КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ СБОРА И ХРАНЕНИЯ ДНК ИЛИ ДНК-СОДЕРЖАЩИХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СЛЕДОВ (ВАРИАНТЫ) И ЕЁ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2018 года по МПК C12N15/10 C12Q1/68 A01N1/02 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к буферной жидкой композиции, предназначенной для сбора и хранения ДНК или ДНК-содержащих биологических следов, в том числе потожировых следов, в сухом и жидком виде. Указанная композиция обеспечивает стабильность ДНК биообразцов в широком диапазоне температур в течение длительных периодов времени.

Уровень техники

В настоящее время в медицине и криминалистике молекулярно-генетический анализ является одним из самых доказательных методов анализа биологических следов человека: потожировых следов (ПЖС), следов крови, слюны, спермы и т.д. В биологических следах, например, таких как ПЖС, содержится малое количество генетического материала, и его зачастую недостаточно для идентификации образца. Изъятие биологических наложений на месте происшествия достаточно часто проводится с использование стандартных методов, без учета особенностей исследуемого объекта и сложившихся обстоятельств. Этап проведения лабораторных исследований полученных образцов может быть отсрочен и наступить через длительный период времени. Зачастую причиной непригодности для идентификации отобранного биологического материала на месте происшествия является его неправильный сбор, транспортировка и хранение. Поэтому большое значение имеет выбор эффективного способа сбора биологических следов, обеспечивающего сохранение количества и качества отобранного материала.

Хранение биологического материала, в частности смывов биологических следов, на твердом носителе (например, на хлопчатобумажной ткани) в сухом виде перед проведением лабораторных исследований является наиболее распространенным и простым способом, при котором биообразцы находятся в условиях комнатной температуры без использования дорогостоящей техники. Носитель со смывом биологических следов для предотвращения деградации молекул ДНК должен быть хорошо высушен перед хранением, защищен от действия солнечного света, высокой температуры и влажности воздуха.

Наиболее часто используемым способом сбора на месте происшествия биологических следов является проведение смывов при помощи марлевых салфеток, смоченных в деионизованной воде. При работе со смывами биологических следов, содержащих малое количество генетического материала, например ПЖС, получение полного генетического профиля лица, оставившего свои следы, сопряжено со значительными трудностями. Это можно объяснить как изначально низким содержанием генетического материала в следах, так и возможной деградацией активной ДНК-матрицы с течением времени в условиях отсутствия стабилизирующих ДНК факторов (Фалеева Т.Г., Иванов И.Н., Мишин Е.С., Внукова Н.В., Корниенко И.В. Проблемы молекулярно-генетической идентификации потожировых следов отпечатков пальцев человека // Судебно-медицинская экспертиза. - 2016. - №2. - С.14-18).

При работе в области молекулярно-генетических исследований можно столкнуться с образцами смывов биологических следов и наложений, выполненных с использованием физиологического раствора. Физиологический раствор, содержащий NaCl в высокой концентрации (около 150 мМ), способен ингибировать реакцию энзиматической амплификации, что может затруднять проведение «прямой» полимеразной цепной реакции (ПЦР), то есть ПЦР без предварительного выделения и очистки препаратов ДНК.

Буфер TE широко используется в биохимии и молекулярной биологии для растворения ДНК или РНК и предотвращения деградации нуклеиновой кислоты. Буфер TE состоит из 10 мМ Трис-HCl рН=8,0, 0,1-1,0 мМ ЭДТА. Несмотря на свои защитные свойства в отношении генетического материала данный буфер не получил широкого применения в качестве среды для хранения, выполненных с его использованием, смывов биообразцов в сухом виде.

В патенте RU 2567145 предлагается композиция для хранения ДНК-содержащих препаратов или ДНК и ее применение для консервации биологических образцов, обеспечивающее сохранность нуклеиновых кислот. Композиция включает 0,5-4% натрий лауроилсаркозин, являющийся детергентом и ингибитором ПЦР, а также ЭДТА (этилендиамин-N,N,N',N'-тетраацетат) в высоких концентрациях (5-20 мМ), которые ингибируют ПЦР и существенно затрудняют или делают невозможным проведение «прямой» ПЦР без добавления различного рода активаторов (обычно неионных детергентов).

В патенте RU 2164532 предлагаются способы и наборы реагентов для генамплификационной диагностики методами ПЦР и РНК-ПЦР. Предлагаемые способы и наборы предназначены для генотестирования, генодиагностики и не обеспечивают длительного хранения генетического материала с их использованием. Набор реагентов для выделения суммы ДНК и РНК содержит лизирующий раствор, в состав которого входят натрий лауроилсаркозин, являющийся детергентом, а также йодистый натрий и/или гуанидинтиоцианат, которые способны ингибировать ПЦР, существенно затруднять или делать невозможным проведение «прямой» ПЦР.

В патенте RU 2258710 предлагается новый цитокин zalpha11-лиганд. Описан способ получения антитела к полипептиду zalpha11-лиганда. Описанные жидкие буферные композиции не обеспечивают длительного хранения генетического материала с их использованием. Высокие концентрации NaCl (100 мМ) и SDS (ДСН, додецилсульфат натрия), являющегося мощным детергентом, в составе лизирующего буфера способны ингибировать ПЦР, существенно затруднять или делать невозможным проведение «прямой» ПЦР.

