ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫЕ ПРАЙМЕРЫ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Coccidioides posadasii Российский патент 2009 года по МПК C12N15/30 C12Q1/68 

Изобретение относится к биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано в медицине для выявления генетического материала одного из возбудителей кокцидиоидомикоза - Coccidioides posadasii - в пробах как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований.

C.posadasii - диморфный гриб, является одним из возбудителей особо опасного микоза и имеет значительное географическое распространение, включая юго-западную часть США, Центральную и Южную Америку (Fisher М.С.et al., 2001; Fisher M.C., Taylor J.W., 2003), в отличие от C.immitis, который эдемичен только для Калифорнии (США). Фенотипических признаков, с помощью которых можно было бы дифференцировать эти 2 близкородственных вида, пока не установлено. Выделение некалифорнийского генотипа возбудителя кокцидиоидомикоза в самостоятельный вид - C.posadasii стало возможным только на основании результатов генетических исследований в 2002 г. (Fisher M.C. et al., 2002).

Метод полимеразной цепной реакции является прямым методом выявления ДНК данного микромицета и обладает высокой специфичностью и чувствительностью. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации ДНК-комплементарное достраивание ДНК матрицы, осуществляемое с помощью фермента ДНК-полимеразы.

Процесс удвоения нуклеиновых кислот можно использовать для получения копий коротких участков ДНК, специфичных для конкретного микроорганизма, т.е. осуществлять целенаправленный поиск таких специфических участков, что и является целью генодиагностики для выявления возбудителя кокцидиоидомикоза.

Для эффективного проведения ПЦР необходимы праймеры - синтетические олигонуклеотиды определенного размера, специфические для каждого типа возбудителя. Праймеры комплементарны последовательностям ДНК на левой и правой границах специфического фрагмента и ориентированы таким образом, что достраивание новой цепи ДНК протекает только между ними. В результате ПЦР происходит многократное увеличение числа копий (амплификация) специфического участка гена, катализируемое ферментом ДНК-полимеразой. Выбор специфического фрагмента и подбор праймеров играет важнейшую роль в специфичности проведения амплификации, что сказывается на качестве проведения анализа исследуемого микромицета.

Наиболее близким аналогом являются специфические олигонуклеотиды, фланкирующие фрагмент гена Ag2/PRA (antigen 2/proline-rich antigen), экспрессия которого происходит в паразитической стадии развития гриба (Bialek R. et al. PCR assays for identification of Coccidioides posadasii based on the nucleotide sequence of the antigen 2/proline-rich antigen. J. Clin. Microbiol. 2004. Vol.42, №2. P.778-783). Сконструированные праймеры авторы использовали в гнездной ПЦР для идентификации возбудителя C.posadasii. Однако в работе тестировали образцы тканей, пораженных только С.posadasii, а сведения о тестировании штаммов C.immitis отсутствуют. Применение гнездной ПЦР имеет определенный недостаток - это высокий риск контаминации проб на втором этапе постановки реакции.

В 2006 году в публикации Т. Umeyama et al. (Novel approach to designing primers for identification and distinction of the human pathogenic fungi Coccidioides immitis and Coccidioides posadasii by PCR amplification. J. Clin. Microbiol. 2006. Vol.44, №5. P.1859-1862) предложены праймеры для дифференцирования двух видов Coccidioides на основе нуклеотидной последовательности C.immitis contig 2.2 (accession number AAEC02000002), обозначенные Coi9-1F и Coi9-1R. Отличие этих двух видов микромицетов заключается в длине синтезируемых ампликонов - у C.posadasii фрагмент ДНК короче на 86 п.н. Однако в этом случае возникает сложность интерпретации результатов ПЦР при электрофоретическом разделении фрагментов ДНК и необходимости использования дополнительных стандартов молекулярных размеров. Кроме того, сами же авторы в работе отмечают, что эти олигонуклеотидные затравки не испытывались на клиническом материале.

Целью настоящего изобретения является разработка олигонуклеотидных праймеров для идентификации C.posadasii методом полимеразной цепной реакции.

