СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ФЕРМ КМ ДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦЫ Российский патент 2011 года по МПК A23K1/165 C12N1/20 

Изобретение относится к кормопроизводству, в частности к способам приготовления биологически активных кормовых добавок для млекопитающих, птиц, рыб, повышающих эффективность пищеварения, оказывающих разностороннее действие на животный организм и позволяющих применять их как для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний, так и для стимуляции роста и повышения продуктивности животных.

Известен способ кормления сельскохозяйственных животных, при котором к основному рациону добавляют отход производства препарата «Биоспорин» - пробиотика из ассоциации бацилл Bacillus subtilis ВКПМ B-2335 и Bacillus licheniformis ВКПМ B-2336. Отходом является фугат, полученный после отделения клеток, который используют в жидком виде в рационах животных ежедневно в период откорма или курсами по 14-21 день. Содержащиеся в препарате клетки В. subtilis ВКПМ B-2335 и B. licheniformis ВКПМ B-2336 способствуют стабилизации нормальной микрофлоры кишечника, вытеснению патогенных и условно патогенных микроорганизмов, обеспечивают защиту от большой группы кишечных вирусов за счет стимуляции местного иммунитета, продукции интерферона и повышения общей резистентности организма (1). Следует отметить, что получение пробиотиков, состоящих из ассоциации нескольких видов бактерий, требует контроля за сохранением необходимого соотношения форм бактерий в ассоциации для обеспечения стабильных показателей качества препарата и его отхода - фугата.

Известен способ получения корма для животных из растительного сырья, включающий измельчение растительного сырья и его ферментативный гидролиз, который осуществляют путем внесения в растительный субстрат предварительно приготовленного препарата на основе содержимого слепой кишки обыкновенной полевки Microtus arvalis (2). Однако предложенная ассоциация бактерий не может длительное время сохранять стабильное соотношение входящих в нее компонентов, что создает трудности для получения препарата с заданными свойствами.

Известен способ получения биологически активной кормовой добавки на основе штамма бактерий B. subtilis ВКПМ B-8130, выделенного из слепой кишки глухаря. Получают добавку путем ферментации бактерии в жидкой безазотистой среде Эшби, с целлюлозосодержащим мелкофракционным субстратом в качестве источника углерода. Инкубацию ведут в течение от 5 до 72 ч в факультативно-анаэробных условиях с последующей сушкой целевого продукта при 60°C (3). Но при этом не происходит значительного накопления биомассы, что снижает эффективность препарата.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения биологически активной кормовой добавки, включающий две стадии ее получения: глубинное аэробное культивирование пробиотической целлюлолитической бациллы - штамма B. subtilis ВКПМ B-8130 с получением жидкой культуры (первая стадия), и последующая твердофазная ферментация растительного сырья при затрудненном доступе кислорода (вторая стадия). Процесс осуществляют в присутствии бикарбоната натрия (NaHCO₃) для связывания ацетил-КоА и нейтрализации кислых продуктов ферментации, тем самым применяют метод метаболитной ловушки по Нейбергу для дрожжевого брожения. В качестве растительного сырья используют облепиховый, шиповниковый, подсолнечниковый шрот или жмых, отходы мукомольного производства, производства круп (4). Недостатком является использование монокультуры бактерий, что ограничивает спектр биологического действия препарата на животный организм.

Техническим результатом изобретения является повышение продуктивности животных и птицы за счет нормализации кишечного микробиоценоза, увеличения перевариваемости кормов, стимуляции обменных и иммунных процессов организма. Применение пробиотической кормовой добавки Ферм КМ в рационах сельскохозяйственных животных и птиц обеспечивает их более интенсивный рост и развитие, увеличивает конверсию корма на 10% и повышает сохранность поголовья.

