СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОРМОВОГО ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A23K1/14 

Изобретение относится к кормопроизводству, в частности к способам приготовления пробиотических препаратов и биологически активных кормовых добавок для животных, птицы, оказывающих разностороннее действие на животный организм, и позволяющих применять их для стимуляции роста и повышения продуктивности.

Пробиотические препараты кормового назначения рассматриваются как потенциальная альтернатива кормовым антибиотикам, поэтому применение пробиотиков считается важнейшим элементом получения экологически чистых продуктов питания. Пробиотики - живые микробные добавки, которые оказывают благоприятное действие на организм животных путем улучшения кишечного микробного баланса, стимулируют обменные и иммунные процессы. Биологический потенциал пробиотических бактерий способствует улучшению здоровья животных, повышению уровня продуктивности, лучшему использованию кормов.

Определяющим фактором эффективности пробиотиков во многом является технология получения этих препаратов. Современный подход к разработке пробиотических препаратов подразумевает, во-первых, применение различных видов микроорганизмов в определенных сочетаниях и, во-вторых, выпуск их в форме, допускающей длительное хранение при обычной температуре. Клинико-экспериментальные исследования показали, что под действием желудочного сока и желчи многие пробиотики теряют почти 90% своей активности к моменту попадания в кишечник. Поэтому разрабатываются различные способы повышения выживаемости бактерий, например, за счет их иммобилизации на пористых носителях, включения в состав препарата компонентов питательной среды.

Известен способ получения сухого пробиотического препарата, предусматривающий получение маточной культуры штаммов микроорганизмов Rhuminococcus albus Kr, Lactobacillus acidophilus Scav ВКПМ В-4625, совместное культивирование маточной культуры на подсолнечном шроте при температуре 30-45°С в течение 4-8 суток, с последующим смешиванием полученной полувлажной формы с сухим шротом в соотношении 110-112 до получения влажности в готовом препарате 8-10% (1).

К недостаткам данного способа относится длительность процесса культивирования маточной культуры на подсолнечном шроте и сложность поддержания заявленного штамма руминококка в чистом виде, так как для этого требуется обязательное присутствие рубцовой жидкости в питательной среде.

Из уровня техники известен способ получения биологически активной кормовой добавки, включающий две стадии ее получения: глубинное аэробное культивирование пробиотической бациллы - штамма В. subtilis ВКПМ В-8130 с получением жидкой культуры (первая стадия), и последующая твердофазная ферментация растительного сырья при затрудненном доступе кислорода (вторая стадия). В качестве растительного сырья используют облепиховый, шиповниковый, подсолнечный шрот или жмых, отходы мукомольного производства, производства круп (2).

Недостатком является использование монокультуры бактерий, что ограничивает спектр биологического действия препарата на организм животного.

