СПОСОБ, ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, КОМПОЗИЦИИ И НАБОР ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ИЗМЕНЕНИЙ В ПРОМОТОРЕ ГЕНА hTERT Российский патент 2020 года по МПК C12Q1/68 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение касается способа высокочувствительного детектирования мутаций c.-124 C>T и c.-146 C>T в промоторе гена Htert, реакционных композиций, содержащих праймеры для амплификации и зонды для генотипирования, последовательностей, упомянутых как SEQ ID nr.1 - SEQ ID nr.6, которые были сконструированы, чтобы проявлять высокую специфичность к этим мутациям, а также наборов, содержащих такие композиции для применения рассматриваемого способа.

Данное изобретение может давать преимущества при использовании для детектирования следовых количеств мутаций c.-124C>T и c.-146C>T, присутствующих в биологических образцах и in vitro, благодаря высокой чувствительности способа и специфичности создаваемых генных последовательностей, позволяющей, таким образом, осуществлять раннее обнаружение, распознавание или предсказание рецидивов и наблюдение за заболеваниями, связанными с этими мутациями, такими как, среди прочих, карциномы мочевого пузыря, карциномы щитовидной железы, плоскоклеточный рак, базальноклеточные карциномы, рак кожи, раковые заболевания центральной нервной системы и гепатоцеллюлярная карцинома, и в итоге создает основу для выбора соответствующего курса лечения.

Таким образом, данное изобретение относится к области техники медицины, фармацевтики, молекулярной биологии, биохимии и генетики человека.

Уровень техники

Соматические мутации, которые происходят во время репликации ДНК, предшествующей митотическому делению, являются причиной определенных заболеваний человека, в особенности определенных типов раковых заболеваний. Присутствие фермента теломеразы наблюдалось в большом количестве, около 75-80%, раковых клеточных линий. Недавно заявители идентифицировали мутации в промоторе гена теломеразы, кодирующего этот фермент, гене TERT, конкретно, мутации в позициях c.-124C>T и c.-146C>T (от стартового [кодона] ATG). Эти мутации были связаны с несколькими заболеваниями, такими как раковые заболевания центральной нервной системы (43-51%), карциномы мочевого пузыря (59-66%), гепатоцеллюлярные карциномы (59%), карциномы щитовидной железы (10%), раковые заболевания кожи (меланома 29% -73%, 73% базальноклеточная карцинома (BCC) и плоскоклеточная карцинома (SCC) 45%), и гастроинтестинальные стромальные опухоли (GISTs) (4%) [1-7].

Тот факт, что мутации в промоторе теломеразы присутствуют со сравнительно высокой частотой при определенных раковых [опухолях], делает их потенциальными биомаркерами для раннего обнаружения, диагностики, прогнозирования, обнаружения рецидивов или предсказания/контроля реакций на терапию опухолей, таких как, среди прочих, опухоли центральной нервной системы, карциномы мочевого пузыря, гепатоцеллюлярные карциномы, карциномы щитовидной железы и раковые заболевания кожи. Например, при раке мочевого пузыря соматические мутации в позициях c.-124C>T и c.-146C>T (начиная со стартового [кодона] ATG) гена теломеразы встречаются с частотой, достигающей 85%, и, вместе с мутациями R248C и S249C в гене рецептора [фактора] роста фибробластов 3 (FGFR3) [9], являются наиболее надежными биомаркерами рака мочевого пузыря.

Вместе с тем, для использования образцов биологических жидкостей in vitro (например, среди прочих, мочи, плазмы, спинномозговой жидкости, [материала] аспирационной цитологии), способ обнаружения мутаций в позициях c.-124 C>T и c.-146C>T (из ATG) в гене теломеразы должен обладать высокой аналитической чувствительностью, чтобы обнаруживать следовые количества мутантных аллелей, даже тогда, когда они «разбавлены» в образце большим избытком аллелей «дикого типа».

Документ WO2015153808 раскрывает способы и композиции, используемые в обнаружении некоторых заболеваний, особенно раковых, более конкретно, раковых заболеваний щитовидной железы, связанных с мутациями в позициях c.-124C>T и c.-146C>T гена TERT. Вместе с тем, нуклеотидные последовательности, раскрытые в этом документе, используются для обнаружения этих мутаций способом прямой амплификации, зависимы от последовательности [образца], и имеют ограниченную чувствительность, когда представленность нормальной последовательности сравнительно высока по сравнению с мутантной последовательностью. С другой стороны, они подвержены неспецифической амплификации, так что они не показывают высокой специфичности к этим мутациям, что в целом обусловливает недостаточно высокую специфичность и чувствительность способа.

Документ WO2014160834 раскрывает способы и композиции, пригодные для обнаружения и лечения различных типов тироидных раковых заболеваний, связанных с мутациями в позициях c.-124 C> T и c.-146 C>T гена TERT. Вместе с тем, раскрытые в этом документе нуклеотидные последовательности не показывают высокой чувствительности в случаях, когда представленность нормальных последовательностей избыточна по сравнению с мутантными последовательностями, и предлагаемый способ основан на секвенировании ДНК с использованием набора для секвенирования "BigDye terminator v3.1" и прибора Applied Biosystems ABI PRISM equipment 3730, который имеет ограниченную чувствительность к редким аллелям в реакции. Далее, присутствие мутации должно быть подтверждено секвенированием в обоих, смысловом и антисмысловом, направлениях, что делает этот способ непрактичным и трудоемким, и применимым только к раковым заболеваниям щитовидной железы.

Таким образом, необходимо разработать способ с достаточной чувствительностью и специфичностью, который позволяет обнаружение таких мутаций в биологических образцах даже в условиях, когда мутированные аллели представлены в очень малых количествах.

Данное изобретение предлагает высокочувствительный способ, который позволяет обнаружение мутаций c.-124 C>T и c.-146 C>T в промоторе гена hTERT, путем конструирования праймеров и зондов, чьи последовательности специфичны для этой задачи.

Краткое описание изобретения

Данное изобретение касается набора праймеров и последовательностей зондов (SEQ ID SEQ ID nr.6 nr.1) для амплификации ДНК и гибридизации биологических образцов, которые были разработаны для обеспечения высокой специфичности в обнаружении мутаций c.-124 C>T и c.-146 C>T в промоторе гена hTERT в соответствии с п. 1 [формулы изобретения].

Поскольку эти праймеры и зонды ДНК обладают высокой специфичностью в обнаружении таких мутаций, это позволяет использовать их в высокочувствительном способе обнаружения этих мутаций.

Данное изобретение также касается композиций для амплификации и гибридизации ДНК, с использованием технологий полимеразной цепной реакции (PCR), содержащих упомянутые последовательности праймеров и зондов на ДНК в соответствии с п. 2 [формулы изобретения].

Эти композиции применимы для обнаружения мутаций c.-124 C>T и c.-146 C>T в промоторе гена hTERT, и могут быть приготовлены заранее или могут быть приготовлены во время реализации способа обнаружения мутаций по данному изобретению.