Для достижения технического результата при получении пробиотической кормовой добавки Ферм КМ для сельскохозяйственных животных и птицы осуществляют раздельное глубинное культивирование: целлюлолитической культуры Bacillus subtilis ВКПМ B-8130 и Bacillus subtilis ВКПМ B-2984 на питательной среде, содержащей, г/л:

меласса 24-26 глютен кукурузный 14-16 кукурузный экстракт 19-21 калий фосфорнокислый двузамещенный 1-3 натрий хлористый 9-11 магний сернокислый 0,4-0,6 вода остальное,

целлюлолитической культуры Bacillus subtilis ВКПМ B-4099 на питательной среде, содержащей, г/л:

меласса 14-16 глютен кукурузный 9-11 кукурузный экстракт 9-11 аммоний фосфорнокислый двузамещенный 1-3 натрий хлористый 9-12 магний сернокислый 0,4-0,6 вода остальное,

и Bacillus licheniformis ВКПМ B-4162 на питательной среде, содержащей, г/л:

меласса 24-26 кукурузный экстракт 18-22 калий фосфорнокислый двузамещенный 1-3 натрий хлористый 9-11 магний сернокислый 0,4-0,6 вода остальное,

в течение 18-24 ч, затем осуществляют твердофазное ферментирование, для чего полученные жидкие культуры Bacillus subtilis ВКПМ B-8130, Bacillus subtilis ВКПМ B-2984 и Bacillus subtilis ВКПМ B-4099 смешивают в соотношении 6:6:1, соответственно, наносят на стерильную смесь свекловичного жома и пшеничных отрубей, которую предварительно обрабатывают целлюлолитическим ферментом, растворенным в питательной среде, содержащей на 30 л воды: мелассу - 255-265 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 98-102 г, магний сернокислый - 25-26 г, дрожжи - 1,8-2,2 г, доводят pH до 7,5-8,0, и влажность замеса до 43-48%, смесь тщательно перемешивают, ведут твердофазную ферментацию в условиях ограниченного доступа кислорода в течение 48 часов при температуре 45-50°C и высушивают при температуре 50°C до влажности 8-10%, а жидкую культуру Bacillus licheniformis ВКПМ B-4162 непосредственно смешивают со свекловичным жомом и высушивают до влажности 8-9%, полученные высушенные продукты перемешивают в течение 0,5 ч и подвергают дроблению до получения однородного продукта.

В состав пробиотической добавки Ферм КМ входят штаммы Bacillus subtilis ВКПМ B-8130, Bacillus subtilis ВКПМ B-2984, Bacillus subtilis ВКПМ B-4099 и Bacillus licheniformis ВКПМ B-4162, которые обладают уникальными антагонистическими свойствами и эффективностью в отношении почти 90% условно-патогенных кишечных бактерий. В качестве фитосубстрата для проведения твердофазной ферментации используют смесь сухого свекловичного жома и пшеничных отрубей, взятых в соотношении 4:1. Для обработки фитосубстрата целлюлолитическим ферментом в качестве целлюлолитического фермента используют целловиридин или целлюлокс F с содержанием целлюлазы не менее 2000 ЕД/г.

Для повышения эффективности использования кормов и стимуляции роста и продуктивности животных и птицы в полученный продукт твердофазной ферментации вносят биологически активную добавку Лактовит для животных и птицы, выпускаемую ООО «НТЦ БИО» г.Шебекино, Белгородской обл. по ТУ 9291-002-54664067-2003. Лактовит содержит культуры: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum и/или Bifidobacterium longum и/или Bifidobacterium adolescentis, Lactococcus lactis subsp.cremoris или Lactococcus lactis subsp, casei, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus в количестве 4 л на загрузку.

Ниже приведены примеры получения биологически активной кормовой добавки.

Пример 1. Штаммы Bacillus subtilis ВКПМ B-8130, Bacillus subtilis ВКПМ B-2984, Bacillus subtilis ВКПМ B-4099 и Bacillus licheniformis ВКПМ B-4162 хранят и выращивают в пробирках на твердых питательных средах МПА или глюкозопептонной среде состава, г/л:

глюкоза 20,0 пептон 4,0 дрожжевой экстракт 1,5 аммоний фосфорнокислый двузамещенный 1,5 магний сернокислый 0,5 агар 2 вода водопроводная до 1 л

pH среды - 7,0±0,5.