Ближайшим аналогом заявленного способа рассматривается способ получения пробиотической кормовой добавки Ферм КМ, которую получают путем раздельного глубинного культивирования штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, Bacillus subtilis ВКПМ В-2984, Bacillus subtilis ВКПМ В-4099 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-4162 и последующего твердофазного ферментирования. Полученные жидкие культуры Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, Bacillus subtilis ВКПМ В-2984 и Bacillus ВКПМ В-4099 смешивают в заданном соотношении, наносят на носитель - стерильный свекловичый жом, который предварительно обрабатывают целлюлолитическим ферментом, растворенным в питательной среде, содержащей на 30 л воды мелассу - 255-265 г, калий фосфорнокислый двузамещенный - 98-102 г, магний сернокислый - 25-26 г, дрожжи - 1,8-2,2 г. Доводят рН смеси до 6,0-6,5 и выдерживают 2 ч при температуре 45-50°С. После предобработки свекловичного жома к нему добавляют смесь культуральных жидкостей Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, Bacillus subtilis ВКПМ В-2984, Bacillus subtilis ВКПМ В-4099 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-4162, доводят рН до 7,5-8,0 и влажность замеса до 43-48% Смесь тщательно перемешивают, расфасовывают в мешки и проводят твердофазную ферментацию в условиях ограниченного доступа кислорода при температуре 45-50°С в течение 48-50 ч. После чего смесь высушивают до влажности продукта 8-10%. Полученный продукт передают на двухступенчатое дробление для получения однородной массы с крупностью, соответствующей требованиям продукции комбикормовой промышленности (3). Технология получения кормовых пробиотических препаратов в настоящем изобретении включает неполную твердофазную ферментацию содержащего клетчатку растительного субстрата (фитоносителя), в качестве которого используется измельченная солома, соевый шрот, подсолнечный шрот подобранной пробиотической композицией микроорганизмов. Конечный продукт состоит из биомассы пробиотиков, продуктов их метаболизма, продуктов биотрансформации фитосубстрата. В препарат входят фиточастицы, являющиеся клетчатковым микросорбентом. В состав бактериальной композиции пробиотического препарата включены живые клетки трех штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-8130, Lactococcus lactis subsp. laclis F-116 ВКПМ В-4591, а также Cellulomonas flavigena ВКПМ В-2559. Композиция подобранных бактерий демонстрирует пробиотический эффект в сочетании с активностью важнейших ферментов: целлюлазой, эндоглюканазой, амилазой, комплексом протеаз, липазой. Бактерии выделяют органические кислоты, биологически активные вещества, витамины, аминокислоты, иммуноактивные пептиды - продукты метаболизма пробиотиков. Штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-8130 отличается выделением соматостатин-подобного пептида, который выступает опосредованным антагонистом по отношению к этому гормону, поскольку вызывает аутоиммунную нейтрализацию эндогенного соматостатина, что снижает ингибирующее действие данного гормона на гормон роста соматотропин, инсулин и гастрин, и ведет к ростостимулирующему действию на организм животного (4). Примененный штамм лактококка Lactococcus lactis subsp. lactis F-116 ВКПМ В-4591, известный как продуцент низина (5), обладает широким спектром антибиотического действия и уникальными фунгицидными свойствами (6). Штамм Cellulomonas flavigena ВКПМ В-2559, известный в получении корма из растительного сырья (7), выделяет целлюлазы и введен в композицию с целью предобработки поверхности фитоносителя, повышения рельефности поверхности для увеличения площади образующейся на ней биопленки пробиотиков. Пробиотики в виде биопленки на фитоносителе отличаются высокой биологической активностью и повышенным сроком сохранности препарата. Бактерии в биопленке устойчивы к воздействию ультрафиолетового излучения, вирусам, антибиотикам и высушиванию. В ней по иному происходят физиологические процессы, продукция метаболитов и биологически активных веществ.

Технический результат изобретения заключается в повышении биологической активности препарата, увеличении до 7 месяцев срока его сохранности, применение препарата обеспечивает высокоэффективное использование корма, улучшает его конверсию, прирост живой массы молодняка, переваривание животными некрахмалистых полисахаридов из различных видов зерна.

Технический результат от реализации изобретения достигается тем, что в способе получения кормового пробиотического препарата для сельскохозяйственных животных проводят подготовку фитоносителя путем смешивания 4-4,5 кг содержащего клетчатку растительного субстрата с 1 л водопроводной воды, 150-160 г автолизата пекарских дрожжей, 2-3 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,5-0,6 г магния сернокислого, 6-8 г мелассы и последующей стерилизацией автоклавированием, в полученный фитоноситель вносят жидкую культуру Cellulomonas flavigena ВКПМ В-2559 и выдерживают при 45-47°С в течение 4-4,5 ч, а затем вносят жидкие культуры Bacilis subtilis ВКПМ В-8130 и Lactococcus lactis subsp. lactis F-116 ВКПМ В-4591 в равных количествах, смесь перемешивают, выдерживают при температуре 37-38°С в течение 48-50 ч и высушивают до влажности 8-10%. Полученный пробиотический препарат в виде биопленки на фитоносителе сохраняет свою биологическую активность в течение 7 месяцев. Препарат предназначен для повышения эффективности пищеварения, повышения массы тела сельскохозяйственных животных и птицы, введением ее в кормовые рационы в дозе 1 кг/т прямым вводом в комбикорм или вводом ее в премиксы, БМВД, суперконцентраты или другие составляющие комбикорма.