Еще один объект данного изобретения касается композиций для обнаружения мутаций c.-124 C>T и c.-146 C>T в промоторе гена Htert, содержащих композиции для PCR и ДНК человека из биологического образца, для проверки на наличие этой мутации по п. 7 [формулы изобретения].

В этих композициях количество ДНК в анализируемом образце может быть достаточно низким, учитывая высокую специфичность разработанных для этой цели по данному изобретению праймеров и зондов.

Еще один объект данного изобретения относится к набору, содержащему композицию праймера и специфические генные зонды для обнаружения мутаций c.-124 C>T и c.-146 C>T в промоторе гена hTERT, приготовленные заранее, в соответствии с п. 9 [формулы изобретения].

Этот набор имеет то преимущество, что дает возможность разработки высокочувствительного способа быстрого и надежного обнаружения in vitro мутаций c.-124 C>T и c.-146 C>T в промоторе гена hTERT путем добавления тестового образца ДНК человека для обнаружения упомянутых мутаций.

Еще один объект данного изобретения касается способа обнаружения in vitro мутаций c.-124 C>T и c.-146 C>T в промоторе гена hTERT, используя реакционные композиции, содержащие праймеры для амплификации и зонды для генотипирования, последовательности которых специфичны для этих мутаций, по п. 11 [формулы изобретения].

Этот способ может успешно использоваться для обнаружения следовых количеств таких мутаций, как c.-124 C>T и c.-146 C>T, присутствующих в биологических образцах, благодаря его высокой чувствительности, обусловленной генной последовательностью, разработанной для этой цели и имеющей высокую специфичность к этим мутациям.

Таким образом, данное изобретение может быть применено в раннем обнаружении, идентификации, обнаружении рецидивов и предсказании обнаружения и контроля заболеваний, связанных с такими мутациями, такими как, среди прочих, карциномы мочевого пузыря, карциномы щитовидной железы, раковые заболевания кожи, раковые заболевания центральной нервной системы и гепатоцеллюлярная карцинома, и в итоге дает основу для выработки нужного курса лечения.

Таким образом, еще один объект данного изобретения относится к способу лечения, при котором используются подходящие количества ингибитора промотора гена Htert для индивидов с положительными результатами тестов по данному изобретению на наличие мутаций c.-124 C>T или c.-146 C>T в промоторе гена Htert, по п. 15 [формулы изобретения].

Описание изобретения

Данное изобретение касается способа детектирования in vitro мутаций c.-124 C>T и c.-146 C>T M в промоторе гена hTERT. Упомянутый способ реакции использует композиции, содержащие праймеры для амплификации и зонды для генотипирования, последовательности которых (SEQ ID nr.1 - SEQ ID nr.6) специфичны для этих мутаций.

Таким образом, последовательности праймеров созданы для амплификации и зондов для генотипирования с целью создать основу для указанной реакции амплификации, например, PCR анализа с помощью PCR в реальном времени, PCR с обратной транскрипцией (RT-PCR) или цифрового PCR. 6 последовательностей были синтезированы для праймеров и зондов, как показано в списке последовательностей. Сюда входят последовательности для следующих задач:

Детектирование мутации, находящейся в -124 основаниях выше ATG гена hTERT

SEQ ID n.1: Инициатор F

SEQ ID n.2: Инициатор R

SEQ ID n.3: Зонд -124C

SEQ ID n.4: Зонд- 124T

Детектирование мутации, находящейся в -146 основаниях выше ATG гена hTERT

SEQ ID n.1: Инициатор F

SEQ ID n.2: Инициатор R

SEQ ID n.3: Зонд -146C

SEQ ID n.4: Зонд- 146T

Вышеуказанные последовательности могут быть приготовлены способом нуклеотидного синтеза, используя твердофазные фосфорамидитные нуклеозиды, как описано в публикации: Beaucage, SL; Iyer, RP (1992). "Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach". Tetrahedron 48 (12): 2223. Синтез может быть выполнен на колонках с твердой основой (стекло с заданным размером пор или полистирол), с функционализированных первым основанием 3'-конца каждого олигонуклеотида. Приготовление каждого олигонуклеотида происходит после некоторого количества циклов синтеза, каждый из которых состоит из химических реакций, обычно четырех химических реакций: i) разблокировка (детритилирование), ii) образование пар, iii) протектирование и iv) окисление. В каждом цикле к 5'-концу растущей цепочки присоединяются нуклеотидные остатки, соответствующие требуемой последовательности.

Они могут затем модифицироваться на 5'- и 3'-концевых последовательностях зондов добавлением соответствующих флуорофоров, таких как FAM, Yakima Yellow, гаситель флуоресценции (TAMRA), и др., известных специалистам, для амплифицирующих и гибридизационных реакций в мультиплексном PCR. Таким образом, подходящие флуорофоры по данному изобретению это, например, соединения, известные как Alexa Fluor FAM, TET, JOE, VIC, HEX, Cy3, ATTO 550, TAMRA, ROX, Cy5, Cy5.5.

[Термин] «нуклеотиды» обозначает нуклеотидные последовательности естественного или синтетического происхождения, способные гибридизоваться с помощью образования пар оснований с комплементарными нуклеотидными последовательностями, и могут включать в себя без ограничений ДНК, РНК и нуклеотидные аналоги (например, нуклеиновые кислоты с закрытой конформацией, известные как "закрытые" нуклеиновые кислоты - LNA) или без межнуклеотидных фосфодиэфирных связей(например, пептидо-нуклеиновые кислоты, ПНК) и нуклеиновые кислоты с тиодиэфирными связями или подобные для тех же целей.

Композиции для амплификации и ДНК-гибридизации (PCR-композиции) были приготовлены добавлением реакционных растворов к PCR, доступным на рынке, с разными нуклеотидными последовательностями SEQ ID Nr.1 - SEQ ID nr.6 в разных концентрациях, и бидистиллированной и дважды деионизованной воды.

Реакционные растворы для использования в PCR варьируют в зависимости от желательного типа реакции амплификации. Примером подходящих реакционных растворов PCR для варианта осуществления данного изобретения является раствор "TaqMan® Universal PCR Master Mix", производства фирмы Thermofischer Scientific company или подобные растворы для амплификации и гибридизации ДНК.

«Концентрации зондов» означают молярные концентрации растворов, соответствующие количеству моль каждого зонда на объем раствора, где наномолярное значение (нМ) соответствует 1×10^-9 моль на литр.

Композиции для PCR были приготовлены с различными комбинациями разных концентраций образцов с последовательностями SEQ ID Nr.3 SEQ ID nr.6. Как упоминалось выше, образцы, чьи последовательности описаны в SEQ ID Nr.3 и SEQ ID nr.4, были сконструированы для специфического детектирования мутации c.-124 C>T в промоторе гена Htert, тогда как образцы SEQ ID nr.5 и SEQ ID nr.6 были сконструированы для специфического детектирования мутации c.-146 C>T в промоторе гена Htert.