Среду разливают в пробирки (в пятидесятимиллиметровые пробирки примерно по 20-25 мл среды), стерилизуют при 124±2°C в течение 40 мин. Пробирки со стерильной средой после автоклавирования скашивают для получения скошенного агара (косяков).

Стерильную среду засевают в асептических условиях. Выращивание культуры ведут при 37-45°C в течение 24 ч. Пересев на твердую среду производят 1 раз в 1-2 месяца. Пробирки с культурой переносят в холодильник и хранят в холодильнике при 4-6°C. Таким образом хранятся культуры и готовятся рабочие косяки для приготовления посевного материала в колбах.

Выращивание посевного материала в колбах ведут на среде следующего состава, (г/л):

меласса 15 глютен кукурузный 10 автолизат дрожжей (мл/л) 20 магний сернокислый 0,5 калий фосфорнокислый двузамещенный 2,0 вода водопроводная до 1 л

pH 7,0±0,5, на качалках при 190 об/мин при 400°С в течение 36 ч.

Получение жидких культур Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis осуществляют путем раздельного глубинного культивирования чистой микробиологической культуры в ферментерах из нержавеющей стали, в стерильных условиях, имеющих системы аэрации, перемешивания и поддержания постоянной температуры, на питательных средах, представленных в таблице 1.

Таблица 1 № п/п Название выращиваемой культуры Концентрация питательных компонентов в среде, г/л. Меласса Глютен кукурузный Кукурузный экстракт (NH)₂HPO₄ K₂HPO NaCl MgSO₄ Вода до 1 л 1 Bacillus subtilis ВКПМ B-8130 Bacillus subtilis ВКПМ B-2984 25 15 20 - 2 10 0,5   2 Bacillus licheniformis ВКПМ B-4162 25 - 20 - 2 10 0,5   3 Bacillus subtilis ВКПМ B-4099 15 10 10 2 - 1 1  

Время культивирования 20 ч.

Затем проводят твердофазное ферментирование, для чего готовят ферментационную массу. В качестве субстрата используют сухой свекловичный жом и отруби пшеничные, взятые в количестве: 200 кг - жом свекловичный и 5 кг - отруби пшеничные. Продукты тщательно перемешивают в течение 0,5 ч. В субстрат вносят 30 л воды и стерилизуют продукт при постоянном перемешивании и температуре 100°C в течение 3,0 ч, для чего в смеситель подают острый пар от парогенератора до достижения температуры стерилизации. После окончания процесса стерилизации устанавливают режим охлаждения субстрата до 50°C. Затем на 200 кг охлажденного субстрата вносят 30 л предварительно приготовленной питательной среды, содержащей: мелассу - 260 г (1,3 г на 1 кг субстрата), K₂HPO₄ - 100 г (0,5 г на 1 кг субстрата), Mg SO₄ - 26 г (0,13 г на 1 кг субстрата), дрожжи - 2.0 кг (10 г на 1 кг субстрата) и вода - до 30 л. В питательную среду перед внесением ее в субстрат добавляют целловиридин из расчета 200 г на объем среды - 1 г/кг сухого субстрата с содержанием целлюлазы не менее 2000 ЕД/г. Смесь тщательно перемешивают, выдерживают при температуре 48°C в течение 2 ч, pH смеси не должен превышать 6,5. После проведения процесса ферментолиза полученной смеси в нее добавляют смесь культуральных жидкостей Bacillus subtilis ВКПМ B-8130, Bacillus subtilis ВКПМ B-2984 по 30 л на загрузку, и Bacillus subtilis ВКПМ B-4099 - 5 л на загрузку, доводят pH до 8.0 и влажность замеса до 45%. Смесь тщательно перемешивают, расфасовывают в мешки и направляют в ферментационную камеру для проведения твердофазной ферментации при температуре 40°C в течение 2 сут. После завершения процесса твердофазной ферментации проводят сушку при температуре 50°C при перемешивании до влажности продукта 10%.

