СПОСОБ ЛАЗЕРНОЙ ГИПЕРТЕРМИИ ОПУХОЛЕЙ ПРИ ВВЕДЕНИИ ПЛАЗМОННО-РЕЗОНАНСНЫХ НАНОЧАСТИЦ С ПРИМЕНЕНИЕМ ТЕХНИКИ ИММЕРСИОННОГО ОПТИЧЕСКОГО ПРОСВЕТЛЕНИЯ Российский патент 2023 года по МПК A61N5/67 A61K47/10 A61K31/10 A61K41/00 A61P35/00 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к онкологии, а именно к терапии опухолей с использованием наночастиц, лазерного излучения и просветляющего агента, снижающего повреждение здоровых тканей, находящихся на пути лазерного излучения к опухоли.

В настоящее время актуальной проблемой медицины является создание и разработка новых терапевтических технологий на основе использования наночастиц для лечения онкологических заболеваний.

В онкологии достаточно давно применяется лазерная гипертермия - способ лечения новообразований, основанный на лазерном нагреве и разрушении опухолей. Для повышения эффективности лазерной гипертермии в настоящее время широко используются термосенсибилизаторы - вещества, способные эффективно поглощать лазерное излучения и конвертировать его в тепло. Одним из наиболее действенных и перспективных методов лазерной терапии является плазмонно-резонансная фототермическая терапия, в которой применяется лазерный нагрев металлических, чаще всего золотых наночастиц [Huang X., Jain Р.K., El-Sayed I.H., El-Sayed M.A. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles // Lasers Med. Sci., 2008. 23(3), 217-228].

Уникальность золотых наночастиц определяется электрохимическими и оптическими свойствами коллоидного золота, в частности, поверхностным плазмонным резонансом (ППР). Для практического применения предпочтительным является использование термосенсибилизаторов, поглощающих свет в инфракрасной области (700-1000 нм), где поглощение самих биотканей минимально, в так называемом терапевтическом окне прозрачности биотканей [Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. - 2-е изд., испр. и доп. - М.: ФИЗМАТЛИТ, 2010. - 478 с.]. Таким образом, плазмонный резонанс наночастиц для применения in vivo должен находиться в инфракрасном (ИК) диапазоне.

Использование для фототермической терапии раствора золотых наностержней является предпочтительным из-за коллоидной стабильности и легкой настройки плазмонного резонанса наностержней в соответствии с длиной волны лазерного излучения путем изменения осевого соотношения наночастиц [Maltzahn G., Park J.-H., Agrawal A., Bandaru N.K., Das S.K., Sailor M.J., Bhatia S.N. Computationally guided photothermal tumor therapy using long-circulating gold nanorod antennas // Cancer Res. -2009. - Vol. 69. - P. 3892-3900]. Для улучшения биосовместимости наночастиц, повышения их стабильности и простоты функционализации в настоящее время используются различные биосовместимые полимеры [Hirn S., Semmler-Behnke М., Schleh С., Wenk A., Lipka J., Schäffler M., Takenaka S., Möller W., Schmid G., Simon U., Kreyling W.G. Particle size-dependent and surface charge-dependent biodistribution of gold nanoparticles after intravenous administration // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. - 2011. - Vol. 77. - P. 407]. Более длительное время циркуляции и лучшее накопление в опухолях показывают наночастицы, покрытые нейтрально заряженными полимерами, в том числе полиэтиленгликолем [Wang J., Bai R., Yang R., Liu J., Tang J., Liu Y., Li J., Chaic Z., Chen C. Size- and surface chemistry-dependent pharmacokinetics and tumor accumulation of engineered gold nanoparticles after intravenous administration // Metallomics. - 2015. - Vol. 7. - P. 516-524].

Исследованию оптических характеристик (коэффициентов поглощения и рассеяния, фактора анизотропии рассеяния, показателя преломления) опухолей посвящен целый ряд работ [Troy T.L., Page D.L., Sevick-Muraca Е.М. Optical properties of normal and diseased breast tissue: prognosis for optical mammography // J. Biomed. Opt. - 1996. - Vol. 1. - P. 342-355; Germer C.-T., Roggan A., Ritz J.P., Isbert C., Albrecht D., Muller G., Buhr H.J. Optical properties of native and coagulated human liver tissue and liver metastases in the near infrared range // Lasers Surg. Med. - 1998. - Vol. 23. - P. 194-203].