Таким образом, композиции данного изобретения для PCR могут включать только один или два набора зондов, упомянутых выше, т.е. композиции для PCR данного изобретения могут включать только зонды с SEQ ID NO. 3 и SEQ ID nr.4 (набор c.-124), зонды SEQ ID nr.5 и SEQ ID nr.6 (набор c.-146), или все зонды SEQ ID Nr.3 SEQ ID nr.6 (полный набор c.-124+c.-146).

Там, где композиции по данному изобретению содержат только один набор зонда, набор c.-124 или c.-146, тогда они специфичны только для обнаружения соответствующего мутированного c.-124 C>T или C.-146 C>T. В случае, когда оба набора зондов присутствуют в композиции для PCR-реакций, тогда эти композиции специфичны для обнаружения обеих мутаций c.-124 C>T и c.-146 C>T.

Концентрация нуклеотидных зондов по данному изобретению в растворах подбирается для PCR-реакций для увеличения чувствительности способа по данному изобретению для обнаружения таких мутаций. Предпочтительно, конечная концентрация каждого зонда устанавливается на значениях между 400 и 1600 нМ, наиболее предпочтительно - на конечной концентрации от 800 до 1600 нМ, а в наиболее предпочтительном варианте воплощения данного изобретения значения конечной концентрации каждого зонда соответствуют приблизительно 1600 нМ.

Таким образом, можно получать композиции для PCR, содержащие разные комбинации значений конечных концентраций каждого из зондов, описанных в SEQ ID Nr.3 и SEQ ID nr.6.

Таким образом, в предпочтительной форме композиции для PCR-реакций включают следующие концентрации зондов с последовательностями SEQ ID Nr.3 SEQ ID nr.6:

i. 250 нМ - 500 нМ SEQ ID Nr.3, 400 нМ - 1600 нМ SEQ ID nr.4, 250 нМ - 500 нМ SEQ ID nr.5 и 400 нМ - 1600 нМ SEQ ID nr.6,

или

ii. 250 нМ - 500 нМ SEQ ID Nr.3, 800 нМ - 1600 нМ SEQ ID nr.4, 250 нМ - 500 нМ SEQ ID nr.5 и 800 нМ - 1600 нМ SEQ ID nr.6.

Композиции реакционных смесей для детектирования мутаций c.-124 C>T и c.-146 C>T в промоторе гена Htert были приготовлены добавлением ДНК из исследуемого биологического образца в вышеописанные композиции для PCR.

Тестируемая ДНК может быть получена из ткани, мочи, циркулирующей опухолевой ДНК, зародышевых клеток или других биологических источников с использованием обычных способов, известных в данной области техники, таких, как поставляются компанией Qiagen QIAamp® и им подобные. [Некоторое] количество исследуемой ДНК может быть представлено в композиции для обнаружения мутаций c.-124 C>T и c.-146 C>T в промоторе гена Htert, в концентрациях** менее 500 нг, менее чем 100 нг, 50 нг и до 1 нг.

Упомянутое регулирование концентрации использованных зондов предназначено усилить аналитическую чувствительность способа по данному изобретению, что демонстрируется минимальным количеством детектируемых мутантных аллелей (DNA MUT) относительно количества ДНК дикого типа (ДНК WT). Предполагается, что увеличение аналитической чувствительности происходит вследствие увеличения концентраций использованных в реакции зондов, в результате предпочтительной амплификации мутантных аллели.

Одновременно это уменьшает эффективность гибридизации и амплификации аллели дикого типа для того чтобы, насколько это возможно, сместить баланс реакции в сторону амплификации мутантной аллели.

Таким образом, стало возможным разработать способ, в котором различные комбинации разных концентраций использованных образцов создавали условия, усиливающие аналитическую чувствительность и позволяющие детектировать очень малые количества мутантной аллели.

До определенных уровней увеличение концентрации зонда на мутацию не приводит к неспецифическому детектированию аллелей дикого типа, что показывает отсутствие сигнала в зондах 124T и -146T при использовании только ДНК дикого типа (Фиг. 5 - графики C и D). Таким образом, меняя концентрации используемых зондов, можно калибровать чувствительность аналитического способа, сохраняя его специфичность.

В соответствии с увеличением эффективности детектирования мутированных аллелей -124T и -146T, существенно увеличивается аналитическая чувствительность способа, что позволяет обнаруживать мутации при минимальных значениях 1.56% для -124T аллели и 0.78% для -146T аллели (Фиг. 6A и B, соответственно).

Таким образом, способ по данному изобретению включает стадии: i) приготовления композиции для детектирования мутаций c.-124 C>T и (или) c.-146 C>T M в промоторе гена Htert, как описано выше, ii) проведение тестирования ДНК, экстрагированной из биологического образца, композицией для PCR амплификации и гибридизации, также как описано выше, iii) амплификации и гибридизации ДНК композиции образца для обнаружения мутаций c.-124 C>T и/или c.-146 C>T в промоторе гена Htert с помощью PCR реакции, PCR в реальном времени, PCR с обратной транскрипцией или цифровой PCR или даже мультиплексной PCR, и iv) анализа полученных таким образом кривых амплификации.

Наличие в позиции c.-124 мутации C> T и (или) в позиции c.-146 C>T в промоторе гена Htert в исследуемом образце анализируется на наличие экспоненциального увеличения флуоресцентного сигнала, которое соответствует присутствию, по меньшей мере, одной из указанных мутаций.

Способ по данному изобретению применим для детектирования следовых количеств мутаций c.-124 C>T и c.-146 C>T в нескольких биологических жидкостях, например, среди прочих, в моче, плазме, спинномозговой жидкости, [материале] аспирационной цитологии, имея в качестве исходной ДНК, полученную из этих различающихся источников. В этих примерах преимущество заключается в возможности проведения определения, используя менее инвазивные способы получения образцов, без необходимости биопсии или хирургических [способов получения материалов].

Способ может использоваться для исследования пациентов, страдающих раком мочевого пузыря, путем анализа ДНК-исследований образцов мочи. Такое применение основывается на том факте, что мутации c.-124C>T и c.-146C>T часто встречаются при раке мочевого пузыря и могут обнаруживаться в ДНК, полученной из мочи (Фиг.7). Для пациентов, обследуемых по причине наличия 50-70% вероятности рецидива, возможность обнаружения рецидива на основе анализа образцов мочи имеет преимущества перед обычным способом, основанным на цистоскопии, в связи с полной неинвазивностью и большим удобством для пациента.

Способ по данному изобретению может также применяться для детектирования других видов раковых заболеваний, при которых присутствуют мутации гена Htert, и для других клинических целей. Один из примеров состоит в анализе аспирационной диагностической пункции узлов щитовидной железы для получения прогностической информации, позволяющей принять решение о необходимости абляционного лечения или иссечения лимфатических узлов.