В патенте RU 2132853 предлагается способ идентификации продуктов из смеси, продукт, полученный при идентификации, способ получения смеси и способ совместного получения катализирующей нуклеиновой кислоты и продукта. Использование высоких концентраций MgCl₂ (60 мМ) для реакции транскрипции в составе 5х Т7 РНК полимеразного буфера приведет к полному ингибированию ДНК-Taq-полимеразы (которая полностью ингибируется концентрациями MgCl₂ свыше 10 мМ), препятствуя или делая невозможным проведение ПЦР.

В патенте CZ 304780 (В6) предлагается способ хранения ДНК гистопатологического материала. Наличие в состав раствора K лизирующего буфера протеиназы K в концентрации 20 мг/мл способно (без дополнительной очистки) полностью ингибировать ПЦР за счет ферментного гидролиза ДНК-Taq-полимеразы.

В патенте US 6310045 В1 предлагаются композиции и методы для иммунотерапии рака. Высокие концентрации NaCl (150 мМ) и SDS (додецилсульфат натрия), являющегося мощным детергентом, в составе используемого лизирующего буфера для клеток способны ингибировать ПЦР или делать невозможным проведение «прямой» ПЦР.

В патенте KR 20040026519 (А) предлагается метод выделения ДНК для ПЦР анализа трансгенной рыбы. Описанный способ не обеспечивает длительного хранения генетического материала. Наличие SDS (додецилсульфат натрия), являющегося мощным детергентом, и высокой концентрации NaOH (20 мМ) в составе буферного раствора-Х способно ингибировать ПЦР и существенно затруднять проведение «прямой» ПЦР. Высокие концентрации MgCl₂ (5 мМ) в составе буферного раствора-Y способствуют возникновению неспецифичных продуктов амплификации при постановке «прямой» ПЦР.

В патенте KR 20020029476 (А) предлагается лизирующий буферный реагент для одностадийного выделения гена. Описанный способ не обеспечивает длительного хранения генетического материала. Наличие высоких концентраций ЭДТА (этилендиамин-N,N,N',N'-тетраацетат) (10 мМ) в составе лизирующего буфера способно ингибировать ПЦР (за счет образование хелатных комплексов с ионами магния (II) и, соответственно, «выключения» их из реакции энзиматической амплификации) или существенно затруднять проведение «прямой» ПЦР.

В патенте CN 102796727 (А) предлагается способ экстракции нуклеиновых кислот грамположительных бактерий. Описанный способ не обеспечивает длительного хранения генетического материала. Наличие в экстракте А детергентов SDS (додецилсульфат натрия) и натрий лауроилсаркозина, а также фенола в составе экстракта В используемого реагента способно ингибировать ПЦР или делать невозможным проведение «прямой» ПЦР.

В патенте ЕА 004880 предлагается набор для анализа обратной транскриптазы и его применение. Описанный способ не обеспечивает длительного хранения генетического материала. Использование в составе набора для составления анализов обратной транскриптазы ионов двухвалентного металла Mg²⁺ в концентрации свыше 10 мМ приводит к ингибированию ДНК-Taq-полимеразы, тем самым препятствует проведению ПЦР. Наличие гепаринсульфата в качестве ингибитора РНКазы в составе набора способно ингибировать ПЦР или делать невозможным проведение «прямой» ПЦР.

В патенте KR 20030006505 предлагается лизирующий клетки буфер для выделения ДНК и способ выделения ДНК с его использованием. Описанный способ не обеспечивает длительного хранения генетического материала. Наличие таких поверхностно активных веществ, как SDS (додецилсульфат натрия) и сульфата саркозила, являющихся детергентами, а также протеазы в составе лизирующего буфера способно ингибировать ПЦР или делать невозможным проведение «прямой» ПЦР.

В патенте US 6071698 предложен буфер для выделения ДНК и способ его использования. Описанная жидкая буферная композиция предназначена для экстракции ДНК и не обеспечивает длительного хранения генетического материала с ее использованием. Использование высоких концентраций NaCl (0,15-2,0 Μ) и ЭДТА (этилендиамин-N,N,N',N'-тетраацетат) (180-500 мМ) в буфере для выделения ДНК способно ингибировать ПЦР или делать невозможным проведение «прямой» ПЦР.

В патенте US 20020115089 А1 предлагается технология одновременного сбора ДНК и ненуклеиновых аналитов. Наличие высоких концентраций хлорида натрия (1-20 мг/см²), хлорида кальция (1-20 мг/см²), ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат) (0,05-0,15 М), мощного детергента додецилсульфата натрия (SDS, 0,2-1%), протеиназы K (50-150 мкг/мл) в составе композиций способно ингибировать ПЦР или делать невозможным «прямой» ПЦР.

В лабораторных условиях смывы биологических следов и наложений на поверхности исследуемых объектов могут проводиться при помощи различных лизирующих растворов с известным составом, например, 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ Na₂ЭДТА, 50 мМ NaCl, 2% SDS (Корниенко И.В., Харламов С.Г. Методы исследования ДНК человека. Выделение ДНК и ее количественная оценка в аспекте судебно-медицинского исследования вещественных доказательств биологического происхождения: учебно-методическое пособие / И.В. Корниенко, С.Г. Харламов. Ростов н/Д: ЮФУ, 2012. - 216 с.) и коммерческими, в состав которых входят соли гуанидиния в высоких (несколько моль) концентрациях, например лизирующий буфер (Lysis buffer) набора реагентов DNA IQ™ System (Promega, США) и лизирующий буфер (Lysis buffer) набора реагентов PrepFiler™ User Guide (Applied Biosystems, США). Однако такой способ получения биологического материала подразумевает незамедлительное выполнение экстракции ДНК, а проведение «прямой» ПЦР невозможно вследствие ингибирования реакции компонентами растворов.

