СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ Российский патент 2009 года по МПК A23K1/165 

Изобретение относится к кормопроизводству, в частности к способам приготовления биологически активных кормовых добавок для млекопитающих, птиц, рыб, повышающих эффективность пищеварения, основанных на переработке целлюлозосодержащего субстрата из растительного сырья и отходов.

К числу перспективных направлений микробной биотехнологии относится создание биологически активных пробиотических препаратов, оказывающих разностороннее действие на животный организм и позволяющих применять их как для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний, так и для стимуляции роста и повышения продуктивности животных. В настоящее время разработаны способы получения пробиотических препаратов, имеющих в своем составе бактерии вида Bacillus subtilis.

Известно, что бациллы продуцируют различные биологически активные вещества: ферменты, аминокислоты, витамины, антибиотики и обладают выраженным иммуномодулирующим действием в полости желудочно-кишечного тракта. Физиолого-биохимические свойства бацилл позволяют использовать их в составе лечебно-профилактических пробиотических препаратов и в составе кормовых биологически активных добавок.

Из уровня техники известны пробиотические препараты и способы их получения на основе культуры В.subtilis, предназначенные для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний животных, птицы и рыбы. Например, штамм бактерий В.subtilis ВКМ В-2250Д используют для получения пробиотического препарата «Субтилис», который нормализует деятельность желудочно-кишечного тракта животных и перспективен в лечении и профилактике бактериальных инфекций (1). Препарат представляет собой жидкую споровую культуру бактерий В.subtilis (80-90% спор) или лиофильно высушенные клетки со спорами. Недостатком препарата в сухой форме является применение спор бактерий, что может вызвать загрязнение спорами окружающей среды при смешении с кормом и кормлении животных. Жидкая форма препарата не удобна для транспортировки, длительного хранения.

Известен способ получения лечебно-профилактического корма для животных, включающий введение в измельченный корм пробиотика на основе культуры бактерий В.subtilis ВКПМ-В-4759 в сухом (лиофилизованном) виде, смешивание компонентов корма с пробиотиком, нагрев острым паром до температуры 65-95° и гранулирование (2). Однако стадия смешения споровой бактерии в сухом виде с кормом создает опасность повышенного обсеменения спорами воздуха и производственных помещений.

Известен способ кормления сельскохозяйственных животных, при котором к основному рациону добавляют отход производства препарата «Биоспорин» - пробиотика из ассоциации бацилл В. subtilis ВКПМВ-2335(3) и В.licheniformis ВКПМВ-2336 (31). Отходом является фугат, полученный после отделения клеток, который используют в жидком виде в рационах животных ежедневно в период откорма или курсами по 14-21 день. Обоснованием к применению фугатов в качестве кормовой добавки в животноводстве является то, что содержащиеся в препарате клетки В.subtilis ВКПМВ-2335 (3) и В.licheniformis ВКПМВ-2336 (31) способствуют стабилизации нормальной микрофлоры кишечника, вытеснению патогенных и условно патогенных микроорганизмов, обеспечивают защиту от кишечных вирусов за счет стимуляции местного иммунитета, продукции интерферона и повышения общей резистентности организма (3). В фугате присутствует остаточное количество клеток бацилл, обеспечивающее его некоторую биологическую эффективность. Следует отметить, что получение пробиотиков, состоящих из ассоциации нескольких видов бактерий, требует контроля за сохранением необходимого соотношения форм бактерий в ассоциации для обеспечения стабильных показателей качества препарата и его отхода - фугата. Однако фугат не удобен для длительного хранения и транспортировки.

Приведенные выше примеры основаны на глубинном аэробном культивировании бацилл для накопления биомассы бактерий в жидкой питательной среде (2-3% сухих веществ в культуральной жидкости) и получении спор, в то время как естественные условия пищеварительного тракта - анаэробные, влажность химуса не превышает 75%, а микроорганизмы, обитающие в кишечном тракте, представлены вегетативными клетками. Кроме того, при получении препаратов не учитываются целлюлолитические свойства В.subtilis и не используются клетчатковые субстраты для выращивания клеток.