Еще один пример применения данного изобретения относится к раннему детектированию, диагностике, прогнозированию, обнаружению рецидивов или предсказанию/наблюдению ответных реакций на терапию опухолей, таких как, среди прочих, раковые заболевания центральной нервной системы, карцинома мочевого пузыря, гепатоцеллюлярные карциномы, карциномы щитовидной железы, раковые заболеваниях кожи.

Данное изобретение может также быть полезно для анализа опухолевой ткани или циркулирующей ДНК в варианте "жидкостной биопсии" для возможного отбора и лечения возможных пациентов, анализа ответных реакций и прогнозирования лечения и наблюдения, например, при использовании теломеразных ингибиторов к промотору гена Htert.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1: Демонстрация способности анализа детектировать мутации в промоторе гена Htert (TERTp) c.-124 C>T.

На этом чертеже показано, что анализ специфичен для обнаружения аллели в позиции -124. Качество анализа подтверждено проверкой детектирования мутации c.-124 C>T в гетерозиготных образцах ДНК с мутацией c.-124 C>T (DNA HET124) и в образцах с ДНК "дикого типа" (DNA WT). Результаты показывают, что специфический для мутантной аллели зонд (зонд -124T) вызывает сигнал в образце ДНК HET-124, но не в образце ДНК дикого типа, а зонд на аллель "дикого типа" (зонд -124C) вызывает амплификацию сигнала в обоих образцах.

1 - кривая амплификации, полученная с зондом -124C (аллель "дикого типа") в ДНК WT.

2 - кривая амплификации, полученная с зондом -124C (аллель "дикого типа") в ДНК HET-124.

3 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T (мутантная аллель) в ДНК HET-124.

4 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T (мутантная аллель) в ДНК WT.

Ось X - цикл амплификации

Ось Y - Изменение флуоресценции

Фиг. 2: Демонстрация способности анализа детектировать мутации в TERTp c.-146 C>T

На этом чертеже представлено, что анализ является специфичным для детектирования аллелей в позиции -146. Эффективность анализа на обнаружении мутации c. -146 C> T подтверждается с помощью анализа гетерозиготных образцов ДНК с мутацией C>T в позиции c.-146 (DNA HET146) и образцов дикого типа (WT DNA). Результаты показывают, что специфический для мутантной аллели зонд (зонд -146T) генерирует сигнал в образце ДНК HET-146, но не в образце с ДНК дикого типа, а зонд на аллель "дикого типа" (зонд -146C) вызывает амплификацию сигнала в обоих образцах.

1 - кривая амплификации, полученная с зондом -146C (аллель "дикого типа") в ДНК WT.

2 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T (мутантная аллель) в HET-146 ДНК.

3- кривая амплификации, полученная с зондом -146C (аллель "дикого типа") в HET-146 ДНК.

4 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T (мутантная аллель) в ДНК дикого типа.

Ось X - цикл амплификации

Ось Y - изменение флуоресценции

Фиг. 3: Оценка аналитической специфичности тестов:

(A) специфическое детектирование мутации TERTp c.-124 C>T

(B) специфическое детектирование мутации TERTp c.-146 C>T

На этом чертеже показано, что анализ не имеет перекрестной реактивности между анализируемыми мутациями.

Фиг. 3-A: образец ДНК, гетерозиготный по мутации TERTp -146C>T не амплифицируется с зондом -124T, и единственный зонд, дающий флуоресценцию - фактически, это зонд -124C (соответствует аллели "дикого типа" в позиции -124)

Фиг. 3-B: с другой стороны, образец ДНК, гетерозиготный по мутации TERTp -124C>T, не амплифицируется с зондом -146T, и единственный зонд, дающий флуоресценцию - фактически, это зонд -146C (соответствует аллели "дикого типа" в позиции -146).

1 - кривая амплификации, полученная с зондом -124C (аллель "дикого типа") в ДНК HET-146.

2 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T (мутантная аллель) в ДНК HET-146.

3 - кривая амплификации, полученная с зондом -146C (аллель "дикого типа") в ДНК HET-124.

4 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T (мутантная аллель) в ДНК HET-124.

Ось X - цикл амплификации

Ось Y - изменение флуоресценции

Фиг. 4: Оценка аналитической чувствительности детектирования мутаций -124T аллели (A) и -146T (B) в условиях, имитирующих образцы ДНК, полученные из биологических жидкостей, в которых присутствуют, в самом широком смысле, небольшие количества мутированных аллелей, где преобладали аллели "дикого типа". Были использованы образцы ДНК с мутацией c.-124C>T или образцы с мутацией c.-146C>T, серийно разбавленные в образцах ДНК "дикого типа".

Этот чертеж представляет эффективность и чувствительность теста в детектировании мутантных аллелей -124T и -146T.

1 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T при 50% ДНК MUT124/DNAWT.

2 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T при 25% ДНК MUT124/DNAWT.

3 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T при 12,5% *** ДНК MUT124/DNAWT.

4 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T при 6,25% ДНК MUT124/DNAWT.

5 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T при 3,125% ДНК MUT124/DNAWT.

6 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T при 50% ДНК MUT146/DNAWT.

7 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T при 25% ДНК MUT146/DNAWT.

8 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T при 12,5% ДНК MUT146/DNAWT.

9 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T при 6,25% ДНК MUT146/DNAWT.

Ось X - цикл амплификации

Ось Y - изменение флуоресценции

Фиг. 5: Усиление аналитической чувствительности при детектировании аллелей -124T (A) и -146T (B).

Были использованы образцы ДНК с мутацией c.-124C>T или образцы с мутацией c.-146C>T, серийно разбавленные в образцах ДНК «дикого типа» в пропорции 25% MUT DNA/DNA-WT.

Можно видеть, что при условии низкой концентрации зонда на аллель "дикого типа" (напр. 250 нМ) использование более высокой концентрации зонда для мутантных аллелей -124T и -146T (400-800-1600 нМ) дает существенное увеличение сигнала детектирования мутантных аллелей (Фиг. 5, панели A и B, соответственно).

В панелях C и D этого чертежа можно видеть, что до определенного уровня увеличение концентрации зонда на мутации не приводит к неспецифическому детектированию аллели дикого типа, что очевидно из отсутствия сигнала зондов -124T и -146T при использовании только ДНК WT (дикого типа) в качестве образца.

1 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T (на мутацию) в концентрации 400 нМ.

2 - кривая амплификации, полученная с зондом -124C (на дикий тип) в концентрации 250 нМ.

3 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T (на мутацию) в концентрации 800 нМ.

4 - кривая амплификации, полученная с зондом -124C (на дикий тип) в концентрации 250 нМ.

5 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T (на мутацию) в концентрации 1600 нМ.

6 - кривая амплификации, полученная с зондом -124C (на дикий тип) в концентрации 250 нМ.

