СПОСОБ ЛАЗЕРНОГО ФОТОТЕРМОЛИЗА РАКОВЫХ КЛЕТОК Российский патент 2011 года по МПК A61N5/67 B82B1/00 A61K31/47 A61K33/14 A61P35/00 

Изобретение относится к области биомедицинских технологий, в частности к созданию неинвазивного объемного ИК лазерного фототермолиза раковых клеток на основе технологии плазмонно-резонансных золотых нанооболочек и наностержней.

Известен способ близкофокусной рентгенотерапии с суммарной очаговой дозой 100-120 Гр и дистанционной гамма-терапии при лучевом разрушения злокачественных клеток с суммарной очаговой дозой 30-40 Гр (Ш.Х.Ганцев. Онкология М. Медицинское информационное агентство. 2004, с.190-204; Stephen J., Withrow Е., MacEwen G. Smal animal clinical oncology. - 2001, p.305-308).

Однако данный способ, несмотря на распространенность, обладает существенным недостатком. При разрушении раковых клеток с помощью дистанционной гамма-терапии и рентгенотерапии происходит значительное поражение нормальных клеток в пределах облучающего пучка, в том числе и клеток крови.

Известен способ фотодинамического разрушения опухолей, включающий внутривенное введение фотосенсибилизатора и облучение опухоли непрерывным лазерным излучением с длиной волны, совпадающей с полосой поглощения фотосенсибилизатора (Photodynamic therapy/Ed.T.J.Dougherty/ J.Clin.Laser Med Surg. 1996, Vol.14, P.219-348; Патент РФ №2184578, МПК A61N 5/06). При поглощении фотонов молекулами красителя молекулы красителя переходят в возбужденное электронное состояние и при столкновении с молекулами кислорода, растворенного в биоткани, переводят его из невозбужденного в возбужденное электронное синглетное состояние, с типичным временем жизни несколько микросекунд. За это время молекулы синглетного кислорода пройдя характерный путь, соизмеримый с размерами клеток при взаимодействии с плазматической мембраной клетки, повреждают ее и клетка гибнет вследствие некроза. Таким образом, разрушение клеток происходит лишь во время воздействия лазерного излучения в пространственной области облучения лазерным пучком, а степень повреждения зависит от числа фотонов на данной глубине биоткани, клетки которой будут повреждены.

Селективный фотодинамический механизм разрушения раковых клеток основан на более высокой плотности (контрастности) накопления фотосенсибилизатора в опухолевых клетках по сравнению с обычными, что связано с большей плотностью кровеносных сосудов в опухоли по сравнению со здоровой биотканью.

Однако этот контраст для различных опухолей не превышает двух-трех раз.

Кроме того, фотодинамический способ при разрушении раковых клеток имеет еще ряд недостатков. В частности, коэффициент поглощения оптического излучения биотканью достигает 10^4-3 см^-1 в ультрафиолетовой до видимой области, включая зеленую область спектра, т.е. (200 нм-550 нм), что обусловлено поглощением ДНК, протеинов, жиров в ультрафиолетовой области, гемоглобина и меланина от ультрафиолетовой до зеленой области видимого спектра и спадает до 10² см^-1 в красной области, поэтому глубина проникновения лазерного излучения изменяется от единиц микрон до сотен микрон. Используемые в практике фотосенсибилизаторы: порфирины, хлорины имеют полосы поглощения фотосенсибилизаторов в красной области спектра, и используемые лазеры не могут эффективно проникать в биоткань, в этой спектральной области лазерное излучение эффективно может применятся только для поверхностных биотканей.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ разрушения раковых клеток (Pitsillides C.M., Joe E.K., Wei X., Anderson R.R., Lin C.P. Selective cell targeting with light-absorbing microparticles and nanoparticles // Biophys J. 2003. V.84. P.4023-4032).

Способ включает введение в кровь внутривенно золотых сферических наночастиц, которые накапливаются в опухоли, вследствие большой концентрации кровеносных сосудов в опухоли, облучение опухоли лазерным пучком с длиной волны, совпадающей с максимумом поглощения наночастиц, при этом наночастицы нагревались лазерными наносекундными импульсами.

Однако данный способ обладает следующими недостатками.