Известен способ получения корма для животных из растительного сырья, включающий измельчение растительного сырья и его ферментативный гидролиз, который осуществляют путем внесения в растительный субстрат предварительно приготовленного препарата на основе содержимого слепой кишки обыкновенной полевки Microtus arvalis (4). Однако предложенная ассоциация бактерий не может длительное время сохранять стабильное соотношение входящих в нее компонентов, что создает трудности для получения препарата с заданными свойствами.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения биологически активной кормовой добавки с помощью твердофазного процесса обработки целлюлозосодержащего сырья в факультативно-анаэробных условиях (5) прототип. Способ включает получение посевного материала, внесение его в количестве 2-10% в растительный субстрат (различные типы шротов, сухую пивную дробину, отруби и т.д.). Затем влажную массу помещают в условия затрудненного доступа кислорода (например, запаянные полиэтиленовые пакеты) и проводят твердофазную ферментацию субстрата в течение 5-48 часов. В качестве монокультуры бактерий, использующейся для получения биологически активной кормовой добавки, применена бацилла В.subtilis B-8130. Введение в комбикорм сухой пивной дробины, обогащенной препаратом, содержащим клетки В.subtilis 8130 (препарат Пробиоцел), и скармливание корма поросятам позволяет увеличить привесы животных за счет повышения усвояемости корма, снизить затраты комбикорма на 1 кг прироста живой массы поросят (6). Однако использование указанной дозы посевного материала В.subtilis 8130 для твердофазной ферментации растительного субстрата в факультативно-анаэробных условиях не вызывает накопления большого числа клеток бациллы Поэтому для обеспечения поступления в организм животного эффективного количества клеток пробиотика необходимо вводить в рацион животных относительно большое количество препарата (5% на тонну комбикорма). Это делает производство препарата крупнотоннажным и вызывает ряд трудностей: увеличение производственных площадей, обеспечение механизмами для подъема и транспортировки грузов, увеличение площади складских помещений, что удорожает стоимость препарата.

Для усиления биологической эффективности продуктов твердофазной ферментации при затрудненном доступе кислорода и увеличения численности клеток пробиотика в препарате, разработан способ получения биологически активной кормовой добавки, включающий две стадии ее получения глубинное аэробное культивирование пробиотических бактерий вида Bacillus subtilis с целлюлолитическими свойствами (к числу которых относится штамм В subtilis B-8130) для накопления биомассы клеток (первая стадия), и последующая твердофазная ферментация растительного сырья при затрудненном доступе кислорода (вторая стадия). Процесс осуществляют в присутствии бикарбоната натрия (NaHCO₃) для связывания ацетил-КоА и нейтрализации кислых продуктов ферментации, тем самым применяют метод метаболитной ловушки по Нейбергу для дрожжевого брожения.

Техническим результатом изобретения является стабильное улучшение пищеварения, повышение привесов и продуктивности животных, уменьшение падежа молодняка и увеличение сохранности поголовья.

При создании изобретения решается задача разработки биологически активной добавки, обладающей свойствами пробиотических препаратов, способствующей нормализации и активизации микробиоценоза кишечника, стимулирующей пищеварение, что способствует повышению усвояемости кормов и увеличивает привесы и продуктивность животных.

Для достижения технического результата при приготовлении биологически активной кормовой добавки на основе растительного сырья и целлюлолитической культуры В.subtilis В-8130 проводят аэробное глубинное культивирование бактерии до получения титра вегетативных клеток не менее 10⁹ КОЕ/мл, при этом осуществляют контроль на отсутствие спор в клетках бациллы, затем смешивают полученную жидкую культуру с растительным сырьем в весовом соотношении, обеспечивающем получение 45-70% влажности массы, к смеси добавляют бикарбонат натрия до достижения рН среды 7,0-7,5, и осуществляют процесс твердофазной ферментации при затрудненном доступе кислорода в течение 2-4 суток до получения конечного продукта с общей численностью клеток бациллы - не менее 10⁹ КОЕ/г. Аэробное глубинное культивирование бациллы В.subtilis B-8130 осуществляют, например, на глюкозо-пептонной питательной среде, состава, г/л глюкоза - 20.0, пептон - 4.0, дрожжевой экстракт - 1.5, (NH₄)₂HPO₄ - 1.5, MgSO₄ - 0.5, рН 7.2-7.4, что не ограничивает применения других целлюлолитических штаммов бактерий вида В.subtilis, и питательных сред иного состава. В качестве растительного сырья для твердофазной ферментации используют сухие клетчатковые субстраты (облепиховый, шиповниковый, подсолнечниковый шрот или жмых, отходы мукомольного производства, производства круп, в том числе, рисовую шелуху, шелуху гречихи, и т.п.).

Ниже приведены примеры получения биологически активной кормовой добавки.

Пример 1

Для получения препарата в количестве, необходимом для введения в 1 тонну комбикорма, проводят аэробное глубинное культивирование бациллы В.subtilis 8130 в 0.5 л глюкозопептонной питательной среды до достижения титра клеток 1.2×10⁹ КОЕ/мл. Осуществляют контроль на отсутствие спор в клетках и определяют эндоглюканазную активность (вискозиметрическим способом), которая составляет 7.0-14.0 ед./мл, протеазу, активность которой составляет до 120 ед./мл по методу Ансона. Полученные 0.5 л жидкой культуры смешивают с 0.6 кг подсолнечникового шрота для достижения влажности массы 45% и добавляют бикарбонат натрия (сода питьевая) до рН 7,0-7.2. Растительное сырье предварительно стерилизуют сухим жаром при 120°С, с помощью УФ-излучения или автоклавированием.

