СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ мРНК КАТАЛИТИЧЕСКОЙ СУБЪЕДИНИЦЫ ТЕЛОМЕРАЗЫ (hTERT) Российский патент 2009 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к исследованиям биологического материала, в частности к определению относительного уровня мРНК hTERT - субъединицы теломеразы.

Теломераза - это фермент, который осуществляет наращивание теломерных районов хромосомной ДНК и является РНК-зависимой ДНК полимеразой [2]. Этот фермент активен в большинстве стволовых, раковых и половых клеток, чем предоставляет им возможность неограниченного деления. Активность теломеразы в совокупности с длиной теломер, таким образом, отражают пролиферативный потенциал клетки. Ранее считалось, что во всех дифференцированных соматических клетках теломераза не работает, но в последнее время показана ее активность в лейкоцитах периферической крови [10] и в активированных лимфоцитах [9], а также в слизистых клетках кишечника [3]. Основными субъединицами человеческой теломеразы являются: hTR (теломеразная РНК, фрагмент которой служит матрицей при синтезе теломерных повторов); hTERT (human telomerase reverse transcriptase) - каталитическая субъединица фермента теломеразы; а также еще ряд ассоциированных с теломеразой белков, которые обуславливают или регулируют деятельность фермента. Показано, что наличие именно hTERT является лимитирующим фактором в проявлении активности теломеразы [2].

С использованием определения уровня мРНК hTERT теломеразы в настоящее время решается ряд исследовательских задач, направленных, в основном, на разработку новых методов диагностики, прогноза и оценки эффективности терапии онкологических заболеваний [1, 7]. Также существующие методы определения уровня мРНК hTERT теломеразы активно используются как в фундаментальных исследованиях, посвященных изучению периферического гомеостаза Т- и В-лимфоцитов, так и при исследованиях патогенеза ряда заболеваний, ассоциированных с нарушением Т-клеточного гомеостаза, таких как ревматоидный артрит, системная красная волчанка [5], рассеянный склероз и атонический дерматит [10], в связи с чем способы определения уровня мРНК hTERT теломеразы не теряют своей актуальности. Исходя из этого, определение статуса теломеразы в клетках оказывается значимым не только для диагностики злокачественного заболевания, но и во множестве других исследовательских задачах. К настоящему времени разработан целый ряд методов специфического определения нуклеиновых кислот. Уровень экспрессии мРНК hTERT теломеразы может быть определен при помощи нескольких способов.

Наиболее часто мРНК hTERT теломеразы оценивают с использованием метода Real-time RT-PCR (обратного ПЦР в реальном времени), позволяющего, в отличие от обычной обратной полимеразной цепной реакции, количественно оценить содержание исследуемой РНК в образце. Real-time RT-PCR позволяет отслеживать ход реакции, что достигается путем определения выхода продукта после каждого цикла амплификации (для детекции PCR-продукта используются флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству продукта). Относительная концентрация субстрата определяется на основании кинетической кривой [11]. С помощью метода real-time RT-PCR возможно выявление даже транскрипта, представленного всего одной копией, соответственно этот метод требует меньшие количества материала, чем другие методы и, кроме того, не требует никаких манипуляций после амплификации.

Также для количественной оценки мРНК hTERT теломеразы часто используют Northern Blotting, когда выявление интересуемой мРНК достигается за счет ее гибридизации со специфичным олигонуклеотидным зондом, меченным радиоизотопом, либо с антителами к мРНК. После визуализации полученная картина отражает экспрессию РНК или белка в образце [8]. Этот метод позволяет определить внутриклеточную локализацию фермента путем разделения ядерной и цитоплазматической фракций.

К недостаткам обоих этих методов можно отнести их ограниченную информативность, поскольку технологическая необходимость разрушения клеток для выделения мРНК не позволяет одновременно охарактеризовать исследуемый материал по другим параметрам (к примеру, таким, как субпопуляционная принадлежность или экспрессия интересуемых протеинов) без дополнительного использования методов их сепарации.