7 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T (на мутацию) в концентрации 400 нМ.

8 - кривая амплификации, полученная с зондом -146C (на дикий тип) в концентрации 250 нМ.

9 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T (на мутацию) в концентрации 800 нМ.

10 - кривая амплификации, полученная с зондом -146C (на дикий тип) в концентрации 250 нМ.

11 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T (на мутацию) в концентрации 1600 нМ.

12 - кривая амплификации, полученная с зондом -146C (на дикий тип) в концентрации 250 нМ.

13 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T (на мутацию) в концентрации 1600 нМ.

14 - кривая амплификации, полученная с зондом -124C (на дикий тип) в концентрации 250 нМ.

15 - кривая амплификации, полученная с зондом -1246T (на мутацию) в концентрации 400 нМ.

16 - кривая амплификации, полученная с зондом -146C (на дикий тип) в концентрации 250 нМ.

Ось X - цикл амплификации

Ось Y - изменение флуоресценции

Фиг. 6: Оценка аналитической чувствительности детектирования аллелей -124T (A) и -146T (B) при повышении концентрации зонда на мутантную аллель и понижении концентрации зонда на аллель "дикого типа". Это изменение в относительной композиции зондов приводит к увеличению аналитической чувствительности.

Этот чертеж представляет повышение эффективности и чувствительности детектирования мутированных аллелей -124T и -146T: минимальные детектируемое значение*** составляет 1,56% для -аллели 124T и 0,78% для аллели -146T.

1 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T при 25% ДНК MUT124/DNAWT.

2 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T при 12,5% ДНК MUT124/DNAWT.

3 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T при 6,25% ДНК MUT124/DNAWT.

4 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T 3,125% ДНК MUT124/DNAWT.

5 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T 1,56% ДНК MUT124/DNAWT.

6 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T при 50% ДНК MUT146/DNAWT.

7 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T 25% ДНК MUT146/DNAWT.

8 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T 12,5% ДНК MUT146/DNAWT.

9 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T при 6,25% ДНК MUT146/DNAWT.

10 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T 3,125% ДНК MUT146/DNAWT.

11 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T 1,56% ДНК MUT124/DNAWT.

12 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T 0,78% ДНК MUT146/DNAWT.

Ось X - цикл амплификации

Ось Y - изменение флуоресценции

Фиг. 7: Демонстрация способности анализа детектировать мутации TERTp c.-124 C>T и c.-146 C>T в образцах мочи пациентов, страдающих раком мочевого пузыря. На этом чертеже можно видеть детектирование в образцах мочи мутаций c.-124 C>T или c.-146 C>T. Результаты показывают, что в этом типе образцов, полученных от пациентов, страдающих раком мочевого пузыря, мутантные аллели обнаружены для мутации -124 (A) или мутации -146 (B), а также сигналы для соответствующей аллели "дикого типа".

1 - кривая амплификации, полученная с зондом -124C (аллель "дикого типа") в ДНК, полученной от пациента, страдающего раком мочевого пузыря.

2 - кривая амплификации, полученная с зондом -124T (мутантная аллель) в ДНК, полученной от пациента, страдающего раком мочевого пузыря.

3 - кривая амплификации, полученная с зондом -146C (аллель "дикого типа") в ДНК, полученной у пациента, страдающего раком мочевого пузыря.

4 - кривая амплификации, полученная с зондом -146T (мутантная аллель) в ДНК, полученной у пациента, страдающего раком мочевого пузыря.

Ось X - цикл амплификации

Ось Y - изменение флуоресценции

Примеры

Пример 1 - Приготовление последовательностей праймеров и зондов

Две последовательности праймеров, SEQ ID nr.1 и SEQ ID Nr.2, и 4 других последовательности зондов, SEQ ID Nr.3 SEQ ID nr.6 были приготовлены нижеследующим образом:

Последовательности, приведенные выше, были приготовлены способом нуклеотидного синтеза с использованием твердофазного фосфорамидитного нуклеозида. Синтез проводился в забитых колонках с функционализированным твердофазным носителем, [начиная] с первого [нуклеотидного] основания 3'-конца каждого олигонуклеотида. Каждый олигонуклеотид приготовлялся в результате ряда синтетических циклов, каждый из которых состоял из четырех химических реакций:

Разблокировка (детритилирование); образование пар; протектирование и окисление. В каждом цикле шаг за шагом добавлялись нуклеотидные остатки в направлении 5'-конца нуклеотида, в соответствии с желаемой последовательностью.

Концентрация зондов устанавливалась на значениях*** от 400 до 1600 нМ путем разбавления лиофилизированного препарата в бидистиллированной и дважды деионизованной воде.

Пример 2 - Приготовление композиций для реакции PCR

Были приготовлены несколько композиций для реакций PCR, содержащие нуклеотиды в соответствии с последовательностями SEQ ID SEQ ID nr.1 и nr.6 в разных концентрациях (например, 400 нМ, 800 нМ, 1600 нМ) и как описано ниже. Для целей сравнения растворы были также приготовлены с разными концентрациями зонда на аллели "дикого типа" (напр., 250 нМ, 500 нМ).

I - композиции для обнаружения мутации в позиции -124 основания вверх от стартового кодона ATG гена hTERT

Композиция Ia по данному изобретению:

Реагент-растворитель для PCR в реальном времени "TaqMan® Universal PCR Master Mix" в концентрации 1X;

Олигонуклеотид с последовательностью: SEQ ID n. 1 в концентрации 900 нМ;

Олигонуклеотид с последовательностью: SEQ ID n. 2, в концентрации 900 нМ;

Олигонуклеотидный зонд с последовательностью: SEQ ID n. 3, в концентрации 250 нМ, включающий модификации, такие как встраивание компонента, известного как YAKIMA YELLOW® и тетраметилродамина (TAMRA) в 5'- и 3'-концевые участки, соответственно;

Олигонуклеотидный зонд с последовательностью: SEQ ID n. 4, в концентрации 1600 нМ, содержащий такие модификации, как встраивание соединений, известных как 6-карбокси-флуоресцеин (6-FAM) и тетраметилродамин (TAMRA) в 5' и 3'-концевые участки, соответственно;

Бидистиллированная и дважды деионизованная вода.

Композиция Ib по данному изобретению:

Эта композиция приготовлена сходно с композицией Ia, но концентрация олигонуклеотидного зонда замещена таковой, идентифицируемой как SEQ ID NO. 4 в концентрации 800 нМ*.

Композиция Ic по данному изобретению:

Эта композиция приготовлена сходно с композицией Ia, но концентрация олигонуклеотидного зонда замещена таковой, идентифицируемой как SEQ ID NO. 4 в концентрации 400 нМ*.

Композиция сравнения Id:

Эта композиция приготовлена сходно с композицией Ia, но концентрация олигонуклеотидного зонда замещена таковой, идентифицируемой как SEQ ID NO. 3, в концентрации 500 нМ.