Золотые наносферы диаметром от единиц до сотен нанометров имеют плазменный резонанс с максимумом поглощения от 520 нм до 560 нм, совпадающий с максимумами поглощения гемоглобина крови, при этом лазерное излучение будет поглощаться не только наночастицами, но эритроцитами крови, поэтому лазерный фототермолиз может осуществляться только для поверхностных опухолей, так как невозможно доставить лазерное излучение на глубину более сотни микрон в биотканях.

Задачей настоящего изобретения является возможность фототермолиза объемных опухолей, расположенных не только на поверхности биотканей, но и на глубинах несколько сантиметров за счет доставки ИК лазерного излучения, которое не только слабо поглощается биотканями, но при этом рассеяние лазерного излучения в биотканях будет сильно подавлено, вследствие эффекта просветления биотканей на длине волны лазерного излучения.

Технический результат заключается в эффективности фототермолиза раковых клеток, расположенных в глубине биотканей при минимальном повреждении нормальных клеток.

Поставленная задача решается тем, что в способе лазерного фототермолиза раковых клеток, включающем введение коллоидного раствора золотых наночастиц, облучаемых резонансным импульсным лазерным излучением, согласно решению в качестве раствора используют коллоидный раствор смеси глицерина и физраствора с золотыми наночастицами, представляющими собой золотые нанооболочки или наностержни с плазмонным резонансом, имеющим спектральный максимум поглощения в области прозрачности биотканей на длине волны 750-1200 нм, а концентрация наночастиц выбирается в диапазоне 5·10⁷-5·10⁹ см^-3 в зависимости от глубины расположения опухоли, при этом соотношение глицерина с физраствором выбирают так, чтобы показатель преломления полученного раствора на длине волны резонансного лазерного излучения был наиболее близок к показателю преломления облучаемой биоткани, облучение раковых клеток проводят лазерным пучком с длиной волны излучения, совпадающей со спектральной областью плазмонного резонанса наночастиц, при этом для локального разрушения раковых клеток облучение производят последовательностью лазерных импульсов с длительностью лазерного импульса в диапазоне 1 мкс - 1 мс при минимальной скважности два и более при плотности лазерной мощности не более 10 Вт/см².

Изобретение поясняется чертежами.

На фиг.1 показана блок-схема эксперимента по разрушению объемной опухоли у лабораторной крысы на основе импульсного лазерного фототермолиза при использовании технологии плазмонно-резонансных золотых наночастиц, где:

1 - лабораторная крыса;

2 - золотые плазмонно-резонансные нанооболочки или наностержни, вводимые в опухоль;

3 - опухоль;

4 - импульсный инфракрасный полупроводниковый лазер (длина волны 750-1200 нм) с волоконно-оптическим световодом.

На фиг.2 представлена зависимость коэффициента экстинкции (поглощение и рассеяние света) от длины волны (нм) при изменении геометрических параметров наночастиц: (а) - золотые наносферы, (б) - золотые наностержни с отношением длины к диаметру от 1 до 6; (в) - золотые оболочки с толщиной 2 нм с диаметром ядра из двуокиси кремния от 10 до 90 нм.

Фиг.3 иллюстрирует термограммы лазерного нагрева коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных нанооболочек (Au/SiO₂ 15/140 нм) в воде для различной концентрации при торцевом облучении вдоль оси симметрии кюветы типа эппендорф резонансным излучением полупроводникового лазера (810 нм) с мощностью 1 Вт в течение 2 мин (120 Дж), - максимальная концентрация наночастиц N₀=5·10⁹ см^-3; (в) N=N₀/4; (б) N=N₀/16, (а) - физраствор.

Фиг.4 - 2D термограммы динамики лазерного нагрева коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных наностержней (15/50) в воде - (а) и в глицерине - (б): ИК лазер (810 нм) с мощностью 1 Вт, время воздействия 1 мин; концентрация наночастиц 10⁹ см^-3.

На фиг.5 дана сравнительная динамика лазерного нагрева плазмонно-резонансных наночастиц ИК-излучением лазера (810 нм), работающего в импульсном (▲)(длительность импульса 1 мс, скважность 7) и непрерывном (•) режиме со средней оптической мощностью 2 Вт при одинаковой энергии.

