нм), соответствующей максимуму плазменного резонанса наночастиц. Устанавливают длительность импульсов в диапазоне 10 мкс-100 нс, при скважности не менее 2-х, а среднюю плотность энергии не более 100 мДж/см², при этом время воздействия последовательности лазерных импульсов на эритроциты должно составлять не более одной минуты, что вызывает селективный нагрев (фототермолиз) только серповидно-клеточных эритроцитов, так как на их плазматической мембране находятся наночастицы, а соседние нормальные эритроциты не повреждаются. Поврежденные в результате лазерного фототермолиза плазматическая мембрана серповидно-клеточных эритроцитов и внутриклеточные органеллы удаляются с помощью стандартной гемофильтрации, применяемой при гемодиализе.

Основной механизм селективного разрушения серповидно-клеточных эритроцитов с помощью лазерного фототермолиза с помощью технологии наночастиц основан на электрофизиологии клеточных мембран. Из классических работ Поллинга по катафорезу клеток крови в электрическом поле известно (см. «Начала Физиологии» под ред. акад. А.Д.Ноздрачева, СПб., 2001), что скорость диффузии серповидно-клеточных эритроцитов значительно меньше нормальных эритроцитов, что связано с генетической патологией серповидно-клеточных эритроцитов, проявляющейся в нейтрализации заряда на мембране. Именно это электростатическое свойство мембраны патологических эритроцитов является причиной невозможности переноса ими молекул кислорода.

Из гематологии известно, что один из механизмов свертывания крови связан с запуском тромбоцитами образования фибрина, который при взаимодействии с мембраной эритроцитов уменьшает его мембранный электрический потенциал, что и обуславливает образование так называемых «монетных столбиков» из эритроцитов, когда они слипаются (Киричук В.Ф. Физиология крови. СГМУ, 2005, с.13). В то время как в нормальном состоянии, вследствие отрицательного мембранного потенциала мембраны каждого эритроцита, достигающего нескольких десятков милливольт, эритроциты электростатически отталкиваются при сближении в соответствии с законом Кулона.

По известной технологии получения золотых наночастиц в ходе химического восстановления поверхность золотых частиц легирована Au(I) с цитрат-ионами в коионном слое (Stendroff C.J., Herschbach D.R. Kinetics of Displacement and Charge Transfer Reactions Probed by SERS: Evidence for Distinct Donor and Acceptor Sites on Colloidal Gold Surfaces // Langmuir. 1985. V.1. P.131-135; Mirkin Ch. Programming the Assembly of Two-and Three-Dimensional Architectures with DNA and Nanoscale Inorganic Building Blocks // Inorg. Chem. 2000. V.39. P.2258-2272).

При этом электрокинетический потенциал золотых наночастиц сохраняется примерно одинаковым для частиц различных размеров и составляет - 50 мВ (Shulepov S.Yu., Frens G. Surface roughness and particle size effect on the rate of perikinetic coagulation: experimental // J. colloid and interface sci. 1996. V.182 P.388-394).

Как показали проведенные нами эксперименты на нормальных эритроцитах при введении в кровь отрицательно-заряженных наночастиц (-50 мВ), не наблюдается их адгезии к плазматической мембране эритроцитов. Однако если заряд наночастицы сделать нейтральным, то происходит адгезия нано частиц на поверхности плазматической мембраны эритроцитов, что нетрудно видеть из Фиг.3.

Проведенные нами эксперименты по резонансному нагреву наночастиц, растворенных в физиологическом растворе, при условии, что длина волны лазерного излучения совпадает с плазменным резонансом, показали существенное уменьшение средней температуры от длительности лазерных импульсов (Фиг.4). Такое уменьшение температуры связано с конечным временем установления температуры при импульсном нагреве наночастиц. Проведенные эксперименты показали, что при длительности лазерных импульсов менее 1 мкс должен наблюдаться локальный нагрев наночастиц, при этом область нагрева не превысит 10 диаметров наночастиц, т.е. порядка 1 микрона. Поэтому эритроциты, имеющие размер порядка 8 микрон и находящиеся на расстоянии не менее диаметра друг от друга, в смеси с наночастицами будут повреждаться при лазерном импульсном фототермолизе только в случае адгезии наночастиц на поверхности их плазматических мембран.

Параметры золотых нанооболочек выбираются из условия настройки плазменного резонанса в область прозрачности биотканей (700-1100 нм). Известно, что в ближней ИК-области спектра 700-1100 нм наблюдается минимальное поглощение оптического излучения клетками крови и молекулами воды (В.В.Тучин. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. Саратов. СГУ. 1998).