Одновременно на 200 кг свекловичного жома наносят 65 л жидкой культуры Bacillus licheniformis ВКПМ B-4162, содержащей не менее 5.6×10⁸ КОЕ/г, смесь тщательно перемешивают и сушат до влажности не более 9%.

Высушенный продукт после твердофазной ферментации смешивают в смесителе с сухой смесью Bacillus licheniformis ВКПМ B-4162 со свекловичным жомом в соотношении:

200 кг сухого продукта после твердофазной ферментации фитосубстрата смесью штаммов Bacillus subtilis и 25 кг сухой смеси Bacillus licheniformis ВКПМ B-4162 со свекловичным жомом. Полученную смесь продуктов перемешивают в течение 0,5 ч, передают на двухступенчатое дробление для получения однородного продукта с крупностью, соответствующей требованиям продукции комбикормовой промышленности.

Готовый продукт расфасовывают в мешки по 20 кг согласно НТД.

Пример 2. Получение жидких культур Bacillus subtilis ВКПМ B-8130, Bacillus subtilis ВКПМ B-2984 и Bacillus subtilis ВКПМ B-4099, стерилизацию, ферментолиз субстрата и смешение всех компонентов проводят аналогично примеру 1. Затем к полученной смеси культуральных жидкостей Bacillus subtilis и стерильного ферментированного субстрата добавляют биологически активную добавку Лактовит, выпускаемую ООО «НТЦ БИО» г.Шебекино, Белгородской обл. по ТУ 9291-002-54664067-2003 в количестве 4 л на загрузку. Доводят pH смеси до 7,5 и влажность замеса до 43%. Смесь тщательно перемешивают, расфасовывают в мешки и направляют в ферментационную камеру для проведения твердофазной ферментации при температуре 40°C в течение 2 сут. После завершения процесса твердофазной ферментации проводят сушку при температуре 50°C при перемешивании до влажности продукта 10%.

Одновременно на 200 кг свекловичного жома наносят 65 л жидкой культуры Bacillus licheniformis ВКПМ B-4162, содержащей не менее 5.6×10⁸ КОЕ /г, смесь тщательно перемешивают и сушат до влажности не более 9%.

Высушенный продукт после твердофазной ферментации смешивают в смесителе с сухой смесью Bacillus licheniformis ВКПМ B-4162 со свекловичным жомом в соотношении:

200 кг сухого продукта после твердофазной ферментации фитосубстрата смесью штаммов Bacillus subtilis и 25 кг сухой смеси Bacillus licheniformis ВКПМ B-4162 со свекловичным жомом. Полученную смесь продуктов перемешивают в течение 0,5 ч, передают на двухступенчатое дробление для получения однородного продукта с крупностью, соответствующей требованиям продукции комбикормовой промышленности.

Готовый продукт расфасовывают в мешки по 20 кг согласно НТД.

Полученная предложенным способом пробиотическая кормовая добавка Ферм КМ для сельскохозяйственных животных и птицы содержит: культуры Bacillus subtillis, Bacillus licheniformis, комплекс молочнокислых бактерий и продукты их метаболизма - набор важнейших ферментов - целлюлазу, эндоглюканазу, амилазу, протеазу, липазу, органические кислоты, фитосорбенты, биологически активные вещества, витамины и аминокислоты. При этом микробиологические культуры находятся в иммобилизованной форме на фитоносителе, позволяющей увеличивать их биологическую эффективность и обеспечивающей защиту бактерий от неблагоприятных условий окружающей среды. Совокупность названных факторов обеспечивает в животном организме деструкцию клетчатки, белков, полисахаридов, нейтрализацию токсинов, подавление патогенных микроорганизмов, обеспечивая улучшение секреторной функции пищеварительной системы, моторику кишечника и улучшение кровообращения. Носителем биологически активных веществ является фитосорбент - свекловичный жом и пшеничные отруби.