На фиг.6 представлены сравнительные термограммы лазерного нагрева коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных наноболочек (Au/SiO₂ - 30/140 нм с массовым содержанием золота 37 мкг/мл) (а, в, д) и ИК фотосенсибилизатора Индоцианина зеленого (ICG) с концентрацией (0.1 мкМ/мл - 75 мкг/мл) (б, г, ж) при воздействии на кювету типа Эппендорф излучения полупроводникового лазера (810 нм) со средней энергией 60 Дж (а) - непрерывный режим; (б) - длительность лазерного импульса 1 мс, скважность 2 (в) - длительность 1 мс, скважность 4.

На фиг.7 показано: а - базально-клеточный рак кожи собаки, б - после 2-х сеансов лазерного фототермолиза раковых клеток при интерстициальном введении золотых нанооболочек (Au/SiO₂; 15/140 нм).

Способ осуществляется следующим образом.

Животному, например лабораторной крысе 1, с помощью инсулинового шприца внутрь опухоли вводится коллоидный физраствор с глицерином с золотыми плазмонно-резонансными нанооболочками или наностержнями при концентрации не менее 5·10⁷/см^-3 и более 5·10⁹/см^-3, производят чрескожное облучение опухоли импульсным лазером 4 с длиной волны, совпадающей с максимумом плазмонного резонанса наночастиц, лежащим в области прозрачности биотканей (750-1200 нм), оптическое облучение производят последовательностью лазерных импульсов с длительностью лазерного импульса в диапазоне 1 мкс - 1 мс при минимальной скважности два и более, при плотности мощности не более 10 Вт/см².

Следует отметить, что в качестве импульсного лазера с мили- и микросекундной длительностью может быть использованы полупроводниковые лазеры на GaAlAs.

Нижний предел плотности энергии используемых лазеров определяется температурой нагрева биоткани, содержащей наночастицы, вызывающий некроз клеток опухоли, а верхний предел определяется уровнем плотности лазерной энергии, не вызывающей патологических изменений биоткани, в которой не содержатся плазмонно-резонансные наночастицы.

В лаборатории размерных наносенсоров ИБФРМ РАН авторами заявки разработана технология и реально изготавливаются плазмонно-резонансные наночастицы с возможностью управления спектральным положением плазмонного резонанса золотых нанооболочек и наностержней при изменении геометрических параметров наночастиц как показано на фиг.2 (Н.Г.Хлебцов, В.А.Богатырев, Л.А.Дыкман, Б.Н.Хлебцов. Золотые наноструктуры с плазмонным резонансом для биомедицинских исследований // Российские нанотехнологии. 2007. Т.2. №3-4. С.69-86).

Управляя концентрацией плазмонно-резонансных золотых наночастиц, можно регулировать пространственное распределение температурных полей при нагреве наночастиц резонансным лазерным излучением как по глубине, так и по абсолютному значению температуры, как показано на фиг.3. Максимальное значение концентрации плазмонно-резонансных золотых наночастиц определяется сильным поглощением и эффективным нагревом слоя толщиной не более нескольких миллиметров. Нижняя граница концентрации плазмонно-резонансных золотых или наночастиц определяется эффективностью лазерного нагрева на глубине более 1 см. С уменьшением концентрации наночастиц уменьшается пространственная неоднородность нагрева по глубине.

На фиг.4 экспериментально показан более эффективный (в 1.6 раза) нагрев коллоидного раствора нанооболочек в глицерине по сравнению с водой, связанный с меньшей теплоемкостью глицерина по сравнению с водой (в 1.6 раза), а также установлена возможность управления пространственным распределением температурных полей за счет уменьшения эффектов рассеяния лазерного излучения наночастицами в глицерине по сравнению с водой. Аналогичный эффект просветления биотканей, например кожи, наблюдается при использовании глицерина, что позволяет эффективно доставлять направленный лазерный пучок к опухоли при чрескожном облучении (Оптическая биомедицинская диагностика, под. ред. Тучин В.В., М.: Физматлит, 2007).

Использование импульсных режимов позволяет эффективно нагревать наночастицы резонансным ИК лазерным излучением, при этом объемная среда остается более холодной, как показано на фиг.5-6. Таким образом, повреждаются лишь те клетки, которые находятся на расстоянии не более нескольких десятков микрон от наночастиц, при этом клетки или биоткань без наночастиц при этом уровне лазерного излучения не повреждаются.