Цель достигается конструированием специфичных праймеров для идентификации ДНК одного из возбудителей кокцидиоидомикоза C.posadasii, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру:

5'-CACTTCTTAAGTCTTATTTCC-3'- CpSOW82s

5'-GGCATTGATCGTCACCTCCAT-3' - CpSOW82as

Характеристика олигонуклеотидных праймеров и участка амплифицируемой ДНК.

Основываясь на данных, представленных в базе GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information), были подобраны праймеры, обозначенные CpSOW82s - CpSOWS2as, комплементарные фрагменту гена гликопротеина внешней стенки сферул SOWgp82 (spherule outer wall glycoprotein) для идентификации C.posadasii. Расчетная длина специфического фрагмента составляла 300 п.н.

В качестве положительного контроля эксперименты проводили на типовом штамме C.posadasii 36 Silveira, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микромицета в концентрациях от 1×10⁶ артроспор/мл до 1×10¹ артроспор/мл. Подсчет клеток проводили в камере Горяева. Апробация праймеров была осуществлена на наборе штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза коллекционного центра МЖК Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

Чувствительность реакции амплификации с праймерами CpSOW82s-CpSOW82as оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведении чистых культур возбудителей кокцидиоидомикоза, и составила - 1×10²-1×10³ артроспор/мл. С помощью предлагаемых олигонуклеотидных праймеров были проанализированы биоптаты и кровь от лабораторных животных, экспериментально зараженных возбудителем кокцидиоидомикоза. Для обнаружения возбудителей кокцидиоидомикоза методом ПЦР оценена возможность использования сконструированных праймеров для анализа биологического материала (печень, селезенка, легкие) при экспериментальной инфекции. Показано, что в реакции амплификации возбудитель детектировался в суспензиях органов от всех белых мышей, зараженных культурой данных микромицетов, на всех сроках наблюдения.

Примеры конкретного выполнения.

Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК возбудителя кокцидиоидомикоза C.posadasii методом ПЦР.

На основе теоретического изучения секвенированных нуклеотидных последовательностей возбудителей кокцидиоидомикоза, присутствующих в базах данных (EMBL, Genbank, DDBJ) для конструирования праймеров, была выбрана последовательность гена гликопротеина внешней стенки сферул SOWgp82 (spherule outer wall glycoprotein) C.posadasii, размер которой составляет 3635 п.н. (GenBank NCBI, AF308873). С помощью компьютерного анализа были выбраны специфические участки ДНК, имеющие нуклеотидные отличия от филогенетически близкогородственного микромицета С.immitis и других микроорганизмов. Расчетная длина фрагмента ДНК, фланкируемого предлагаемыми праймерами - 300 п.н. (табл.1).

Праймеры были проанализированы с помощью компьютерной программы BLASTN на web-сервере Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) (http://www.ncbi.nlm.mh.gov/BLAST/) для установления гомологии между ними и нуклеотидными последовательностями близкородственных возбудителей особо опасных микозов и гетерологичных микроорганизмов, присутствующих в базах данных (EMBL, GenBank, DDBJ). На момент проведения компьютерного анализа гомологии выявлено не было.

Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК возбудителя кокцидиоидомикоза C.posadasii с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров.

Для исключения возможности неспецифического отжига праймеров до достижения заданных температурных параметров используют режим «горячего старта». «Горячий старт» обеспечивается приготовлением реакционной смеси, состоящей из двух слоев (верхнего и нижнего), разделенных прослойкой воска. Нижний слой содержит предлагаемые праймеры для идентификации возбудителя кокцидиоидомикоза C.posadasii и дезоксирибонуклеозид-трифосфаты; верхний - реакционный буфер, фермент Taq-полимеразу и ДНК-матрицу. Плавление воска и перемешивание реакционных компонентов происходит на этапе предварительной денатурации ДНК при 95°С.

Общий объем реакционной смеси 25 мкл на 1 пробу.

Приготовление «нижней» реакционной смеси:

Раствор dNTP (2,5 мМ) - 2 мкл

Праймер CpSOW82s (12 пМ/ мкл) - 1 мкл

Праймер CpSOW82as (12 пМ/ мкл) - 1 мкл

вода деиоинизированная - 0,6 мкл

Сверху наслаивается расплавленный воск 11 мкл.