Экспериментально было найдено, что предпочтительными средами, используемыми для приготовления жидких пробиотических культур, вносимых в подготовленный фитоноситель, являются среды следующего состава:

жидкую культуру Bacilis subtilis ВКПМ В-8130 получают выращиванием на среде, содержащей, масс.%: глюкоза 2,0-2,2, пептон 0,5-0,6, дрожжевой экстракт 0,3-0,4, калий фосфорнокислый двузамещенный 0,1-0,12, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,05-0,055, магний сернокислый 0,02-0,022, вода водопроводная - остальное;

жидкую культуру Cellulomonas flavigena ВКПМ В-2559 получают выращиванием на среде, содержащей, масс.%: глюкоза 2,0-2,2, пептон 0,5-0,6, дрожжевой экстракт 0,3-0,4, калий фосфорнокислый двузамещенный, 0,1-0,12, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,05-0,055, магний сернокислый 0,02-0,022, измельченная солома 25-27, вода водопроводная - остальное;

жидкую культуру Lactococcus lactis subsp. lactis F-116 ВКПМ В-4591 получают выращиванием на среде, содержащей, масс.%: сахароза 2,0-2,2, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,2-0,22, магний сернокислый 0.02-0.022, автолизат пекарских дрожжей 35-37 мг% по азоту аммония, вода водопроводная - остальное.

При проведении исследований по подбору сырья природного происхождения в качестве содержащего клетчатку растительного субстрата (используемого фитоносителя) было обнаружено, что измельченная солома, соевый шрот, подсолнечный шрот обеспечивают высокую активность культуры Cellulomonas flavigena ВКПМ В-2559 при ферментативной предобработке поверхности фитоносителя, что приводит к повышению рельефности поверхности, обеспечивающей увеличение площади биопленки, образующейся на ней при выращивании вышеобозначенных пробиотических культур. Благодаря особенностям химического состава шроты соответствуют сложным трофическим потребностям и молочнокислых бактерий Lactococcus lactis, т.к. содержат аминный азот на уровне 0,189-0,218% и растворимые и легкогидролизуемые углеводы 1,723-2,793% при концентрации минеральных веществ в пределах 6,4-9,7%, что позволяет считать данное сырье ценным питательным субстратом.

Приведенные ниже примеры описывают настоящее изобретение и иллюстрируют его осуществление.

Пример 1. Технология получения препарата:

Глубинным способом при аэрации и температуре 37°С выращивают штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-8130 в жидкой питательной среде состава, масс.%: глюкоза - 2.0; пептон - 0.5; дрожжевой экстракт - 0.3; калий фосфорнокислый 2-х замещенный - 0,1; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,05, магний сернокислый - 0,02, вода водопроводная - остальное до 1 л, рН 7 до достижения культурой стационарной фазы развития.

В 1 л жидкой питательной среды аналогичного состава, но с добавлением 25 г/л измельченной соломы выращивают штамм Cellulomonas flavigena ВКПМ В-2559 при температуре 37°С до достижения культурой стационарной фазы развития.

В 1 л жидкой питательной среды, состава, мас.%: сахароза - 2,0, калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,2; магний сернокислый - 0,02; автолизат пекарских дрожжей - 35 мг% по азоту аммония; вода водопроводная - остальное, рН 6,8-7,0 выращивают штамм Lactococcus lactis subsp. lactis ВКПМ В-4591 до достижения культурой стационарной фазы развития.

Подготавливают фитоноситель: 4,0 кг измельченной соломы смешивают с 1 л водопроводной воды, 150 г автолизата пекарских дрожжей, 2 г K₂HPO₄, 0,125 г MgSO₄, 1,5 г мелассы, полученную массу после перемешивания стерилизуют автоклавированием. В полученную стерильную массу фитоносителя вносят 1 л выращенной культуры Cellulomonas flavigena ВКПМ В-2559, все перемешивают и выдерживают при температуре 45°С в течение 4 ч.

В подготовленный фитоноситель последовательно вносят 1 л выращенной культуры Bacillus snbtilis ВКПМ В-8130 и 1 л выращенной культуры Lactococcus lactis subsp. Lactis ВКПМ В-4591. Смесь после перемешивания выдерживают при температуре 37°С в течение 48 ч и затем высушивают при температуре не выше 45°С до влажности 8%. Количество живых бактерий L. acidophilus и В. subtilis в сухом препарате составляет не менее 3×10⁹ КОЕ/г и 4×10¹⁰ KOE/г соответственно.

Пример 2. Приготовление фитоносителя на основе подсолнечного шрота

Жидкие пробиотические культуры готовят по способу, аналогичному описанному в примере 1.