Сырую массу помещают в емкость в условия затрудненного доступа кислорода и проводят твердофазную ферментацию в течение 2 суток. Для ограничения доступа кислорода массу помещают высоким слоем в специальное оборудование типа закрытого смесителя с регулируемым нагревом, или ею заполняют до верха бочки или полиэтиленовые пакеты мешки, которые закрывают крышками, или плотно завязывают и помещают в термокамеру. Продукт ферментации представляет собой биотрансформированное растительное сырье, содержит общее количество клеток 10⁹ КОЕ/г, низкомолекулярные метаболиты (производные пропионовой и масляной кислот, низкомолекулярные амины, ароматические спирты, кислоты эфиры).

Пример 2

Проводят глубинное культивирование В.subtilis 8130, как в примере 1, до получения жидкой культуры с титром вегетативных клеток бациллы 1.5×10⁹ КОЕ/мл. Осуществляют микробиологический контроль в пробе на отсутствие в клетках спор. Затем проводят смешивание полученной жидкой культуры (0,5 л) с воздушно-сухим облепиховым шротом (п.2 формулы) в количестве 0.4 кг шрота, влажность полученной массы 70%. К смеси добавляют бикарбонат натрия в количестве, обеспечивающем достижение в смеси рН 7,5. Затем осуществляют процесс твердофазной ферментации при затрудненном доступе кислорода в течение 4 суток до получения конечного продукта с общим количеством клеток бациллы 5×10⁹ КОЕ/г. В конечном продукте присутствуют уксусная, пропионовая, масляная, гексановая кислоты.

Пример 3

Осуществляют, как в примере 1, глубинное культивирование бациллы В.subtilis 8130 до получения вегетативных клеток - 1.4×10⁹ КОЕ/мл. Смешивание жидкой культуры В.subtilis 8130 в количестве 0.5 л проводят с измельченной кожурой семян гречихи (п.2 формулы) в количестве 0.45 кг (влажность полученной сырой массы 60%), добавляют бикарбонат натрия в количестве, необходимом до достижения рН 7,3 и ведут твердофазную ферментацию в полностью заполненных и запаянных полиэтиленовых пакетах в течение 3 суток до получения конечного продукта с общим количеством клеток бациллы 2×10⁹ КОЕ/г.

В качестве растительного субстрата возможно использовать облепиховый, подсолнечниковый, шиповниковый шрот, измельченную кожуру семян гречихи и др. (см. п.2 ф-лы).

Подбор вышеуказанных параметров обусловлен оптимальными режимами для накопления клеток и активации выделения клетками биологически активных метаболитов.

Предложенные параметры при осуществлении заявленного способа получения биологически активной кормовой добавки для сельскохозяйственных животных являются оптимальными для получения высокоэффективной добавки - стимулятора пищеварения у животных и способствуют увеличению усвояемости корма, что увеличивает продуктивность, прирост живой массы животных при введении 0.25-0.5 кг добавки на тонну комбикорма (0.025-0.05%), т.е. при производстве кормовой добавки заявленным способом достигается технический результат изобретения.

При введении соды в процессе твердофазной ферментации рН реакционной массы не снижается ниже 5.8-5.9, и при этом эндоглюканаза и протеаза расщепляют целлюлозу и растительные пептиды, образуются низкомолекулярные органические кислоты, в том числе уксусная, пропионовая, масляная и гексановая кислоты, которые являются стимуляторами пищеварения. В продуктах ферментации определяются также низкомолекулярные амины, ароматические соединения. Бактериальная ферментация растительного субстрата ведет также к увеличению в продукте ферментации содержания аминокислот, в наибольшей степени - глутаминовой кислоты и гистидина. В препарате на основе облепихового шрота доля глутаминовой кислоты в сумме аминокислот составила 5,2%, гистидина - 0,84%, которые стимулируют обмен веществ, что в комплексе с другими отмеченными низкомолекулярными метаболитами обеспечивает заявленный технический результат.

Пробиотические функции В.subtilis B-8130 в препарате, полученном заявленным способом, могут проявляться в стимуляции развития отдельных видов представителей кишечного микробиоценоза (лактобактерий, руминококков), увеличении эффективности пищеварения, в стимуляции азотистого обмена веществ у животного, что ведет к увеличению мышечной массы.