Однако в данных работах не учитывается неоднородная структура опухолей и, как правило, измерения были выполнены только в достаточно узком диапазоне длин волн, что приводит к тому, что в многочисленных работах, посвященных лазерной гипертермии, недостаточно учитывается структура и оптические характеристики опухолевой ткани. В то же время стремительное развитие как нанобиотехнологий, так и лазерной техники приводит к возникновению насущной потребности в надежной послойной дозиметрии лазерного излучения для оптимизации существующих методов и процедур противоопухолевой плазмонной фототермической терапии с применением золотых наночастиц в качестве термосенсибилизаторов.

Исследования оптического просветления при комбинации использования оптического просветляющего агента (ОПА) и лазерного излучения различных длин волн (CO₂-лазер и Nd: YAG-лазер, работающий на длинах волн 532 и 1064 нм, диодный лазер, работающий на длине волны 980 нм и источники широкополосного интенсивного импульсного света, работающие в диапазонах 650-1200, 525-1200 и 470-1400 нм) и интенсивности были представлены в работах, в которых нагрев поверхности кожи in vivo применялся до нанесения ОПА. Результаты исследования кожи на облученных участках с помощью оптической когерентной томографии (ОКТ) показали увеличение глубины проникновения света до 42% [Stumpp О., Welch A.J., Neev J. Enhancement of transdermal skin clearing agent delivery using a 980 nm diode laser // Lasers Surg. Med. - 2005. - Vol. 37. - P. 278-285]. На основе измерения спектров отражения до и после облучения показано улучшение трансэпидермального проникновения ОПА в 8-9 раз по сравнению с необлученной кожей [Liu С, Zhi Z., Tuchin V.V., Luo Q., Zhu D. Enhancement of skin optical clearing efficacy using photo-irradiation // Lasers Surg. Med. - 2010. - Vol. 42. - P. 132-140]. Однако сравнительного исследования влияния ОПА на результат плазмонно-резонансной фототермической терапии (ПФТТ) не проводилось. Генерация и распределение тепла в трехслойной модели: кожа, жировая ткань и мышца, облученной диодным лазером ближнего инфракрасного диапазона с длиной волны 1064 нм до и после нанесения глицерина, были смоделированы Youn [Youn J.-I. The Effect of an Optical Clearing Agent on Tissue Prior to 1064-nm Laser Therapy //Med. Laser. - 2021. - Vol. 10. - P. 146-152]. В работе было установлено, что применение ОПА во время лазерного воздействия может уменьшить тепловыделение на поверхности кожи и стимулировать глубокое нагревание тканей. Моделирование было подтверждено экспериментальными результатами на образцах ткани ex vivo и животных in vivo [Chu Y., Liao Sh, Liao H., Lu Y., Geng X., Wu D., Pei J., Wang Y. Second near-infrared photothermal therapy with superior penetrability through skin tissues // CCS Chem. - 2021. - Vol. 3. - P. 3289-3300].

Исследование термически индуцированных изменений оптических свойств опухолевых тканей при ПФТТ и при оптическом просветлении поверхностных тканей важно как для оценки необходимой дозы вводимых наночастиц и лазерного облучения, так и для разработки математических моделей, которые могут надежно предсказать результаты процедуры ПФТТ в различных условиях. Несмотря на многочисленные исследования оптических параметров кожи, крови и опухолей при их нагреве [Laufer J., Simpson R., KohlM., Essenpreis M., Cope M. Effect of temperature on the optical properties of ex vivo human dermis and subdermis // Phys. Med. Biol. - 1998. - Vol. 43. - P. 2479-2489; Iorizzo T.W., Jermain P.R., Salomatina E., Muzikansky A., Yaroslavsky A.N. Temperature induced changes in the optical properties of skin in vivo // Sci. Rep.- 2021. - Vol. 11. - P. 754; Jia H., Chen В., Li D. Dynamic optical absorption characteristics of blood after slow and fast heating // Lasers Med. Sci. - 2017. - Vol. 32. - P. 513-525; Manuchehrabadi N, Chen Y., Lebrun A., Ma R., Zhu L. Computational simulation of temperature elevations in tumors using Monte Carlo method and comparison to experimental measurements in laser photothermal therapy // J. Biomech. Eng. - 2013. - Vol. 135. - P. 121007], исследования изменения оптических параметров in vivo в процессе нагрева в присутствии ОПА, а также при ПФТТ с оптическим просветлением практически не проводились.