Подготавливают фитоноситель: 4,5 кг измельченного подсолнечного шрота смешивают с 1 л водопроводной воды, 160 г автолизата пекарских дрожжей, 3 г K₂HPO₄, 0,130 г MgSO₄ и 1,8 г мелассы, полученную массу после перемешивания стерилизуют автоклавированием. В полученную стерильную массу фитоносителя вносят 1 л выращенной культуры Cellulomonas flavigena ВКПМ В-2559, все перемешивают и выдерживают при температуре 45°С в течение 4 ч. Затем в смесь последовательно вносят 1 л выращенной культуры Bacillus subtilis ВКПМ В-8130 и 1 л выращенной культуры Lactococcus lactis subsp.Lactis ВКПМ B-4591. Смесь после перемешивания выдерживают при температуре 38°С в течение 50 ч и затем высушивают при температуре не выше 45°С до влажности 10%.

Пример 3

Была проведена ферментация соломы кормовым пробиотическим препаратом по способу, описанному в примере 1. Полученный препарат влажностью 9% введен в комбикорм для лабораторных крыс из расчета 1 кг препарата на 1 тонну кормосмеси, в состав которой кроме комбикорма для крыс входило зерно. В эксперименте были подобраны две группы молодых крыс в возрасте 1 месяца, по 5 самок и по 5 самцов в каждой, уравненные по средней массе тела. Контрольных животных содержали на обычном рационе, опытных - на рационе с введенной кормовой добавкой. Еженедельно проводили индивидуальное взвешивание крыс. В результате кормления в течение месяца было получено: средняя масса тела опытных животных составила 181.2 г, общий привес 71,6 г и среднесуточный прирост живой массы тела - 21,7 г. В то время как средняя масса тела контрольных крыс составила 166,4 г, общий привес 64,4 г и среднесуточный прирост - 19,6 г. Таким образом, средняя масса тела опытных животных на 10,7% была больше контрольных, общий привес - на 11,2% больше, чем в группе контрольных крыс, что соответствовало увеличению на 10,7% среднесуточного прироста опытных животных.

Полученный пробиотический препарат в виде биопленки на фитоносителе сохранял свою биологическую активность в течение 7 месяцев, что подтвердили повторные испытания препарата в рационе 1 месячных крыс спустя 6 месяцев хранения препарата при комнатной температуре в проветриваемом помещении. В результате повторного опытного кормления в описанных выше условиях в течение месяца комбикормом, в состав которого был введен препарат, срок хранения которого составил 6 месяцев, было получено: средняя масса тела опытных животных составила 180,8г, общий привес 70,8 г и среднесуточный прирост живой массы тела - 21,5 г.

Пример 4. Была проведена ферментация подсолнечного шрота кормовым пробиотическим препаратом по способу, описанному в примере 1. Полученный препарат влажностью 8% введен в комбикорм для цыплят из расчета 1 кг препарата на 1 тонну кормосмеси. В эксперименте были подобраны две группы - контрольная и опытная по 10 голов в каждой. Птица потребляла полнорационные комбикорма с питательностью по нормам ВНИТИП (2010 г.) вволю.

Контрольных птиц содержали на обычном рационе, опытных - на рационе с введенной кормовой добавкой. Скармливание в течение месяца молодняку опытной группы комбикорма, содержащего биологически активную пробиотическую добавку, способствовало увеличению живой массы цыплят на 11,4%. Расход корма на 1 кг прироста живой массы опытного молодняка составил 1,65 кг, что на 3,5% ниже, чем у птицы контрольной группы, что указывало на повышение переваримости и усвояемости корма.

Пример 5. Была проведена ферментация соевого шрота кормовым пробиотическим препаратом по способу, описанному в примере 1. Полученный препарат влажностью 8% введен в комбикорм для молодняка кроликов из расчета 1 кг препарата на 1 тонну кормосмеси. В эксперименте были подобраны две группы - контрольная и опытная по 5 голов в каждой. Кроликов содержали в сетчатых клетках, поение производили из сосковых поилок, кормление - из бункеров вволю, температура воздуха колебалась в пределах 18,5-20,3°С. Кормление осуществлялось смесью кормовой гранулированной №343 для скармливания с.-х. животным. Контрольных животных содержали на обычном рационе, опытных - на рационе с введенной кормовой добавкой. Переваримость питательных веществ определяли по существующим методикам зоотехнического анализа. При введении в комбикорм препарата переваримость рациона и его отдельных компонентов через месяц эксперимента возросла по сравнению с контролем на 13,5%, переваримость сырого протеина - на 21,8%, сырой клетчатки - на 43,2%. Среднесуточный прирост живой массы увеличился по сравнению с контролем на 13%.

Источники информации

1. Патент RU 2280464, 27.07.2006.