Иммобилизация клеток микроорганизмов на фитосорбенте, их защищенность, позволяет:

- микроорганизмам добавки проходить кислую среду желудка и уже в кишечнике подавлять патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, стимулировать в 5-7 раз развитие нормофлоры, в частности, руминококков, лактобацилл;

- выдерживать высокую температуру, сопутствующую промышленному производству гранулированных комбикормов (до 105°C);

- сохранять качественные характеристики при длительном хранении и в широком диапазоне температур.

Пробиотическая кормовая добавка Ферм КМ представляет собой сыпучий продукт от желтого до коричневого цвета. Совместим с компонентами, входящими в состав премиксов, комбикормов.

Рекомендуемые нормы ввода в комбикорма представлены в таблице 2.

Пробиотическая кормовая добавка Ферм КМ является ферментно-пробиотической кормовой добавкой нового поколения, обеспечивающей повышение продуктивности животных и птицы за счет увеличения переваримости кормов, стимуляции обменных и иммунных процессов организма.

На основании проведенных исследований по эффективности использования пробиотической добавки Ферм КМ для кормления животных и птицы установлено, что применение данной добавки увеличивает:

переваримость протеина на 2,2-2,9%;

переваримость жира на 0,55-1,4%;

доступность лизина, метионина на 2,5-2,9%;

использование кальция, фосфора на 5,6-3,5%;

повышает уровень обменной энергии на 5-8%.

Таблица 2 Применение Схема применения Результат Цыпленок бройлер 1-20 день 0,5 кг/т комбикорма Нормализация микрофлоры, стимуляция обменных и иммунных процессов, быстрое развитие ферментативной и пищеварительной систем, лучшая поедаемость кормов, увеличение среднесуточного прироста. Цыпленок бройлер с 20 дня - до убоя 0,25 кг/тонну комбикорма Цыпленок 1-20 день 0,5 кг/т комбикорма Нормализация микрофлоры, стимуляция обменных и иммунных процессов, быстрое развитие ферментативной и пищеварительной систем, лучшая поедаемость кормов. При переводе кур в категорию несушки за 15 дней и далее в течение 2 мес. 0,25 кг/тонну комбикорма Стимуляция воспроизводительной функции и связанных с нею последствий, снижение эмбриональной смертности. Новорожденные телята 0,5 г/голову сутки Нормализация микрофлоры, стимуляция обменных и иммунных процессов, быстрое развитие ферментативной и пищеварительной систем, лучшая поедаемость кормов, повышение среднесуточных привесов. Телята 2-6 месяцев 1-2 г/голову в сутки Телята с 6 мес. 2-3 г/голову в сутки (период откорма) Молочные коровы 3-5 г/голову в сутки Повышение поедаемости кормов, улучшение обмена веществ, стимулирует молочную продуктивность. Свиноматки 0,5 кг/т корма за месяц до опороса и в течение периода лактации Вынашивание более здоровых поросят. Поросята с начала прикорма 1,0 кг/тонну к/к в течение 2 мес. Нормализация микрофлоры, стимуляция обменных и иммунных процессов, быстрое развитие ферментативной и пищеварительной систем, повышение суточных привесов. Поросята на доращивании 0,5 кг/тонну к/корма Поросята на откорме 0,25 кг/тонну к/корма