II - композиции для детектирования мутации в позиции -146 оснований вверх от стартового кодона ATG гена hTERT

Композиция IIa по данному изобретению:

Реагент-растворитель для PCR в реальном времени "TaqMan® Universal PCR Master Mix" в концентрации 1X;

Олигонуклеотид с последовательностью: SEQ ID n.1 в концентрации 900 nM;

Олигонуклеотид с последовательностью: SEQ ID n.2 в концентрации 900 нМ;

Олигонуклеотидный зонд с последовательностью: SEQ ID n. 5 в концентрации 250 нМ, включающий модификации в 5'- и 3'-концевых участках, соответственно;

Олигонуклеотидный зонд с последовательностью: SEQ ID n. 6 в концентрации 1600 нМ, включающий модификации в 5'- и 3'-концевых участках, соответственно;

Бидистиллированная и дважды деионизованная вода.

Упомянутые модификации на 5'- и 3'-концах последовательностей зондов соответствуют добавлению флуорофоров (FAM, Yakima yellow) и гасителей флуоресценции (TAMRA) и т.д., известных специалистам.

Композиция IIb по данному изобретению:

Эта композиция приготовлена сходно с композицией IIa, однако олигонуклеотидный зонд с последовательностью: SEQ ID NO. 6, присутствует в концентрации 800 нМ.

Композиция IIс по данному изобретению:

Эта композиция приготовлена сходно с композицией IIa, однако олигонуклеотидный зонд с последовательностью: SEQ ID NO. 6, присутствует в концентрации 400 нМ.

Сравнительная композиция IId:

Эта композиция приготовлена сходно с композицией Ia, однако олигонуклеотидный зонд с последовательностью: SEQ ID NO. 5, присутствует в концентрации 500 нМ.

III композиции для одновременного обнаружения мутаций, располагающихся в -124 и -146 основаниях вверх от стартового кодона ATG гена hTERT:

Композиция IIIa по данному изобретению:

Реагент-растворитель для PCR в реальном времени "TaqMan® Universal PCR Master Mix" в концентрации 1X;

Олигонуклеотид с последовательностью: SEQ ID n. 1 в конечной концентрации 900 нМ;

Олигонуклеотид с последовательностью: SEQ ID n. 2 в конечной концентрации 900 нМ;

Олигонуклеотид с последовательностью: SEQ ID n. 3 в конечной концентрации 900 нМ;

Олигонуклеотидный зонд с последовательностью: SEQ ID n. 4 в концентрации 1600 нМ, включающий модификации в 5'- и 3'-концевых участках, соответственно;

Олигонуклеотидный зонд с последовательностью: SEQ ID n. 5 в концентрации 250 нМ, включающий модификации в 5'- и 3'-концевых участках, соответственно;

Олигонуклеотидный зонд с последовательностью: SEQ ID n. 6 в концентрации 1600 нМ, включающий модификации в 5'- и 3'-концевых участках, соответственно

Бидистиллированная и дважды деионизованная вода.

Композиция IIIb по данному изобретению:

Эта композиция приготовлена сходно с композицией IIIa, однако олигонуклеотидный зонд с последовательностью: SEQ ID NO. 4, присутствует в концентрации 800 нМ.

Композиция IIIс по данному изобретению:

Эта композиция приготовлена сходно с композицией IIIa, однако олигонуклеотидный зонд с последовательностью: SEQ ID NO. 4, присутствует в концентрации 400 нМ.

Композиция IIId по данному изобретению:

Эта композиция приготовлена сходно с композицией IIIa, однако олигонуклеотидный зонд с последовательностью: SEQ ID NO. 6, присутствует в концентрации 800 нМ.

Композиция IIIе по данному изобретению:

Эта композиция приготовлена сходно с композицией IIIa, однако олигонуклеотидный зонд с последовательностью: SEQ ID NO. 6 присутствует в концентрации 400 нМ.

Композиция сравнения IIIf:

Эта композиция приготовлена сходно с композицией Ia, при этом олигонуклеотидный зонд с последовательностью: SEQ ID NO. 3, присутствует в концентрации 500 nM.

Сравнительная композиция IIIg:

Эта композиция приготовлена сходно с композицией олигонуклеотидного зонда Ia с последовательностью: SEQ ID NO. 5, присутствующей в концентрации 500 нМ.

Пример 3 - Приготовление композиций для детектирования мутаций

Композиции реакционных смесей для детектирования мутаций c.-124 C>T и c.-146 C>T в промоторе гена hTERT были приготовлены с добавлением ДНК из тестового биологического образца, приблизительно 100 нг ДНК, (можно использовать меньшие количества в диапазоне от 1 нг до 500 нг) для PCR-композиции, описанной выше, с концентрацией образцов SEQ ID nr.3 и SEQ ID nr.6, установленной на значениях*** от 400 до 1600 нМ, как описано в предыдущем примере. Композиции для детектирования были, таким образом, приготовлены с ДНК-образцами, содержащими мутацию c.124 C>T, или с образцами, содержащими мутацию c.146 C>T "серийно разбавленными" в образцах ДНК "дикого типа".

Сходным образом, композиции для детектирования были приготовлены для сравнительных целей путем добавления ДНК из тестового биологического образца в раствор для сравнения из предыдущего примера.

Пример 4 - Способ детектирования мутаций c.-124 C>T и c.-146 C>T, расположенных в промоторе гена hTERT

Для осуществления способа по данному изобретению были приготовлены различные композиции для детектирования мутаций, как описано в предыдущем примере.

В этом примере была использована ДНК из клеточных линий или ДНК опухолевой ткани, свежеполученные или фиксированные в формалине и затем заключенные в парафин.

Композиции для обнаружения мутаций из предыдущего примера амплифицировались и гибридизовались с использованием PCR в реальном времени и цифровой PCR. Композиции были также подвергнуты параллельному анализу (Multiplex) с использованием одних и тех же реакционных зондов для обеих мутаций, при том, что зонды были помечены разными флуорофорами. Среди наиболее обычных флуорофоров известны такие соединения, как Alexa Fluor FAM, TET, JOE, VIC, HEX, Cy3, ATTO 550, TAMRA, ROX, Cy5, Cy5.5.

Для осуществления способа с использованием PCR в реальном времени использовался прибор ABI PRISM® 7500 Fast поставляемый фирмой Scientific ThermoFischer.