При выделении ДНК из биологических следов, содержащих изначально малое количество генетического материала, например, таких как потожировое вещество, необходим способ, который позволил бы осуществлять экстракцию с минимальными потерями генетического материала, максимально исключить контаминацию исследуемых объектов посторонней ДНК и выполнять «прямую» ПЦР без предварительной очистки препарата.

Выделение ДНК при помощи ионообменной смолы Chelex-100 позволяет с минимальными потерями извлекать генетический материал, однако он не всегда обеспечивает необходимую чистоту получаемого препарата. При использовании этого способа сложно получить концентрированный препарат ДНК без угрозы ингибирования ПЦР частицами ионообменной смолы Chelex-100.

Метод фенол-органической экстракции применим к изначально большому объему биологического материала, так как сопряжен со значительными потерями ДНК в процессе ее экстракции. Высокая токсичность и сложность утилизации реагентов отрицательно сказалась на популярности данного метода, и в настоящее время в большинстве лабораторий он заменен такими методами как нуклеосорбция с помощью диоксида кремния (силики), реализованным в большинстве коммерческих наборов (Essentials of Nucleic Acid Analysis. A Robust Approach. Ed. Keer J.T., Birch L. Published by The Royal Society of Chemistry. Cambridge. - 2008. - 248 p.; Корниенко И.В., Фалеева Т.Г. Усовершенствованный метод выделения ДНК человека из биологических образцов, содержащих малое количество генетического материала, с помощью набора реагентов DNA IQ (PROMEGA) // Клинико-лабораторный консилиум. - 2013. - №4 (47). - С.49-53.). Одними из таких наборов реагентов являются системы для выделения ДНК «DNA IQ™» (Promega, США) и PrepFiler™ User Guide (Applied Biosystems, США), при помощи которых можно получить высокоочищенные препараты ДНК как вручную, так и с помощью роботизированной техники. Несмотря на это данные наборы реагентов достаточно дорогостоящи, а методы с их использованием включают многоэтапный процесс экстракции ДНК, что приводит к ее незначительной потере и риску контаминации образцов. Однако даже столь небольшие потери ДНК крайне существенны при работе с объектами, содержащими изначально малое количество генетического материала.

Таким образом, универсального способа с использованием жидкой буферной композиции для осуществления сбора и хранения ДНК-содержащих биологических следов, содержащих малое количество генетического материала, в сухом и жидком виде, обеспечивающей стабильность ДНК в широком диапазоне температур и ее экстракцию без потерь, до настоящего времени предложено не было.

Раскрытие изобретения

В настоящем изобретении предложены:

(1) Композиция для сбора и хранения ДНК или ДНК-содержащих биологических следов, содержащая буферный раствор, включающий 1-40 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,05-1% об. Твин 20, 1-200 мМ K₂SO₄, 0,01-0,5 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), 1-20% глицерин, 0,01-0,4% NaN₃ (азид натрия), вода - остальное.

(2) Композиция (1), где буферный раствор представляет собой смесь растворов 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Твина 20, 87,1 мг K₂SO₄, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.

(3) Композиция (1), где ДНК-содержащий след представляет собой биообразец.

(4) Композиция (1), где соотношение буфера к биообразцу составляет 10:1.

(5) Композиция (1), где биообразец представляет собой потожировое вещество, следы крови, слюны, влагалищного секрета, спермы, суспензии клеток, смешанные биологические следы, препараты ДНК.

(6) Композиция для сбора и хранения ДНК или ДНК-содержащих биологических следов, содержащая буферный раствор, включающий 1-40 мΜ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,05-1% об. Тритон Х-100, 1-200 мМ K₂SO₄, 0,01-0,5 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), 1-20% глицерин, 0,01-0,4% NaN₃ (азид натрия), вода - остальное.

(7) Композиция (6), где буферный раствор представляет собой смесь растворов 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Тритона Х-100, 87,1 мг K₂SO₄, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.

(8) Композиция (7), где ДНК-содержащий след представляет собой биообразец.

(9) Композиция (7), где соотношение буфера к биообразцу составляет 10:1.

(10) Композиция (7), где биообразец представляет собой потожировое вещество, следы крови, слюны, влагалищного секрета, спермы, суспензии клеток, смешанные биологические следы, препараты ДНК.

(11) Композиция для сбора и хранения ДНК или ДНК-содержащих биологических следов, содержащая буферный раствор, включающий 1-40 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,05-1% об. Твин 20, 1-200 мМ KCl, 0,01-0,5 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), 1-20% глицерин, 0,01-0,4% NaN₃ (азид натрия), вода - остальное.

(12) Композиция (11), где буферный раствор представляет собой смесь растворов 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Твина 20, 37,3 мг KCl, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.

(13) Композиция (12), где ДНК-содержащий след представляет собой биообразец.

(14) Композиция (12), где соотношение буфера к биообразцу составляет 10:1.

(15) Композиция (12), где биообразец представляет собой потожировое вещество, следы крови, слюны, влагалищного секрета, спермы, суспензии клеток, смешанные биологические следы, препараты ДНК.