На Фиг.5 показаны результаты впервые обнаруженного нами эффекта дефрагментации нанооболочек с плазменным резонансом на 900 нм при воздействии наносекундных оптических импульсов (4 нс) при энергии в импульсе 10 мДж YAG:Nd лазера (1.06 мкм). В результате сфокусированного лазерного пучка плотность мощности превышала 10⁹ Вт/см², что вызывало разрушения нанооболочек, состоящих из ядра из окиси кремния диаметром 140 нм и золотой оболочки толщиной 15 нм. В результате импульсного лазерного нагрева происходило разрушение нанооболочек и образование мелких золотых наночастиц с плазменным резонансом на длине волны 530 нм, что и отражается на цвете наночастиц (малиновая область). Эти исследования позволили установить границу на минимальную длительность лазерных импульсов и их энергию для локального разрушения клеток при технологии лазерного фототермолиза на основе плазменно-резонансных наночастиц, не вызывающих лазерных тепловых микровзрывов в биоткани и обеспечивающих клеточную локальность теплового повреждения.

Изобретение относится к области биомедицинских технологий, в частности к созданию неинвазивного селективного оптического гемодиализа элементов крови человека in vivo на основе предлагаемого фототермолиза серповидных эритроцитов, конъюгированных с отрицательно заряженными золотыми наночастицами, облучаемыми лазером с длиной волны, совпадающей с плазменным резонансом наночастиц. Способ обеспечивает селективное разрушение патологических эритроцитов крови человека, не способных переносить кислород, на основе избирательного лазерного фототермолиза серповидных эритроцитов, соединенных с наночастицами, в процессе облучения потока крови in vivo импульсным лазерным излучением. Проводят введение в кровь наночастиц из золота и облучение лазерным излучением с длиной волны, совпадающей со спектральным максимумом поглощения плазменного резонанса наночастиц, вызывающим фототермолиз клеток. Перед введением наночастиц в кровь их поверхность заряжают отрицательным зарядом, соизмеримым с мембранным потенциалом нормальных эритроцитов для обеспечения физической адгезии к плазматической мембране патологических клеток, а именно серповидно-клеточных эритроцитов, с концентрацией наночастиц в рН нейтральном физиологическом растворе порядка концентрации эритроцитов, облучению подвергают венозную кровь, проходящую через катетер, содержащую серповидно-клеточные эритроциты крови человека, при этом наночастицы имеют плазменный резонанс в области прозрачности биотканей 700-1100 нм, а длительность лазерных импульсов должна лежать в диапазоне 10 мкс-100 нс при плотности энергии в лазерном импульсе не более 100 мДж/см² и скважности лазерных импульсов не менее 3. Наночастицы представляют собой ядра из окиси кремния диаметром 50-140 нм из двуокиси кремния, покрытые оболочкой из золота или серебра толщиной в диапазоне 2-20 нм, или золотые или серебряные наностержни с отношением длины к диаметру от 2.5 до 5 при диаметре 10-40 нм. 2 з.п. ф-лы, 6 ил.

1. Способ фототермолиза серповидно-клеточных эритроцитов, включающий введение в кровь наночастиц из золота и облучение лазерным излучением с длиной волны, совпадающей со спектральным максимумом поглощения плазмонного резонанса наночастиц, и вызывающим фототермолиз клеток, при этом перед введением наночастиц в венозную кровь их поверхность заряжают отрицательным зарядом, соизмеримым с мембранным потенциалом нормальных эритроцитов для обеспечения физической адгезии к плазматической мембране серповидно-клеточных эритроцитов, с концентрацией наночастиц в рН нейтральном физиологическом растворе порядка концентрации эритроцитов крови, облучению подвергают венозную кровь, проходящую через катетер, содержащую серповидно-клеточные эритроциты крови человека, причем наночастицы имеют плазменный резонанс в области прозрачности биотканей 700-1100 нм, а длительность импульсов лазерного излучения лежит в диапазоне 10 мкс-100 нс при плотности энергии в лазерном импульсе не более 100 мДж/см² и скважности лазерных импульсов не менее 2.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что золотые наночастицы представляют собой ядро диаметром 50-140 нм из двуокиси кремния, покрытые оболочкой из золота толщиной в диапазоне 2-20 нм.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что наночастицы представляют собой золотые или серебряные наностержни с отношением длины к диаметру от 2.5 до 5 при диаметре 10-40 нм.