Условия амплификации и гибридизации:

1-я стадия: 1 цикл 10 минут при 95°С

2-я стадия: 45 циклов, содержащих по 30 секунд при 92°C, 1 минута при 60°C, с изменением температуры 0,2°C на цикл, начиная с 25-го цикла

3-я стадия: 1 цикл длительностью в 1 минуту при 57°C с захватом сигнала

Пример 5 - Способ детектирования мутаций c.-124 C>T и c.-146 C>T, располагающихся в промоторе гена hTERT, в образце мочи

Образцы мочи были получены у пациентов, страдающих раком мочевого пузыря, наблюдаемых в клинических или профилактических программах (цистоскопия) для предотвращения рецидивов опухолей. Мочу центрифугировали с силой, в 1000 раз превосходящей силу тяготения (1000G), в течение более 5 минут для осаждения эпителиальных клеток из мочевого пузыря, присутствующих в моче. ДНК была экстрагирована из полученных осажденных клеток с использованием обычных способов, известных в данной области техники, таких как QIAamp®, поставляемых фирмой Qiagen или схожих способов. Между 1 и 500 нг полученной ДНК было добавлено в композиции для амплификации и детектирования мутаций, составленные как описано в Примерах 1, 2 и 3.

Композиции для обнаружения мутаций из примера 3 были подвергнуты процессам амплификации и гибридизации в PCR в реальном времени и цифровой PCR. Композиции были также подвергнуты параллельному анализу (Multiplex) с использованием тех же реакционных зондов для обеих мутаций в одном анализе, причем зонды были помечены разными флуорофорами. Среди наиболее обычных флуорофоров известны такие соединения, как Alexa Fluor FAM, TET, JOE, VIC, HEX, Cy3, ATTO 550, TAMRA, ROX, Cy5, Cy5.5.

Для осуществления способа в PCR в реальном времени был использован прибор ABI PRISM ® 7500 Fast, поставляемый фирмой Scientific ThermoFischer.

Условия амплификации и гибридизации:

1-я стадия: 1 цикл длительностью в 10 минут при 95°С

2-я стадия: 45 циклов, состоящих из 30 секунд при 92°C, 1 минута при 60°C, с изменением температуры на 0,2°C в каждом цикле, начиная с 25-го цикла

3-я стадия: 1 цикл - 1 минута при 57°C с захватом сигнала

Используя этот способ, замены c.-124 C>T и c.-146 C>T в промоторе гена Htert были обнаружены у пациентов, страдающих раком мочевого пузыря, как с низкой, так и с высокой степенью злокачественности, а также у пациентов с рецидивом рака мочевого пузыря (Фиг. 7).

В заключение:

Специфичность зондов была подтверждена, т.е. было установлено, что зонды на мутации c.-124 C>T (образцы с SEQ ID Nr.3 и SEQ ID nr.4) не дают амплификации гетерозиготного ДНК-образца с мутацией c.-146 C>T (ДНК MUT 146) и наоборот (с зондами SEQ ID nr.5 и SEQ ID nr.6) (Фиг. 3A и 3B). Было установлено, что отсутствует перекрестное детектирование или ложное детектирование между упомянутыми зондами и соответствующими мутациями.

В образцах ДНК, полученных из биологических жидкостей, в которых небольшие количества мутированных аллелей в среде представлены на фоне преобладающих количеств аллели "дикого типа", аналитическая чувствительность зондов -124T и -146T в конечной концентрации 400 нМ по способности детектировать соответствующую мутацию сохраняется до, максимум, 3,125% в случае зонда -124T и 6, 25% - для зонда -146T (Фиг. 4a и b, соответственно), что четко показывает высокую эффективность зондов для обнаружения мутаций в условиях разбавления с высоким содержанием аллели «дикого типа» и, таким образом, высокую чувствительность способа по данному изобретению.

При условии использования 25% ADNMUT/ADNWT может наблюдаться, что при низкой концентрации зонда на аллель "дикого типа" (напр. 250 нМ) использование более высокой концентрации зонда на мутантные аллели -124T и -146T (400-800-1600 нМ) дает существенное усиление детектируемого сигнала мутантных аллелей (Фиг. 5, панели a и B, соответственно), что ясно показывает, что с помощью изменения концентраций зондов возможно регулировать способ по данному изобретению для детектирования интересующих мутаций.

Увеличение эффективности детектирования мутантных аллелей -124T и -146T соответствует существенному увеличению чувствительности аналитического способа по данному изобретению, достигающей минимальных детектируемых*** количеств 1,56% в случае аллели -124T и 0,78% в случае аллели -146T (Фиг. 6A и B, соответственно), что ясно показывает, что с помощью изменения концентраций зондов возможно увеличивать аналитическую чувствительность способа по данному изобретению по детектированию мутаций, представляющих интерес, сохраняя его специфичность.

Список последовательностей

I - праймеры

SEQ ID nr.1:

5'-CCACGTGCGCAGCAGGAC-3'

SEQ ID nr.2:

5'-CCGTCCTGCCCCTTCACCTT-3'

II - Специфические зонды на мутации c.-124 C>T в промоторе гена hTERT

SEQ ID nr.3:

Yakima Yellow Dye-5'-AGGGCCCGGAGGGGGCT-3'-TAMRA

SEQ ID nr.4:

FAM-5'-AGGGCCCGGAAGGGGCT-3'-TAMRA

III - Специфические зонды на мутации c.-146 C>T в промоторе гена hTERT

SEQ ID nr.5:

Yakima Yellow Dye-5'-CGGGGACCCGGGAGGGGT-3'-TAMRA

SEQ ID nr.6:

FAM-5'-CGGGGACCCGGAAGGGGT-3'-TAMRA

Литература:

1. Hayflick, L. and P.S. Moorhead, The serial cultivation of human diploid cell strains. Exp Cell Res, 1961. 25: p. 585-621.

2. Blackburn, E.H., Structure and function of telomeres. Nature, 1991. 350(6319): p. 569-73.

3. Greider, C.W., Telomerase is processive. Mol Cell Biol, 1991. 11(9): p. 4572-80.

4. Szostak, J.W. and E.H. Blackburn, Cloning yeast telomeres on linear plasmid vectors. Cell, 1982. 29(1): p. 245-55.

5. Gunes, C. and K.L. Rudolph, The role of telomeres in stem cells and cancer. Cell, 2013. 152(3):p.390-3

6. Murnane, J.P., Telomere dysfunction and chromosome instability. Mutat Res, 2012. 730(1-2): p. 28-36.

7. Cesare, A.J. and R.R. Reddel, Alternative lengthening of telomeres: models, mechanisms and implications. Nat Rev Genet, 2010. 11(5): p. 319-30.

8. Kim, N.W., et al., Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994. 266(5193): p. 2011-5.

9. Kyo, S., et al., Understanding and exploiting hTERT promoter regulation for diagnosis and treatment of human cancers. Cancer Sci, 2008. 99(8): p. 1528-38.

10. Aubert, G. and P.M. Lansdorp, Telomeres and aging. Physiol Rev, 2008. 88(2): p. 557-79.

11. Killela, P.J., et al., TERT promoter mutations occur frequently in gliomas and a subset of tumors derived from cells with low rates of self-renewal. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(15): p. 6021-6.

12. Liu, X., et al., Highly prevalent TERT promoter mutations in aggressive thyroid cancers. Endocr Relat Cancer, 2013. 20(4): p. 603-10.