2. Патент RU 2346463 C2, 20.02.2009.

3. Патен RU 2412612 С1, 27.02.2011.

4. Н.А. Ушакова, В.В. Вознесенская, А.А. Козлова, А.В. Нифатов, и др. Выделение соматостатин-подобного пептида клетками Bacillus subtilis B-8130, кишечного симбионта дикой птицы Tetrao urogallus, и влияние бациллы на животный организм // Доклады АН. 2010, том 434, №2, с.282-285.

5. SU 1687616 A1, 30.10.1991.

6. Стоянова Л.Г., Устюгова Е.А., Нетрусов А.А. Антимикробные метаболиты молочнокислых бактерий, разнообразие и свойства (обзор). Прикладная биохимия и микробиология 2012, т.48, №3, с.259-275.

7. Патент RU 2155496 C2, 10.09.2003.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения кормового пробиотического препарата для сельскохозяйственных животных. Способ предусматривает подготовку фитоносителя путем смешивания содержащего клетчатку растительного сырья, водопроводной воды, автолизата пекарских дрожжей, калия фосфорнокислого двузамещенного, магния сернокислого и мелассы в заданном соотношении компонентов. Полученный фитоноситель стерилизуют и вносят жидкую культуру Cellulomonas flavigena ВКПМ В-2559 и выдерживают при заданных параметрах. Затем последовательно вносят жидкие культуры Bacillus subtilis В-8130 и Lactococcus lactis subsp. lactis ВКПМ B-4591 в равных количествах. Полученную смесь перемешивают, выдерживают при заданных параметрах процесса и высушивают до остаточной влажности 8-10%. При этом в качестве содержащего клетчатку растительного сырья используют измельченную солому, подсолнечный или соевый шрот, а жидкие культуры пробиотических штаммов Cellulomonas flavigena ВКПМ В-2559, Bacillus subtilis ВКПМ В-8130 и Lactococcus lactis subsp. lactis ВКПМ B-4591 получают путем выращивания их на питательных средах, предназначенных для каждого штамма смеси в отдельности. Изобретение позволяет повысить биологическую активность препарата, повысить перевариваемость кормов, повысить прирост живой массы животного и увеличить срок его сохранности. 4 з.п. ф-лы, 5 пр.

1. Способ получения кормового пробиотического препарата для сельскохозяйственных животных, характеризующийся тем, что проводят приготовление фитоносителя путем смешивания 4-4,5 кг содержащего клетчатку растительного субстрата с 1 л водопроводной воды, 150-160 г автолизата пекарских дрожжей, 2-3 г калия фосфорнокислого двузамещенного, 0,125-0,130 г магния сернокислого, 1,5-1,8 г мелассы и стерилизации носителя автоклавированием, в полученный фитоноситель вносят жидкую культуру Cellulomonas flavigena ВКПМ В-2559 и выдерживают при 45-47°С в течение 4-4,5 ч, а затем вносят жидкие культуры Bacillus subtilis ВКПМ В-8130 и Lactococcus lactis subsp. lactis ВКПМ B-4591 в равных количествах, полученную смесь перемешивают, выдерживают при температуре 37-38°С в течение 48-50 ч и высушивают до влажности 8-10%.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что Bacillus subtilis ВКПМ В-8130 выращивают на среде, содержащей, мас.%: глюкозу 2,0-2,2, пептон 0,5-0,6, дрожжевой экстракт 0,3-0,4, калий фосфорнокислый двузамещенный 0,1-0,12, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,05-0,055, магний сернокислый 0,02-0,022, воду водопроводную - остальное.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что Cellulomonas flavigena ВКПМ В-2559 выращивают на среде, содержащей, мас.%: глюкозу 2,0-2,2, пептон 0,5-0,6, дрожжевой экстракт 0,3-0,4, калий фосфорнокислый двузамещенный, 0,1-0,12, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,05-0,055, магний сернокислый 0,02-0,022, измельченную солому 25-27, воду водопроводную - остальное.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что Lactococcus lactis subsp. lactis ВКПМ B-4591 выращивают на среде, содержащей, мас.%: сахарозу 2,0-2,2, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,2-0,22, магний сернокислый 0,02-0,022, автолизат пекарских дрожжей 35-37 мг% по азоту аммония, воду водопроводную - остальное.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве содержащего клетчатку растительного субстрата используют измельченную солому, подсолнечный или соевый шрот.