Этот недостаток отсутствует в методе гибридизации in situ (FISH - Fluorescein In Situ Hybridization), который взят в качестве прототипа. Данный метод позволяет обнаруживать содержание мРНК в отдельных клетках и даже выявлять ее внутриклеточную локализацию. Визуализация интересуемой РНК достигается за счет внутриклеточной гибридизации олигонуклеотидного зонда, меченного флуорохромом [4]. Процедуру проводят на тканевых срезах или мазках крови, а анализ проводится либо визуально, либо с использованием цифровой флуоресцентной микроскопии. К преимуществу данного метода можно отнести возможность оценки экспрессии исследуемой РНК на уровне единичной клетки, а к недостаткам - потребность в дорогостоящем оборудовании и низкую производительность метода.

Целью изобретения является создание способа определения уровня мРНК каталитической субъединицы теломеразы (hTERT), обладающего высокой производительностью.

Способ позволяет выявлять мРНК hTERT на уровне единичной клетки с помощью гибридизации in situ, с последующим анализом на проточном цитофлуориметре (FlowFISH). По уровню флуоресценции клеток, прошедших гибридизацию с флуоресцентным зондом, комплементарным мРНК hTERT, определяют относительное количество искомой мРНК в каждой клетке, причем уровень мРНК hTERT в клетках определяют как средний уровень их флуоресценции после гибридизации за вычетом аутофлуоресценции клеток, прошедших те же условия в отсутствии зонда. В качестве стандарта гибридизации параллельно определяют относительное количество мРНК hTERT в клетках человеческой опухолевой линии, в которой этот фермент постоянно активен, и мРНК hTERT стабильно присутствует в определенном количестве. Отношение этого показателя к показателю относительного количества мРНК hTERT в клетках исследуемого материала наглядно отражает количественный уровень мРНК каталитической субъединицы теломеразы в исследуемом материале, по которому можно судить об активности этого фермента в клетках.

Способ позволяет исследовать большее количество образцов с меньшими временными и финансовыми затратами.

Описание способа с примерами конкретной реализации.

5 мл периферической крови, стабилизированной с гепарином, центрифугируют в градиенте фиколл-верографин в течение 20 минут при 2,7 тыс. об/мин в медицинской лабораторной центрифуге, после чего кольцо мононуклеарных клеток собирают и отмывают дважды с 5 мл забуференного физиологического раствора с ЭДТА и азидом Na (ЗФР-ЭА) по 5 минут при 1 тыс. об/мин. Осадок ресуспендируют в 1 мл ЗФР-ЭА и подсчитывают количество клеток в камере Горяева.

Для гибридизации используют 10⁶ клеток на одну пробу. Исходя из этого, необходимое количество клеток снова осаждают центрифугированием и ресуспендируют осадок в гибридизационном растворе, содержащем 50% формамид, 20 мМ Tris и 1% BSA, и доведенный до конечного объема ЗФР-ЭА. Гибридизацию каждой пробы проводят в объеме 300 мкл. Контрольная проба содержит только клетки, ресуспендированные в гибридизационном растворе. К опытной пробе добавляют пептидонуклеиновый (PNA) зонд, меченный флуорохромом FITC (Bio-Synthesis), комплементарный участку мРНК hTERT, в конечной концентрации 0,9 мкг/мл. Все пробы денатурируют в течение 10 минут при 80°С, периодически перемешивая. Гибридизация проводится в темноте при комнатной температуре в течение 2-х часов при постоянном перемешивании.

После этого клетки переносят в цитометрические пробирки (Falcon 2058) с 3 мл ЗФР-ЭА и осаждают в медицинской центрифуге в течение 5 минут при 1500 об/мин. Осадок ресуспендируют в 3 мл ЗФР-ЭА, инкубируют 30 минут в термостате при 37°С и снова осаждают аналогичным образом. К осадку добавляют 500 мкл ЗФР-ЭА.