(16) Композиция для сбора и хранения ДНК или ДНК-содержащих биологических следов, содержащая буферный раствор, включающий 1-40 мМ Трис (гидроксиметил) аминометана, 0,05-1% об. Тритон Х-100, 1-200 мМ KCl, 0,01-0,5 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), 1-20% глицерин, 0,01-0,4% NaN₃ (азид натрия), вода - остальное.

(17) Композиция (16), где буферный раствор представляет собой смесь растворов 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Тритона Х-100, 37,3 мг KCl, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.

(18) Композиция (17), где ДНК-содержащий след представляет собой биообразец.

(19) Композиция (17), где соотношение буфера к биообразцу составляет 10:1.

(20) Композиция (17), где биообразец представляет собой потожировое вещество, следы крови, слюны, влагалищного секрета, спермы, суспензии клеток, смешанные биологические следы, препараты ДНК.

(21) Применение композиций (1)-(20) для пропитки гигроскопичных материалов-носителей и осуществления смывов ДНК-содержащих биологических следов, наложений или ДНК с целью их изъятия, хранения и/или транспортировки.

(22) Применение (21), где гигроскопичный материал-носитель представляет собой хлопчатобумажную ткань, волокнистые вещества (например, ватный тампон), бумажный носитель (например, хроматографическая бумага).

(23) Применение (21), где ДНК-содержащий биологический след, наложение или ДНК представляют собой сухой биообразец.

(24) Применение (21), где ДНК-содержащий биологический след, наложение или ДНК находятся в жидком виде.

I. Объекты настоящего изобретения представляют собой жидкие буферные композиции для пропитки пористых гигроскопичных носителей, например марлевых салфеток, ватных тампонов, бумаги, с целью осуществления сбора, транспортировки и хранения следов ДНК-содержащего биологического материала путем их смывов, либо нанесения на носители, пропитанные данными буферными растворами, обеспечивающими стабильность ДНК биообразцов в широком диапазоне температур в течение длительных периодов времени в сухом виде.

Знак «%», как используется в настоящем изобретении, означает процентное содержание по массе указанного компонента в указанной композиции, буфере.

В настоящем изобретении используются термины «биологические следы и наложения», «ДНК-содержащие следы», которые означают любые выделения человеческого организма, содержащие генетический материал, оставленные их хозяином на различных поверхностях объектов окружающей среды в виде наложений и пропитываний.

Одним из постоянных составляющих буферных композиций является 0,01-0,4% NaN₃ (азид натрия), оказывающий выраженный антимикробный и антимикотический эффект без ингибирования ПЦР.

Также постоянным составляющим композиций является 0,01-0,5 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат). В животных тканях в больших количествах присутствуют ионы Fe²⁺ и Fe³⁺ в составе гемоглобина и высвобождающиеся при его денатурации. Константа связывания ЭДТА с ионами железа составляет ≈10^-4 M^-1 Fe²⁺) и ≈10^-24 М^-1 (Fe³⁺) (Sillen, L.G., Martell, А.Е. Stability Constants of Metallon Complexes. The Chemical Society, London. - 1964.). Таким образом, благодаря наличию ЭДТА в составе буфера устраняется ингибиторный эффект ионов железа, оказываемый на ПЦР. При этом, малые концентрации ЭДТА в буфере не способны оказывать ингибирующий эффект на ПЦР, тем самым, не препятствуя проведению «прямой» ПЦР.

Слабощелочная среда наиболее оптимальна для хранения препаратов ДНК. Поэтому для создания буферной емкости, поддержания слабощелочного значения рН и стабилизации молекул ДНК используется раствор Трис (1-40 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан).

С целью стабилизации ДНК-Taq-полимеразы в состав композиций входят такие активаторы, как Твин 20 (0,05-1% об.), Тритон Х-100 (0,05-1% об.).

Стабилизация фермента ДНК-Taq-полимеразы за счет увеличения времени полужизни фермента при высоких температурах (от +90°C до +97,5°C) на этапе денатурации ДНК-матрицы при проведении ПЦР осуществляется за счет использования активаторов энзиматической амплификации: K₂SO₄ (1-200 мМ), KCl (1-200 мМ), глицерина (1-20%), что позволяет существенно повысить эффективность реакции.

Настоящее изобретение представляет собой комбинации вышеперечисленных компонентов в буфере:

1. Буферная жидкая композиция (1) представляет собой смесь растворов (1-40 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, предпочтительно 10 мМ, 0,05-1% об. Твин 20, предпочтительно 0,5% об., 1-200 мМ K₂SO₄, предпочтительно 50 мМ, 0,01-0,5 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), предпочтительно 0,1 мМ, 1-20% глицерин, предпочтительно 5%, 0,01-0,4% NaN₃ (азид натрия), предпочтительно 0,1%). Например, смесь 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Твина 20, 87,1 мг K₂SO₄, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.

2. Буферная жидкая композиция (2) представляет собой смесь растворов (1-40 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, предпочтительно 10 мМ, 0,05-1% об. Тритон Х-100, предпочтительно 0,5% об., 1-200 мМ K₂SO₄, предпочтительно 50 мМ, 0,01-0,5 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), предпочтительно 0,1 мМ, 1-20% глицерин, предпочтительно 5%, 0,01-0,4% NaN₃ (азид натрия), предпочтительно 0,1%). Например, смесь 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Тритона Х-100, 87,1 мг K₂SO₄, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.