Для доказательства этого предложения были изучены зоотехнические показатели бройлеров кросса Сибиряк, получавших комбикорм с 0.025% препарата на основе твердофазной ферментации облепихового шрота при затрудненном доступе кислорода в течение 2-х суток заявленным способом по данному изобретению и содержащего общее количество клеток бациллы 1.5×10⁹ клеток/г (группа Опытная 1) и бройлеров кросса ИЗА-15, получавших комбикорм с 0.05% препарата на основе твердофазной ферментации облепихового шрота при затрудненном доступе кислорода в течение 3-х суток заявленным способом по данному изобретению и содержащего общее количество клеток бациллы 1.6×10⁹ КОЕ/г (группа Опытная 2). Контрольная группа 1 не получала никаких препаратов, контрольная группа 0 получала комбикорм с 5% препарата-аналога с В.subtilis B-8130 (препарат Пробиоцел), контрольная группа 2 получала кормовой антибиотик «Флавомицин». Все группы цыплят получали одинаковый полнорационный корм. Показатели продуктивности откорма приведены в таблице.

Показатели продуктивности откорма бройлеровПоказательБройлеры кросса СибирякБройлеры кросса ИЗА-15Контроль 0Контроль 1Опыт 1Контроль 2Опыт 2Число цыплят в группе4050502482028943Возраст при убое, дни4343434242Сохранность, %92.091.092.593.493.0Среднесуточный привес, г43.141.544.845.447.4Среднесдаточный вес 1 головы, г19101825197019412054Расход корма, кг на кг привеса---1.891.89Конверсия корма, ц.к. ед.1.982.051.93--

Как показывают данные таблицы, при экспериментальном кормлении препаратами в течение 42-43-х дней в конце эксперимента увеличилась сохранность поголовья, приближаясь к показателям при введении кормового антибиотика, среднесуточный привес в опытных группах увеличился на 4.5-8%. Среднесдаточный вес 1 головы увеличился на 6-8% по сравнению с контрольными группами 1 и 2. Уменьшение конверсии корма в среднем на 3% на 1 голову свидетельствуют о повышении эффективности пищеварения у опытных бройлеров. Вместе с тем, опытные птицы показали лучшие технические результаты по сравнению с контрольной группой 0 по показателям среднесдаточного веса 1 головы, среднесуточным привесам и конверсии корма, что указывает на преимущества нового способа получения препарата заявленным способом по данному изобретению перед ближайшим аналогом.

Литература

1. RU 2184774 С1, C12N 1/20, 10.07.2002.

2. RU 2140165 С1, A23K 1/00, 27.10.1999.

3. RU 2236147 C2, A23K 1/00, 20.09.2004.

4. RU 2153813 С1, A23K 1/165, 10.08.2000.

5. RU 2202224 C2, A23K 1/165, 20.04.2003 (прототип).

6. RU 2284703 С1, А23К 1/06, 10.10.2006.

Способ получения биологически активной кормовой добавки из растительного сырья включает аэробное глубинное культивирование целлюлолитической бациллы Bacillus subtilis 8130 до получения титра вегетативных клеток не менее 10⁹ КОЕ/мл, осуществляя при этом контроль на отсутствие спор в клетках бациллы. Полученную жидкую культуру смешивают с растительным сырьем в массовом соотношении, обеспечивающем получение 45-70% влажности массы. Затем к смеси добавляют бикарбонат натрия до достижения рН среды 7,0-7,5 и проводят твердофазную ферментацию в течение 2-4 суток до получения конечного продукта с общим количеством клеток бацилл не менее 10⁹ клеток/г. В качестве растительного сырья используют облепиховый, шиповниковый, подсолнечниковый шрот или жмых, отходы мукомольного производства, производства круп, в том числе рисовую шелуху, шелуху гречихи. Это обеспечивает стабильное улучшение пищеварения, повышение усвояемости кормов и увеличение привесов и продуктивности животных. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ получения биологически активной кормовой добавки из растительного сырья, предусматривающий аэробное глубинное культивирование пробиотической целлюлолитической бациллы Bacillus subtilis 8130 до получения титра вегетативных клеток не менее 10⁹ КОЕ/мл, контроль на отсутствие спор в клетках бациллы, смешивание полученной жидкой культуры с растительным сырьем в массовом соотношении, обеспечивающем получение 45-70% влажности массы, к полученной смеси добавляют бикарбонат натрия до достижения рН среды 7,0-7,5 и проводят твердофазную ферментацию при затрудненном доступе кислорода в течение 2-4 сут до получения конечного продукта с общим количеством клеток бациллы не менее 10⁹ клеток/г.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве растительного сырья используют облепиховый, шиповниковый, подсолнечниковый шрот или жмых, отходы мукомольного производства, производства круп, в том числе, рисовую шелуху, шелуху гречихи.