(Приготовленные таким образом смеси можно хранить при t+8°С до 6 мес)

Состав «верхней» реакционной смеси:

(×10) реакционный буфер ((NH₄)₂SO₄ - 170 мМ, BSA - 2 мг/мл,

DTT - 10 мМ, Трис - 670 мМ, рН 8,8) - 2,5 мкл

MgCl₂ 0,25 M - 0,2 мкл

фермент Taq-полимераза (5 ед/мкл) - 0,2 мкл

вода деиоинизированная - 7,1 мкл

исследуемая проба ДНК - 10 мкл.

Сверху наслаивают по 30 мкл минерального масла

Условия проведения реакции для амплификатора «Терцик» (Москва): этап предварительной денатурации ДНК при 95°С - 5 мин, затем в течение 42 циклов - денатурация ДНК при 95°С - 10 сек; отжиг праймеров при 55°С - 10 сек; элонгация цепи при 72°С - 10 сек, с финальной полимеризацией в течение 1 мин.

После этого продукты реакции разделяют путем электрофореза в 3% агарозном геле, сравнивая его подвижность с подвижностью полос маркеров молекулярного веса. При использовании разработанных олигонуклеотидных праймеров в реакции амплификации с ДНК возбудителей кокцидиоидомикоза синтезируемые ампликоны по электрофоретической подвижности соответствуют расчетным данным (фиг.1.)

Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК возбудителя кокцидиоидомикоза C.posadasii.

Чувствительность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведении артроспор чистых культур возбудителей кокцидиоидомикоза.

Обеззараживание исследуемых проб производят добавлением раствора мертиолята натрия до конечной концентрации 0,1% и прогреванием в течение 40 мин при температуре 56°С. Выделение ДНК из чистых культур микромицетов осуществляют с помощью метода гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом (Sandhu G.S. et al., 1995). Постановку реакции ПЦР осуществляют, как описано в примере 2. При тестировании коллекции грибных культур C.posadasii и C.immitis Волгоградского научно-исследовательского противочумного института с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров продукт амплификации синтезировался только с ДНК штаммов C.posadasii с чувствительностью 1×10²-1×10³ артроспор/мл. С другими видами близкородственных грибов, в том числе C.immitis, и гетерологичных микроорганизмов в реакции ПЦР с разработанными праймерами в 100% случаев получен отрицательный результат.

В качестве примера на фиг.2 показана электрофореграмма результатов реакции амплификации при определении чувствительности ПЦР с помощью сконструированных праймеров с ДНК типового штамма C.posadasii 36 Silveira, а на фиг.3 - электрофореграмма результатов реакции амплификации при определении специфичности сконструированных праймеров.

Таким образом, разработанные праймеры могут быть использованы для идентификации C.posadasii, позволяют дифференцировать его от филогенетически близкородственного микромицета С.immitis и детектировать в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью ДНК этого возбудителя кокцидиоидомикоза в биологическом материале и объектах окружающей среды.

Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии. Сконструирована пара специфичных олигонуклеотидных праймеров для идентификации ДНК C.posadasii, обладающих активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющих следующую структуру: 5'-CACTTCTTAAGTCTTATTTCC-3'-CpSOW82s 5'-GGCATTGATCGTCACCTCCAT-3'-CpSOW82as. Использование праймеров позволяет идентифицировать C.posadasii, дифференцировать его от филогенетически близкородственного микромицета C.immitis и детектировать в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью ДИК этого возбудителя кокцидиоидомикоза в биологическом материале и объектах окружающей среды. Изобретение может быть использовано в медицине для выявления генетического материала одного из возбудителей кокцидиоидомикоза - Coccidioides posadasii в пробах как для диагностики в практическом здравоохранении и службе Роспотребнадзора, так и для научных исследований. 3 ил. 1 табл.

Олигонуклеотидные праймеры для идентификации Coccidioides posadasii методом полимеразной цепной реакции, обладающие активностью прямого и обратного праймеров в реакции амплификации, имеющие следующую структуру:

5'-CACTTCTTAAGTCTTATTTCC-3'-CpSOW82s

5'-GGCATTGATCGTCACCTCCAT-3'-CpSOW82as,

комплементарные фрагменту гена гликопротеина внешней стенки сферул SOWgp82 (spherule outer wall glycoprotein) С.posadasii.