3. Буферная жидкая композиция (3) представляет собой смесь растворов (1-40 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, предпочтительно 10 мМ, 0,05-1% об. Твин 20, предпочтительно 0,5% об., 1-200 мМ KCl, предпочтительно 50 мМ, 0,01-0,5 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), предпочтительно 0,1 мМ, 1-20% глицерин, предпочтительно 5%, 0,01-0,4% NaN₃ (азид натрия), предпочтительно 0,1%). Например, смесь 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Твина 20, 37,3 мг KCl, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.

4. Буферная жидкая композиция (4) представляет собой смесь растворов (1-40 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, предпочтительно 10 мМ, 0,05-1% об. Тритон Х-100, предпочтительно 0,5% об., 1-200 мМ KCl, предпочтительно 50 мМ, 0,01-0,5 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), предпочтительно 0,1 мМ, 1-20% глицерин, предпочтительно 5%, 0,01-0,4% NaN₃ (азид натрия), предпочтительно 0,1%). Например, смесь 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Тритона Х-100, 37,3 мг KCl, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.

Рабочую поверхность гигроскопичного предмета-носителя (марлевая салфетка, ватный тампон и т.д.) полностью пропитывают в одной из четырех вышеуказанных буферных жидких композициях в соотношении 20-150 мкл раствора на 1 см² (в зависимости от емкости пористого носителя) материала предмета-носителя непосредственно перед осуществлением смыва сухих либо после полного высушивания для смыва жидких следов ДНК-содержащего биологического материала (потожировое вещество, следы крови, слюны, влагалищного секрета, спермы, суспензия клеток, смешанные биологические следы, препараты ДНК), после чего подвергают высушиванию при комнатной температуре.

При использовании бумаги, например, хроматографической, в качестве предмета-носителя проводится ее пропитка путем однократного нанесения на нее одной из четырех вышеуказанных буферных жидких композиций в количестве 20-150 мкл на 1 см², после чего бумага подвергается высушиванию при комнатной температуре. На предмет-носитель наносится биологический образец в жидком виде (фильтрат выполненного смыва, суспензия клеток, препарат ДНК и т.д.) в количестве 20-1000 мкл в пересчете на площадь от 1 см² до 10 см² при толщине бумажного носителя от 0,15 до 1,0 мм, после чего бумага также подвергается высушиванию при комнатной температуре.

Таким образом, настоящее изобретение относится к композициям, сохраняющим стабильной ДНК следов биологических образцов, отобранных путем смыва, либо нанесения на гигроскопичный предмет-носитель, обеспечивая наиболее длительное хранение ДНК в широком температурном диапазоне.

II. Еще одним объектом настоящего изобретения является способ хранения препаратов ДНК в стабильной форме в жидкой композиции для хранения, включающий в себя:

(i) добавление буферной жидкой композиции по настоящему изобретению в качестве разбавителя на заключительном этапе выделения ДНК;

(ii) смешивание очищенного образца ДНК и буферного раствора по настоящему изобретению в соотношении 1:10; и

(iii) хранение препарата ДНК.

Объекты настоящего изобретения представляет собой жидкие буферные композиции для хранения препаратов ДНК в жидком виде в широком диапазоне температур (от -70°C до +40°C).

Настоящее изобретение представляет собой комбинации вышеперечисленных компонентов в буфере:

1. Буферная жидкая композиция (1) представляет собой смесь растворов (1-40 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, предпочтительно 10 мМ, 0,05-1% об. Твин 20, предпочтительно 0,5% об., 1-200 мМ K₂SO₄, предпочтительно 50 мМ, 0,01-0,5 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), предпочтительно 0,1 мМ, 1-20% глицерин, предпочтительно 5%, 0,01-0,4% NaN₃ (азид натрия), предпочтительно 0,1%): 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Твина 20, 87,1 мг K₂SO₄, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.

2. Буферная жидкая композиция (2) представляет собой смесь растворов (1-40 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, предпочтительно 10 мМ, 0,05-1% об. Тритон Х-100, предпочтительно 0,5% об., 1-200 мМ K₂SO₄, предпочтительно 50 мМ, 0,01-0,5 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), предпочтительно 0,1 мМ, 1-20% глицерин, предпочтительно 5%, 0,01-0,4% NaN₃ (азид натрия), предпочтительно 0,1%): 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Тритона Х-100, 87,1 мг K₂SO₄, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.

3. Буферная жидкая композиция (3) представляет собой смесь растворов (1-40 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, предпочтительно 10 мМ, 0,05-1% об. Твин 20, предпочтительно 0,5% об., 1-200 мМ KCl, предпочтительно 50 мМ, 0,01-0,5 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), предпочтительно 0,1 мМ, 1-20% глицерин, предпочтительно 5%, 0,01-0,4% NaN₃ (азид натрия), предпочтительно 0,1%): 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Твина 20, 37,3 мг KCl, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.

4. Буферная жидкая композиция (4) представляет собой смесь растворов (1-40 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, предпочтительно 10 мМ, 0,05-1% об. Тритон Х-100, предпочтительно 0,5% об., 1-200 мМ KCl, предпочтительно 50 мМ, 0,01-0,5 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), предпочтительно 0,1 мМ, 1-20% глицерин, предпочтительно 5%, 0,01-0,4% NaN₃ (азид натрия), предпочтительно 0,1%): 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Тритона Х-100, 37,3 мг KCl, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.