Опухолевые клетки, используемые в качестве стандарта гибридизации, хранятся при -80°С в FCS с 10% DMSO. Для гибридизации 2х10⁶ клеток размораживают и осаждают в течение 5 минут при 1000 об/мин с 5 мл ЗФР-ЭДТА. Далее гибридизацию и анализ данных проводят параллельно с исследуемыми мононуклеарными клетками.

Анализ проб проводят на проточном цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с помощью программного обеспечения Cell Quest^PRO (Becton Dickinson, США). По параметрам прямого и бокового светорассеяния выделяют регион, в котором затем определяют сигнал флуорохрома FITC с использованием канала FL1. Наличие мРНК hTERT в клетках определяют как средний уровень их флуоресценции (mean fluorescence intensity, MFI) по каналу FL1 после гибридизации в присутствии PNA зонда (фиг.2) за вычетом фоновой (аутофлуоресценции) клеток, прошедших те же условия в отсутствии PNA зонда (фиг.1). Отношение полученного показателя в клетках опухолевой линии к аналогичному показателю в исследуемых клетках соответствует степени активности в них фермента теломеразы.

Ниже приведены результаты, поясняющие данный способ определения уровня мРНК hTERT как показателя уровня активности фермента.

Пример 1. Определение продукции мРНК hTERT теломеразы в лимфоцитах периферической крови донора по сравнению с таковой в опухолевой линии МТ4, Было установлено содержание мРНК hTERT в лимфоцитах и опухолевых клетках путем определения уровня флуоресценции по первому каналу в регионах лимфоцитарного облака и опухолевых клеток соответственно (фиг.3). Средняя интенсивность флюоресценции (СИФ) исследуемых клеток определялась как СИФ с PNA минус СИФ без PNA и аналогично для клеток МТ4. Принимая за единицу количество мРНК hTERT клеток опухолевой линии, установлено, что относительное количество мРНК hTERT в лимфоцитах составляет 0,27 от заданного стандарта экспрессии мРНК каталитической субъединицы теломеразы.

Пример 2. Определено повышение уровня мРНК hTERT теломеразы лимфоцитов в ответ на активацию анти-CD3 моноклональными антителами в культуре. Стабилизированную гепарином периферическую кровь двух доноров центрифугировали в градиенте фиколл-верографин 20 минут при 2,7 тыс. об/мин, после чего кольцо мононуклеарных клеток собрали и отмыли дважды с 5 мл ЗФР с ЭДТА по 5 минут при 1 тыс. об/мин. После подсчета количества клеток в камере Горяева часть клеток заморозили в FCS с 10% DMSO, а часть посадили в лунки 24-луночного планшета в концентрации 2 млн на 1 мл питательной среды RPMI 1640 с 10% FCS и с IL2 в количестве 100 ед./мл. В половину лунок были добавлены также анти-CD3 антитела. В течение семи суток с начала культивирования каждые 24 часа часть клеток замораживали в FCS с 10% DMSO. Затем был определен уровень мРНК hTERT как в активированных, так и в исходных клетках, а также в клетках опухолевой линии МТ4 с помощью вышеописанного метода. Из фиг.4 видно, что в МНК, культивированных только с IL2, количество мРНК hTERT не меняется значительно по сравнению с исходным и с количеством мРНК в опухолевой линии, в то время как МНК, активированные дополнительно анти-CD3 антителами, с первых же суток экспрессируют мРНК hTERT в количествах, в несколько раз превышающих исходный уровень. При этом пик экспрессии приходится на третьи сутки, после чего количество мРНК hTERT начинает снижаться. Полученные данные свидетельствуют об адекватном ответе клеток на стимуляцию анти-CD3 антителами, который заключается в повышении продукции мРНК hTERT с пиком на 3 сутки культивирования.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о возможности применения метода для количественной оценки уровня мРНК теломеразы в различных клетках относительно стандарта - количества мРНК hTERT в клетках опухолевой линии. Значительным преимуществом этого метода по сравнению с другими является возможность исследовать большее количество образцов с меньшими временными затратами.