13. Nault, J.C., et al., High frequency of telomerase reverse-transcriptase promoter somatic mutations in hepatocellular carcinoma and preneoplastic lesions. Nat Commun, 2013. 4: p. 2218.

14. Vinagre, J., et al., Frequency of TERT promoter mutations in human cancers. Nat Commun, 2013. 4: p. 2185.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Институт патологии и молекулярной иммунологии

университета Порту

<120> СПОСОБ, ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ, КОМПОЗИЦИИ И НАБОР ДЛЯ

ОБНАРУЖЕНИЯ ИЗМЕНЕНИЙ В ПРОМОТОРЕ ГЕНА HTERT

<130> 11670IB

<140> PT108419

<141> 2015-04-30

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 0

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 1

000

<210> 2

<211> 0

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 2

000

<210> 3

<211> 0

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 3

000

<210> 4

<211> 0

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 4

000

<210> 5

<211> 0

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 5

000

<210> 6

<211> 0

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 6

000

<---

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу обнаружения c.-124 C>T и c.-146 C>T мутаций в промоторе гена Htert. Упомянутый способ использует реакционную композицию, которая содержит праймеры для амплификации и зонды для генотипирования. Способ, генные последовательности, композиции и набор по данному изобретению могут быть успешно использованы для детектирования следовых количеств c.-124 C>T и c.-146 C>T мутаций, присутствующих в биологических образцах, благодаря их высокой чувствительности и специфичности к таким мутациям. Данное изобретение может, следовательно, быть применено для раннего детектирования, идентификации, детектирования рецидивов или прогнозирования и мониторинга заболеваний, связанных с этими мутациями, и в результате представлять основу для выработки соответствующего лечения. 5 н. и 9 з.п. ф-лы, 7 ил., 5 пр.

1. Набор нуклеотидных последовательностей для детектирования мутаций c.-124 C>T и/или c.-146 C>T в промоторе гена hTERT, характеризующийся содержанием SEQ ID Nr. 1 - SEQ ID Nr.2 и по меньшей мере SEQ ID Nr.3 - SEQ ID Nr.4 и (или) SEQ ID Nr.5 SEQ ID Nr.6.

2. Композиция для амплификации и гибридизации с помощью PCR для детектирования мутаций C.-124 C>T и/или c.-146 C>T в промоторе гена hTERT, характеризующаяся содержанием, в дополнение к реакционным растворам для PCR, нуклеотидных последовательностей SEQ ID Nr.1 - SEQ ID Nr.2 и по меньшей мере SEQ ID Nr.3 - SEQ ID Nr.4 и (или) SEQ ID Nr.5 - SEQ ID Nr.6, как описано в п. 1.

3. Композиция по предыдущему пункту, характеризующаяся присутствием в композиции по меньшей мере одной из последовательностей SEQ ID Nr.3 - SEQ ID Nr.6 в конечной концентрации 400 нМ* - 1600 нМ.

4. Композиция по предыдущему пункту, характеризующаяся присутствием в композиции по меньшей мере одной из нуклеотидных последовательностей SEQ ID Nr.3 - SEQ ID Nr.6 в конечной концентрации от 800 нМ* до 1600 нМ.

5. Композиция по предыдущему пункту, характеризующаяся присутствием в этой композиции нуклеотидных последовательностей SEQ ID Nr.3 и SEQ ID Nr.5 в финальной концентрации 250 нМ - 500 нМ и присутствием в этой композиции нуклеотидных последовательностей SEQ ID Nr.4 и SEQ ID Nr.6 в финальной концентрации 800 нМ - 1600 нМ.

6. Композиция по предыдущему пункту, характеризующаяся содержанием следующих концентраций SEQ ID Nr.3 SEQ ID Nr.6:

i) 250 нМ - 500 нМ SEQ ID Nr.3, 400 нМ* - 1600 нМ SEQ ID Nr.4, от 250 нM до 500 нM последовательности SEQ ID Nr.5 и от 400 нM* до 1600 нM последовательности SEQ ID Nr.6,

или

ii) 250 нМ - 500 нМ SEQ ID Nr.3, 800 нМ - 1600 нМ SEQ ID Nr.4, 250 нМ - 500 нМ SEQ ID Nr.5 и 800 нМ* - 1600 нМ SEQ ID Nr.6.

7. Композиция для детектирования мутаций c.-124 C>T и c.-146 C>T в промоторе гена hTERT, характеризующаяся содержанием, в дополнение к ДНК человека, полученной из биологического образца in vitro, по меньшей мере одной композиции для амплификации и гибридизации PCR, как описано в каком-либо из пп. 2-6.

8. Композиция по предыдущему пункту, характеризующаяся содержанием в этой композиции количества ДНК тестируемого образца в финальной концентрации менее чем 500 нг, менее чем 100 нг, менее чем 50 нг и более чем 1 нг.

9. Набор для детектирования мутаций c.-124 C>T и/или C.-146 C>T в промоторе гена hTERT, содержащий по меньшей мере одну композицию для детектирования мутаций, описанную в каком-либо из пп. 7, 8.

10. Набор по предыдущему пункту, характеризующийся также содержанием по меньшей мере одного образца ДНК, содержащего мутацию c.-124 C>T и (или) c.-146 C>T в промоторе гена hTERT.

11. Способ детектирования мутаций c.-124 C>T и/или c.-146 C>T в промоторе гена hTERT in vitro, характеризующийся содержанием следующих стадий:

a) приготовление композиции для детектирования, как описано в пп. 7, 8, осуществлением контакта ДНК, экстрагированной из исследуемого на наличие мутации биологического образца, с композицией для PCR-амплификации и гибридизации, как описано в пп. 2-6,

b) амплификация и гибридизация образца ДНК в композиции для детектирования реакцией PCR,

c) анализ кривых амплификации, полученных в (b), и проверка наличия экспоненциальной амплификации флуоресцентного сигнала, что соответствует подтверждению присутствия c.-124 C>T мутации и/или c.-146 C>T мутации в промоторе гена hTERT в анализируемом образце.

12. Способ по предыдущему пункту, где биологический образец для (a) происходит из мочи, плазмы, спинномозговой жидкости, [материала]аспирационной цитологии человека.

13. Способ по предыдущему пункту, где количество ДНК в композиции с биологическим образцом (a) варьирует в конечных концентрациях: менее чем 500 нг, менее чем 100 нг, менее чем 50 нг и более чем 1 нг.

14. Способ по пп. 11-13, где условия амплификации нижеследующие:

1-я стадия: 1 цикл в течение 10 минут при 95°С,

2-я стадия: 45 циклов, содержащих 30 секунд при 92°C, 1 минута при 60°C, с изменением температуры на 0,2°C на цикл, начиная с 25-го цикла,

3-я стадия: 1 цикл из 1-й минуты при 57°C, с захватом сигнала.