Таким образом, настоящее изобретение относится к жидкой композиции, сохраняющей стабильной ДНК, содержащей ДНК и один из четырех вышеперечисленных буферных растворов в соотношении 1:10, обеспечивая наиболее длительное хранение препаратов ДНК в широком температурном диапазоне.

Дополнительные объекты и преимущества изобретения указаны в следующем далее разделе описания и частично становятся очевидными из описания или могут быть изучены при применении изобретения. Объекты и преимущества изобретения понимают и реализуют при помощи подробно перечисленных в прилагаемой формуле изобретения элементов и сочетаний.

Следует понимать, что в рамках заявленного изложенное выше общее описание и следующее далее подробное описание являются лишь иллюстративными и поясняющими и не ограничивают объем изобретения. Дополняющие включенные и составляющие часть данного описания фигуры иллюстрируют некоторые варианты преимущества изобретения и вместе с описанием помогают объяснить принципы изобретения.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 показаны результаты электрофореза в 1% геле агарозы препаратов ДНК, выделенных при помощи наборов реагентов PrepFiler™ User Guide (Applied Biosystems, США) (проба 1), «DNA IQ™» (Promega, США) (проба 2), жидких буферных композиций 1 (проба 3), 2 (проба 4) и контрольные образцы (пробы 5, 6) в трех параллелях ((1), (2) и (3)).

На Фиг. 2 показаны графики накопления продуктов ПЦР, отражающие отсутствие ингибирующего влияния на реакцию амплификации бумаги для хроматографии FN100, пропитанной жидкой буферной композицией 1 (1) или деионизованной водой (2), а также хлопчатобумажной ткани (3) и (4).

На Фиг. 3 ((1), (2)) показаны результаты электрофореза в 2% геле агарозы ПЦР-продуктов в присутствии бумаги для хроматографии FN100, пропитанной жидкой буферной композицией 1 или деионизованной водой, и хлопчатобумажной ткани.

На Фиг. 4 показаны графики ПЦР препаратов ДНК смывов, выполненных с помощью жидких буферных композиций 1 ((1), (2)) или 3 ((3), (4)), либо деионизованной воды ((5), (6)), которые хранили при комнатной температуре 7 ((1), (3), (5)) и 30 ((2), (4), (6)).

На Фиг. 5 показаны результаты электрофореза в 2% геле агарозы ПЦР-продуктов - препаратов ДНК, полученных из смывов, выполненных с помощью жидких буферных композиций 1 или 3, либо деионизованной воды, которые хранили при комнатной температуре 0 суток (контроль) (1), 5 суток (2) и 7 суток (3).

На Фиг. 6 показаны графики накопления продуктов ПЦР образцов слюны, где растворителем являлись деионизованная вода, физиологический раствор, буфер TE или жидкая буферная композиция 3 (буфер 3), при инкубации +22°C (1) и +70°C (2) в течение 30 минут, а также образцов слюны, где растворителем являлись лизирующие растворы из наборов реагентов DNA IQ™ System, PrepFiler™ User Guide, Prep-n-Go, «А», при инкубации +22°C (3) и +70°C (4) в течение 30 минут.

На Фиг. 7 показаны графики накопления продуктов ПЦР внутреннего положительного контроля (канал Су5) в присутствии деионизованной воды, физиологического раствора, буфера ТЕ, жидкой буферной композиции 3 (буфера 3) (1), а также лизирующих растворов из наборов реагентов DNA IQ™ System, PrepFiler™ User Guide, Prep-n-Go, «А», ингибирующих ПЦР (2).

На Фиг. 8 показаны графики накопления продуктов ПЦР препаратов ДНК из смывов потожирового вещества, выполненных с поверхности гладкого металлического предмета, при помощи жидкой буферной композиции 3 (1), физиологического раствора (2), буфера TE (3) или деионизованной воды (4).

Осуществление изобретения

Пример 1.

Для сравнительного исследования методов выделения ДНК из биологических следов проводили оценку потерь ДНК известной концентрации в процессе ее экстракции при помощи наборов реагентов PrepFiler™ User Guide (Applied Biosystems, США), «DNA IQ™» (Promega, США) и жидких буферных композиций 1, 2 (буферов 1, 2), предлагаемых в настоящем изобретении. Исследования по каждому из методов проводили в семи параллелях.

В качестве генетического материала использовали контрольную ДНК человека из тест-набора «XY-Детект» (ООО «Синтол») в конечной концентрации 0,1 нг/мкл.

1. Выделение ДНК при помощи набора реагентов PrepFiler™ User Guide (Applied Biosystems, США) проводили согласно базовому протоколу для выделения геномной ДНК.