При импульсном нагреве золотых наночастиц длительность лазерного импульса определяет локальность нагрева наночастицей окружающей биоткани. Оценки показывают, что при облучении наносекундными импульсами эффективный радиус нагрева окружающей биоткани составляет не более 1 микрона (Khlebtsov BN, Zharov VP, Melnikov AG, Tuchin VV, Khlebtsov NG. Optical amplification of photothermal therapy with gold nanoparticles and nanoclusters. Nanotechnology 2006; 17, 5267-5179).

Однако обнаруженный нами эффект дефрагментации плазмонно-резонансных золотых нанооболочек при энергии одиночного лазерного импульса более 2 мДж и длительности 4 нс, вызывающих разрушение нанооболочек или локальное оплавление наностержней, приводит к ограничению на интенсивность лазерного излучения сверху и его минимальную длительность (Garif Akchurin, Boris Khlebtsov, Georgy Akchurin, Valery Tuchin, Vladimir Zharov, Nikolai Khlebtsov. Laser-induced phonodestruction of silica/gold nanoshells under single nanosecond pulses. Nanothechnology, 2007, v.18).

Таким образом, параметры лазерного импульсного воздействия определялись экспериментально на фантомах биоткани и in vivo на спонтанных опухолях животных, при последующем гистологическом анализе и минимальная длительность лазерного импульса ограничивалась условием, указанным в формуле изобретения.

Эффективность проведенного по патентуемой методике ИК лазерного фототермолиза на основе технологии плазмонно-резонансных золотых нанооболочек при облучении базально-клеточного рака кожи собаки показан на фиг.7.

Изобретение относится к медицине, онкологии, и может быть использовано для фототермолиза раковых клеток. Для этого вводят коллоидный раствор смеси глицерина и физраствора с золотыми наночастицами. Облучают резонансным импульсным лазерным излучением раковые клетки. При этом золотые наночастицы представляют собой золотые нанооболочки или наностержни. Причем плазменный резонанс наночастиц имеет спектральный максимум поглощения в области прозрачности биотканей на длине волны 750-1200 нм. Концентрацию наночастиц выбирают в диапазоне 5·10⁷-5·10⁹ см^-3 в зависимости от глубины расположения опухоли. При этом соотношение глицерина с физраствором выбирают так, чтобы показатель преломления раствора на длине волны резонансного лазерного излучения был наиболее близок к показателю преломления облучаемой биоткани. Облучение раковых клеток проводят лазерным пучком с длиной волны излучения, совпадающей со спектральной областью плазменного резонанса. При этом для локального разрушения раковых клеток облучение производят последовательностью лазерных импульсов с длительностью лазерного импульса в диапазоне 1 мкс - 1 мс при минимальной скважности два и более. Причем плотность мощности составляет не более 10 Вт/см². Способ позволяет провести фототермолиз объемных опухолей на поверхности и в глубине биотканей при минимальном повреждении нормальных клеток. 7 ил.

Способ лазерного фототермолиза раковых клеток, включающий введение коллоидного раствора золотых наночастиц, облучение резонансным импульсным лазерным излучением раковых клеток, отличающийся тем, что в качестве раствора используют коллоидный раствор смеси глицерина и физраствора с золотыми наночастицами, представляющими собой золотые нанооболочки или наностержни с плазменным резонансом, имеющим спектральный максимум поглощения в области прозрачности биотканей на длине волны 750-1200 нм, а концентрация наночастиц выбирается в диапазоне 5·10⁷-5·10⁹ см^-3 в зависимости от глубины расположения опухоли, при этом соотношение глицерина с физраствором выбирают так, чтобы показатель преломления раствора на длине волны резонансного лазерного излучения был наиболее близок к показателю преломления облучаемой биоткани, облучение раковых клеток проводят лазерным пучком с длиной волны излучения, совпадающей со спектральной областью плазменного резонанса, при этом для локального разрушения раковых клеток облучение производят последовательностью лазерных импульсов с длительностью лазерного импульса в диапазоне 1 мкс - 1 мс при минимальной скважности два и более, при плотности мощности не более 10 Вт/см².