Известен способ плазмонно-резонансной фототермической терапии опухолей в эксперименте (патент RU 2614507, МПК A61N 5/067, А61В 5/01, опубл. 28.03.2017 г.), включающий многократное внутривенное введение золотых наночастиц и чрескожное облучение инфракрасным лазером с длиной волны, соответствующей плазмонному резонансу данных наночастиц. Животному с опухолью внутривенно вводят раствор золотых наностержней, покрытых полиэтиленгликолем, через 24 часа после введения проводят диагностическое лазерное облучение инфракрасным лазером с длиной волны в интервале 700-900 нм с плотностью мощности в диапазоне 1-2 Вт/см² в течение 2 минут и измеряют температуру нагрева опухоли с помощью термографа, при нагреве опухоли менее 45°С вновь внутривенно вводят наночастицы и через 24 часа после введения наночастиц проводят диагностическое лазерное облучение, измеряют локальную температуру нагрева опухоли, и только при достижении в течение 2 минут температуры 45°С и выше проводят терапевтическое облучение инфракрасным лазером длиной волны в интервале 700-900 нм с плотностью мощности 4-5 Вт/см² в течение 20 минут.

Известен способ селективного разрушения опухолей (патент RU 2405600, МПК A61N 5/067, А61В 18/04, опубл. 10.12.2010 г.), включающий введение раствора фотосенсибилизатора и облучение опухоли лазерным излучением, совпадающим с максимумом полосы поглощения фотосенсибилизатора. Для локального разрушения опухоли фотосенсибилизатор капсулируют в полимерные микроконтейнеры, оболочка которых содержит наночастицы магнетита (Fe₃O₄), и вводят в биоткань, окружающую опухоль, в объеме опухоли создают внешнее постоянное магнитное поле, пространственная конфигурация которого совпадает с формой опухоли, а лазерное облучение производят через время, соответствующее максимальному накоплению микроконтейнеров в опухоли, при плотности энергии излучения, достаточной для фотодинамического или фототермического разрушения оболочек микроконтейнеров внутри опухоли и последующего фотодинамического или фототермического разрушения клеток раковой опухоли, при этом фотосенсибилизатор выбирают с полосой поглощения в красной и ближней ИК спектральной области 650-1200 нм.

Наиболее близким к заявляемому является способ лазерного фототермолиза раковых клеток (патент RU 2424831, МПК A61N 5/067, В82В 1/00, опубл. 27.07.2011 г.), включающий введение коллоидного раствора золотых наночастиц, облучение резонансным импульсным лазерным излучением раковых клеток. В качестве раствора используют коллоидный раствор смеси глицерина и физраствора с золотыми наночастицами, представляющими собой золотые нанооболочки или наностержни с плазменным резонансом, имеющим спектральный максимум поглощения в области прозрачности биотканей на длине волны 750-1200 нм, а концентрация наночастиц выбирается в диапазоне 5⋅10⁷-5⋅10⁹ см^-3 в зависимости от глубины расположения опухоли, при этом соотношение глицерина с физраствором выбирают так, чтобы показатель преломления раствора на длине волны резонансного лазерного излучения был наиболее близок к показателю преломления облучаемой биоткани, облучение раковых клеток проводят лазерным пучком с длиной волны излучения, совпадающей со спектральной областью плазменного резонанса, при этом для локального разрушения раковых клеток облучение производят последовательностью лазерных импульсов с длительностью лазерного импульса в диапазоне 1 мкс - 1 мс при минимальной скважности два и более, при плотности мощности не более 10 Вт/см².

Однако данные патенты не предусматривают снижения повреждения здоровых тканей, находящихся на пути лазерного излучения к опухоли.

Технической проблемой является разработка способа комплексного проведения лазерной гипертермии при введении в опухоль золотых наностержней и применения техники оптического просветления тканей, находящихся на пути лазерного излучения к опухоли.

Техническим результатом изобретения является снижение негативного влияния на окружающие опухоль здоровые ткани, в том числе на ткани, находящиеся на пути лазерного излучения к опухоли.