Помещали по 10 мкл препаратов ДНК с концентрацией 0,5 нг/мкл в стандартные 1,5 мл микроцентрифужные пробирки. Добавляли по 300 мкл PrepFiler™ Lysis buffer и по 3 мкл 1,0 Μ DTT. Перемешивали на вортексе при низких оборотах 5 секунд, затем кратко центрифугировали. Инкубировали образцы в термошейкере при +70°C и 900 об/мин в течение 40 минут. Центрифугировали микроцентрифужные пробирки при 12000 g в течение 2 минут. Переносили лизат в чистые 1,5 мл пробирки. Добавляли в пробирки, содержащие лизат, по 15 мкл магнитных частиц. Перемешивали на вортексе при низких оборотах 5 секунд, затем кратко центрифугировали. Добавляли по 180 мкл изопропанола (Binding buffer). Перемешивали на вортексе при низких оборотах 5 секунд, затем кратко центрифугировали. Помещали пробирки в шейкер и перемешивали 10 минут при 1000 об/мин в условиях комнатной температуры. Перемешивали образцы на вортексе. Ставили пробирки в магнитный штатив и держали до тех пор, пока осадок не прекратит накапливаться (2 минуты). Держа пробирки в магнитном штативе, отбирали и удаляли надосадок. Добавляли по 300 мкл PrepFiler™ Wash buffer в пробирки. Перемешивали на вортексе при максимальной скорости так, чтобы на стенках пробирок не было видно магнитных частиц, затем кратко центрифугировали. Помещали пробирки в магнитный штатив на 30-60 секунд. Держа пробирки в магнитном штативе, отбирали и удаляли надосадок. Данный этап промывки повторяли три раза. Держа пробирки в магнитном штативе, сушили магнитные частицы 7 минут на столе. Добавляли по 50 мкл PrepFiler™ Elution Buffer в пробирки. Перемешивали на вортексе при максимальной скорости 5 секунд так, чтобы на стенках пробирок не было видно магнитных частиц, затем кратко центрифугировали. Инкубировали пробирки в термошейкере и при +70°C и 900 об/мин в течение 5 минут. Перемешивали на вортексе при максимальной скорости так, чтобы на стенках пробирок не было видно магнитных частиц, затем кратко центрифугировали. Ставили пробирки в магнитный штатив и держали до тех пор, пока осадок не прекратит накапливаться (как минимум 1 минута). Переносили надосадок (который должен содержать геномную ДНК) в новые 1,5 мл пробирки для хранения.

2. Выделение ДНК при помощи набора реагентов «DNA IQ™» (Promega, США) проводили согласно базовому протоколу для выделения геномной ДНК.

Помещали по 10 мкл препаратов ДНК с концентрацией 0,5 нг/мкл в стандартные 1,5 мл микроцентрифужные пробирки. Добавляли по 250 мкл Promega™ Lysis buffer и по 2,5 мкл 1,0 Μ ДТТ. Перемешивали на вортексе при низких оборотах 5 секунд, затем кратко центрифугировали. Инкубировали образцы в термошейкере при +70°C и 900 об/мин. в течение 30 минут. Центрифугировали микроцентрифужные пробирки при комнатной температуре при 10000 g в течение 2 минут. Переносили лизат в чистые 1,5 мл пробирки. Предварительно перемешав, добавляли по 7,0 мкл DNA IQ™ Resin смолы (суспензии магнитных частиц) к растворам, содержащим ДНК. Смесь образца в лизирующем буфере с магнитными частицами встряхивали на вортексе в течение 3 секунд. Инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут, перемешивая на вортексе каждые 30 секунд. Устанавливали пробирки в магнитный штатив. Автоматической пипеткой тщательно отбирали и удаляли раствор, стараясь не нарушить осадка магнитных частиц на стенках пробирок. Добавляли к осадку по 100 мкл Promega™ Lysis buffer. Пробирки встряхивали на вортексе в течение 2 секунд. Устанавливали пробирки в магнитный штатив и полностью удаляли Promega™ Lysis buffer. Добавляли в пробирки по 100 мкл 1Х-отмывающего буфера (Promega™ Wash Buffer). Пробирки встряхивали на вортексе в течение 2 секунд. Устанавливали пробирки в магнитный штатив и удаляли отмывающий буфер. Промывку отмывающим буфером повторяли еще 2 раза. Устанавливали пробирки в магнитный штатив с открытой крышкой. Сушили осадок магнитных частиц при комнатной температуре в течение 5 минут. Добавляли по 50 мкл элюционного буфера (Promega™ Elution Buffer). Встряхивали на вортексе в течение 2 секунд. Инкубировали пробирки в микротермостате +65°C в течение 5 минут при постоянном перемешивании 900 об/мин. После инкубации образцы перемешивали при максимальной скорости в течение 2 секунд. Ставили пробирки в магнитный штатив и держали до тех пор, пока осадок не прекратит накапливаться (как минимум 1 минута). Переносили надосадок (который должен содержать геномную ДНК) в новые 1,5 мл пробирки для хранения.

3. Выделение ДНК с использованием жидких буферных композиций 1, 2 (буферов 1, 2), предлагаемых в настоящем изобретении.

Состав жидкой буферной композиции 1 (10 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,5% об. Твин 20, 50 мМ K₂SO₄, 0,1 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), 5% глицерин, 0,1% NaN₃ (азид натрия)): смесь растворов 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Твина 20, 87,1 мг K₂SO₄, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенная до 10 мл стерильной деионизованной водой.

Состав жидкой буферной композиции 2 (10 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,5% об. Тритон Х-100, 50 мМ K₂SO₄, 0,1 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), 5% глицерин, 0,1% NaN₃ (азид натрия)): смесь растворов 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Тритона Х-100, 87,1 мг K₂SO₄, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенная до 10 мл стерильной деионизованной водой.

Помещали по 10 мкл препаратов ДНК с концентрацией 0,5 нг/мкл в стандартные 1,5 мл микроцентрифужные пробирки. Добавляли по 40 мкл жидкой буферной композиции 1 или 2 (буфера 1 или 2). Перемешивали на вортексе при низких оборотах 5 секунд, затем кратко центрифугировали. Инкубировали образцы в термошейкере при +70°C и 900 об/мин в течение 30 минут. Центрифугировали микроцентрифужные пробирки при 10000 g в течение 30 секунд.