Список литературы

1. RU 2236147 C2, A23K 1/00, 20.09.2004.

2. RU 2153813 C1, A23K 1/165, 10.08.2000.

3. RU 2202224 C2, A23K 1/165, 20.04.2003.

4. RU 2346463 C2, A61K 1/165, 20.02.2009.

Изобретение предназначено для использования в области кормопроизводства. Способ предусматривает получение жидких культур Bacillus subtilis ВКПМ В-8-130, Bacillus subtilis ВКПМ В-2984, Bacillus subtilis ВКПМ В-4099 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-4162 путем их раздельного аэробного глубинного культивирования на питательных средах заданного состава. Полученные жидкие культуры Bacillus subtilis смешивают в соотношении 6:6:1 соответственно, наносят на стерильную смесь свекловичного жома и пшеничных отрубей, которую предварительно обрабатывают целлюлолитическим ферментом, растворенным в питательной среде. Доводят рН до 7,5-8,0 и влажность замеса до 43-48%, смесь тщательно перемешивают и ведут твердофазную ферментацию в условиях ограниченного доступа кислорода в течение 48 ч при температуре 45-50°С и высушивают до влажности 8-10%. Жидкую культуру Bacillus licheniformis ВКПМ В-4162 непосредственно смешивают со свекловичным жомом и высушивают до влажности 8-9%. Высушенные продукты смешивают и подвергают дроблению до получения однородного продукта. Это обеспечивает повышение продуктивности животных и птицы за счет увеличения перевариваемости кормов, стимуляции обменных и иммунных процессов организма и нормализации кишечного микробиоценоза, увеличения сохранности поголовья. 2 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Способ получения пробиотической кормовой добавки для сельскохозяйственных животных, заключающийся в том, что осуществляют раздельное аэробное глубинное культивирование: целлюлолитической культуры Bacillus subtilis ВКПМ В-8130 и Bacillus subtilis ВКПМ В-2984 на питательной среде, содержащей, г/л:
меласса 24-26 глютен кукурузный 14-16 кукурузный экстракт 19-21 калий фосфорнокислый двузамещенный 1-3 натрий хлористый 9-11 магний сернокислый 0,4-0,6 вода остальное,

целлюлолитической культуры Bacillus subtilis ВКПМ В-4099 на
питательной среде, содержащей, г/л:
меласса 14-16 глютен кукурузный 9-11 кукурузный экстракт 9-11 аммоний фосфорнокислый двузамещенный 1-3 натрий хлористый 9-12 магний сернокислый 0,4-0,6 вода остальное,
и Bacillus licheniformis ВКПМ В-4162 на питательной среде, содержащей, г/л:
меласса 24-26 кукурузный экстракт 18-22 калий фосфорнокислый двузамещенный 1-3 натрий хлористый 9-11 магний сернокислый 0,4-0,6 вода остальное,
в течение 18-24 ч, затем осуществляют твердофазное ферментирование, для чего полученные жидкие культуры Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, Bacillus subtilis ВКПМ В-2984 и Bacillus subtilis ВКПМ В-4099 смешивают в соотношении 6:6:1, соответственно, наносят на стерильную смесь свекловичного жома и пшеничных отрубей, которую предварительно обрабатывают целлюлолитическим ферментом, растворенном в питательной среде, содержащей на 30 л воды: мелассу - 255-265 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 98-102 г, магний сернокислый - 25-26 г, дрожжи - 1,8-2,2 г, доводят рН до 7,5-8,0, и влажность замеса до влажности 43-48%, смесь тщательно перемешивают, ведут твердофазную ферментацию в условиях ограниченного доступа кислорода в течение 48 ч при температуре 45-50°С и высушивают при температуре 50°С до влажности 8-10%, а жидкую культуру Bacillus licheniformis ВКПМ В-4162 непосредственно смешивают со свекловичным жомом и высушивают до влажности 8-9%, полученные высушенные продукты перемешивают в течение 0,5 ч и подвергают дроблению до получения однородного продукта.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что перед твердофазным культивированием к полученным жидким культурам Bacillus subtilis дополнительно вводят биологически активную добавку Лактовит для животных и птицы, содержащую культуры: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum и/или Bifidobacterium longum и/или Bifidobacterium adolescentis, Lactococcus lactis subsp. cremoris или Lactococcus lactis subsp.casei, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве целлюлолитического фермента используют целловиридин или целлюлокс F с содержанием целлюлазы не менее 2000 ед/г.