Источники информации

1. Amioka Т., Kitadai Y., Hiyama T. et al. Expression of human telomerase reverse transcriptase mRNA in esophageal cancers and precancerous lesions // Oncology Reports. - 2004. - Vol.11. - P.51-55.

2. Cong Y., Wright W.E., Shay J.W. Human telomerase and its regulation // Microbiology and molecular biology reviews. - 2002. - Vol.66, №3. - Р.407-425.

3. Eiso H., Keiko H., Naokuni T. et al. Telomerase activity in human intestine // International Journal of Oncology. - 1996. - Vol.9, №3. - Р.453-458.

4. Kammori M., Kanauchi H., Nakamura K. et al. Demonstration of human telomerase reverse transcriptase in human colorectal carcinomas by in situ hybridization // International Journal of Oncology. - 2002. - Vol.20. - P.15-21.

5. Klapper W., Moosig F., Sotnikova A. et al. Telomerase activity in В and Т lymphocytes of patients with systemic lupus erythematosus // Ann. Rheum. Dis. - 2004. - Vol.63. - 1681-1683.

6. Ray A., Norden B. Peptide nucleic acid (PNA): its medical and biotechnical applications and promise for the future // FASEB J. - 2000. - Vol.l4. - 1041-1060.

7. Terasaki Т., Kyo S., Takakura M. et al. Analysis of telomerase activity and telomere length in bone and soft tissue tumors // Oncology Reports. - 2004. - Vol.11. - P.1307-1311.

8. Tesmer V.M., Ford L.P., Holt S.E. et al. Two Inactive Fragments of the Integral RNA Cooperate To Assemble Active Telomerase with the Human Protein Catalytic Subunit (hTERT) In Vitro // Molecular and Cellular Biology. - 1999. - Vol.l9, №9. - P.6207-6216.

9. Weng N.P., Levine B.L., June C.H., Hodes R.J. Regulated expression of telomerase activity in human Т lymphocyte development and activation // The Journal of Experimental Medicine. - 1996. - Vol.183. - P.2471-2479.

10. Wu К., Higashi N., Hansen E.R. et al. Telomerase activity is increased and telomere length shortened in Т cells from blood of patients with atopic dermatitis and psoriasis // The Journal of Immunology. - 2000. - Vol.165. - P.4742-4747.

11. Yajima Т., Yagihashi A., Kameshima H. et al. Quantitative reverse transcription-PCR assay of RNA components of human telomerase using the TaqMan fluoogenic detection system // Clinical Chemistry. - 1998. - Vol.44, №12. - Р.2441-2445.

Изобретение относится к исследованиям биологического материала. Предложен способ определения уровня мРНК hTERT - субъединицы теломеразы. Способ позволяет выявлять мРНК hTERT на уровне единичной клетки с помощью гибридизации in situ с флуоресцентным зондом с последующим анализом на проточном цитофлуориметре. Изобретение обеспечивает возможность количественной оценки уровня мРНК теломеразы в различных клетках относительно стандарта - количества мРНК hTERT в клетках опухолевой линии и исследования большего количества образцов с меньшими временными и финансовыми затратами. 4 ил.

Способ определения уровня мРНК каталитической субъединицы теломеразы (hTERT) с помощью гибридизации in situ с флуоресцентным зондом, отличающийся тем, что последующий анализ исследуемых клеток проводят на проточном цитофлуориметре, причем уровень мРНК hTERT в клетках определяют как средний уровень их флуоресценции после гибридизации за вычетом аутофлуоресценции клеток, прошедших те же условия в отсутствии зонда; аналогично определяют уровень мРНК hTERT в клетках опухолевой линии, и по отношению к нему показателя уровня мРНК hTERT в исследуемых клетках определяют относительный количественный уровень мРНК hTERT в этих клетках.