Технический результат достигается тем, что в способе лазерной гипертермии опухолей, включающем внутриопухолевое введение суспензии золотых наночастиц и облучение опухли лазерным излучением на длине волны 750-1200 нм, согласно решению, перед облучением на поверхность кожи над опухолью наносят оптический просветляющий агент, облучение осуществляют в два этапа, на первом этапе облучают в течение 10 минут с плотностью мощности, обеспечивающей нагрев кожи до 41±1°С; на втором этапе облучают в течение 15 минут с плотностью мощности, обеспечивающей нагрев кожи до 59±1°С.

В качестве просветляющего агента выбрана смесь глицерина, ДМСО и воды в объемных долях 70%:5%:25% соответственно.

Изобретение поясняется чертежом, на котором представлены спектры диффузного отражения кожи над подкожно перевитой холангиокарциномой крысы в процессе проведения плазмонно-резонансной фототермической терапии (ПФТТ) в группах с оптическим просветлением кожи и контрольной (без оптического просветления кожи). Фрагмент чертежа (б) является продолжением (а).

На чертеже использованы следующие обозначения:

до ПФТТ

после I этапа ПФТТ

после II этапа ПФТТ

контроль

Способ осуществляется следующим образом.

Животному за час до облучения интратуморально в трех точках подкожной перевитой опухоли вводят суспензию золотых наностержней (ЗНС) со скоростью введения 0.1 мл/мин. Общий объем введенной суспензии составляет 1 мл с концентрацией ЗНС 400 мкг/мл.

Золотые наностержни функционализированы тиолированным полиэтиленгликолем (молекулярный вес 5000). Геометрические параметры ЗНС были: 41±8 нм в длину и 10±2 нм в диаметре.

В качестве оптически просветляющего агента (ОПА) выступает смесь из 70% глицерина, 5% ДМСО и 25% воды в объемных долях, соответственно. Процедура лазерного облучения включает два этапа.

На первом этапе на поверхность кожи крысы наносят ОПА объемом 1 мл и проводят лазерное облучение (длина волны 808 нм) мощностью до 1 Вт в течение 10 мин. При этом плотность мощности на поверхности кожи над опухолью определяется тем, что температура кожи над опухолью должна составлять 41±1°С. В это время за счет диффузии глицерина в ткань кожи, кожа просветляется, и глубина проникновения света увеличивается. На втором этапе мощность лазерного излучения (длина волны 808 нм) увеличивают до 2 Вт, и облучение продолжают в течение еще 15 мин. При этом измеряемая температура достигает 59±1°С.

В качестве материала исследования выступали 6 беспородных крыс-альбиносов самцов с подкожно привитыми модельными опухолями холангиокарциномы линии РС-1. При достижении опухолями объема ≥3 см³ крысам за час до эксперимента в трех точках опухоли вводилась суспензия ЗНС со скоростью введения 0.1 мл/мин. Общий объем введенной суспензии составил 1 мл с концентрацией ЗНС 400 мкг/мл. Этот метод введения приводит к накоплению и удержанию наночастиц в опухоли [Xie Н., Goins В., Bao A., Wang Z.J., Philips W.T. Effect of intratumoral administration on biodistribution of 64 Cu-labeled nanoshells //Int. J. Nanomed. - 2012. - Vol. 7. - P. 2227-2238]. Таким образом, концентрация ЗНС из расчета на объем опухоли (около 3 см³) составила около 133 мкг/см³.

В контрольной группе (3 крысы) процедура ПФТТ поводилась без применения ОПА: непрерывное лазерное облучение мощностью 2 Вт проводилось в течение 15 минут с плотностью мощности на поверхности кожи над опухолью 2.3 Вт/см². Температура нагрева поверхности кожи достигала 60±0.5°С. В экспериментальной группе процедура ПФТТ разделялась на два этапа: на первом этапе на поверхность кожи над опухолью двум крысам наносился ОПА1 (смесь: 70% глицерина, 5% ДМСО, 25% воды в объемных долях), одной крысе наносился ОПА2 (смесь: 70% глицерина, 10% ДМСО, 20% воды в объемных долях) объемом 1 мл и проводилось непрерывное лазерное облучение мощностью до 1 Вт в течение 10 мин, при этом плотность мощности на поверхности кожи составляла 1.2 Вт/см². Температура нагрева кожи составляла 41±1°С. На данном этапе происходило оптическое просветление кожи за счет проникновения глицерина в биоткань и замещения водного компонента внутритканевой жидкости, что вызывало согласование показателей преломления компонентов биоткани. Затем на втором этапе мощность лазерного излучения увеличивалась до 2 Вт, и облучение продолжалось в течение еще 15 мин, при этом плотность мощности на поверхности кожи составляла 2.3 Вт/см². Температура поверхности кожи достигала 59±1°С.

До облучения и сразу после каждого этапа процедуры регистрировались спектры диффузного отражения кожи над опухолью с помощью стандартных волоконных спектрометров USB4000-Vis-NIR (Ocean Optics, США) в спектральном диапазоне 400-900 нм и NIRQuest (Ocean Optics, США) в спектральном диапазоне 930-2100 нм.

После применения ОПА2 и низкоинтенсивного лазерного облучения наблюдались небольшие эритема и отек кожи в месте облучения (за счет повышенной концентрации ДМСО), что вызывало изменение в спектрах диффузного отражения: снижение коэффициента отражения в полосах поглощения гемоглобина (546 и 576 нм) и воды (1434 и 1958 нм). Однако данные изменения не наблюдаются при использовании ОПА1. После ПФТТ с предварительным оптическим просветлением кожи с помощью ОПА1 и ОПА2 в области поглощения гемоглобина наблюдался переход Q-полос (546 и 576 нм) в одну полосу (555 нм), что объясняется переходом оксигенированной формы гемоглобина в дезоксигенированную при нагревании. При ПФТТ без предварительного оптического просветления кожи (контроль) наблюдалось исчезновение характерных полос поглощения гемоглобина, что связано с его коагуляцией. Кроме того, за счет нагрева происходила значительная дегидратация биоткани, что проявлялось в выравнивании спектра диффузного отражения и уменьшении его наклона. Таким образом, эксперимент подтверждает, что при просветлении ткани, находящейся на пути лазерного излучения к опухоли, наблюдается значительное снижение негативного влияния на нее.

Усредненные значения диффузного отражения, измеренные в двух спектральных диапазонах, представлены на чертеже. Хорошо видно, что искажения спектров диффузного отражения значительно менее выражены при проведении двухэтапной процедуры ПФТТ с использованием предварительного оптического просветления кожи, чем при традиционной процедуре ПФТТ. Данный эффект связан, по-видимому, во-первых, со снижением рассеяния лазерного излучения в коже, что способствует тому, что больше излучения проникает в ткани опухоли и поглощается в областях локализации ЗНС, а во-вторых, гигроскопическими свойствами глицерина, способного удерживать воду в коже, снижая степень ее дегидратации в процессе нагрева.

Таким образом, применение техники оптического просветления способствует снижению повреждения поверхностных тканей в процессе ПФТТ подкожно перевитых модельных опухолей у крыс.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, в частности к онкологии, и может быть использовано при проведении лазерной гипертермии опухолей. Выполняют внутриопухолевое введение суспензии золотых наночастиц с плазмонным резонансом и проводят облучение опухоли лазерным излучением на длине волны 750-1200 нм. При этом перед облучением на поверхность кожи над опухолью наносят оптический просветляющий агент. Облучение осуществляют в два этапа, на первом этапе облучают в течение 10 минут с плотностью мощности, обеспечивающей нагрев кожи до 41°С; на втором этапе облучают в течение 15 минут с плотностью мощности, обеспечивающей нагрев кожи до 59°С. В качестве просветляющего агента выбрана смесь глицерина, ДМСО и воды в объемных долях 70%:5%:25% соответственно. Способ позволяет снизить негативное влияние на окружающие опухоль здоровые ткани, в том числе на ткани, находящиеся на пути лазерного излучения к опухоли, за счет комплексного проведения лазерной гипертермии при введении в опухоль золотых наностержней и применения техники оптического просветления тканей, находящихся на пути лазерного излучения к опухоли. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ лазерной гипертермии опухолей в эксперименте, включающий внутриопухолевое введение суспензии золотых наночастиц с плазмонным резонансом, облучение опухоли лазерным излучением на длине волны 750-1200 нм, отличающийся тем, что перед облучением на поверхность кожи над опухолью наносят оптический просветляющий агент, облучение осуществляют в два этапа, на первом этапе облучают в течение 10 минут с плотностью мощности, обеспечивающей нагрев кожи до 41°С; на втором этапе облучают в течение 15 минут с плотностью мощности, обеспечивающей нагрев кожи до 59°С.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве просветляющего агента выбрана смесь глицерина, ДМСО и воды в объемных долях 70%:5%:25% соответственно.