Готовили контрольные образцы, не подвергавшиеся инкубации. Для этого помещали по 10 мкл препаратов контрольной ДНК человека из тест-набора «ΧΥ-Детект» (ООО «Синтол») с концентрацией 0,5 нг/мкл в стандартные 1,5 мл микроцентрифужные пробирки и добавляли по 40 мкл деионизованной воды. Перемешивали на вортексе при низких оборотах 5 секунд, затем кратко центрифугировали.

I. Проводили оценку количества ДНК в препаратах после проведенных выделений ее при помощи ПЦР «в реальном времени» (ПЦР-РВ) в соответствии с инструкцией производителя. С этой целью использовали термоциклер с мультиканальным детектором для оценки ПЦР-продуктов в режиме реального времени iQ5 (США) Bio-Rad.

Регистрацию накопления ампликонов и построение калибровочных кривых проводили по технологии выполнения ПЦР-РВ, основанной на гибридизационно-флуоресцентной детекции с использованием специфических зондов с флуоресцентными метками (формат TaqMan). Использовали наборы реактивов для определения количества фрагментов ДНК гена β-актина, фрагментов гена амелогенина, локализованного на X (р22.1-22.3) и Υ (р11.2) хромосомах человека «XY-Детект» (ООО «Синтол»). Для оценки эффективности (Е) ПЦР строили калибровочную кривую для проб, содержащих следующие концентрации ДНК: 5 нг/мкл, 1 нг/мкл, 0,2 нг/мкл, 0,04 нг/мкл и 0,008 нг/мкл. Для амплификации гена β-актина рассчитанная эффективность ПЦР составила Е=0,971.

В табл. 1 представлены объемы компонентов, используемые при приготовлении реакционной смеси в расчете на одну пробирку.

Перед проведением ПЦР в пробирки добавляли по 20 мкл готовой реакционной смеси и по 5 мкл препаратов ДНК. В качестве контроля в ПЦР-пробирки с реакционной смесью помещали по 5 мкл стандартных препаратов ДНК с известной концентрацией: 5 нг/мкл, 1 нг/мкл, 0,2 нг/мкл, 0,04 нг/мкл и 0,008 нг/мкл.

Проводили амплификацию в следующем режиме:

Анализ данных ПЦР-РВ проводили с помощью программы «iQ5 Optical System Software» (версия 2.0, 2006).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы STADIA (Кулайчев А.П. Методы и средства анализа данных в среде Windows. Stadia 6.0. - Μ.: Информатика и компьютеры. - 1996. -257 с.).

Результаты сравнительного исследования концентрации ДНК, выделенной при помощи наборов реагентов PrepFiler™ User Guide, «DNA IQ™» и жидких буферных композиций 1, 2, представлены в табл. 2.

При исследовании концентрации стандартной ДНК, подвергшейся методам экстракции с помощью наборов реагентов PrepFiler™ User Guide (Applied Biosystems, США), «DNA IQ™» (Promega, США) и жидких буферных композиций 1, 2 (буферов 1, 2), предлагаемых в настоящем изобретении, установлено, что использование всех исследованных методов позволяет получить ДНК в достаточном количестве. Отмечается меньшее количество активной ДНК-матрицы, экстрагированной при помощи предлагаемых жидких буферных композиций 1, 2 (буферов 1, 2), по сравнению с результатами, полученными при использовании стандартных протоколов выделения ДНК наборов реагентов PrepFiler™ User Guide (Applied Biosystems, США), «DNA IQ™» (Promega, США). Это может быть обусловлено следующими причинами: либо скорость деградации ДНК в предлагаемых жидких буферных композициях 1, 2 (буферах 1, 2) выше, чем в ходе ее экстракции с помощью наборов реагентов PrepFiler™ User Guide (Applied Biosystems, США), «DNA IQ™» (Promega, США), либо, наоборот, заявленные в настоящем изобретении жидкие буферные композиции 1, 2 (буферы 1, 2) стабилизируют высокомолекулярную фракцию ДНК, что затрудняет доступ фермента Taq ДНК-полимеразы к исследуемому локусу β-актина, тем самым создавая иллюзию уменьшения концентрации ДНК. Для проверки этих гипотез были проведены электрофоретические исследования полученных препаратов ДНК.

II. Проводили качественную и количественную сравнительную оценку препаратов ДНК, выделенных при помощи наборов реагентов PrepFiler™ User Guide (Applied Biosystems, США), «DNA IQ™» (Promega, США), жидких буферных композиций 1, 2 (буферов 1, 2) и контрольных образцов, при помощи электрофореза в 1% геле агарозы.

Дополнительно готовили контрольные образцы, которые подвергали инкубации при +70°C в течение 30 минут. Для этого помещали по 10 мкл препаратов контрольной ДНК человека из тест-набора «XY-Детект» (ООО «Синтол») с концентрацией 0,5 нг/мкл в стандартные 1,5 мл микроцентрифужные пробирки и добавляли по 40 мкл деионизованной воды. Перемешивали на вортексе при низких оборотах 5 секунд, затем кратко центрифугировали и инкубировали при +70°C в течение 30 минут.

Готовили однократный TBE-буфер в объеме, достаточном для заполнения камеры электрофореза и приготовления геля. Добавляли к однократному TBE-буферу порошок агарозы в количестве, необходимом для получения 1% раствора и нагревали в микроволновой печи до полного ее расплавления. Полученный жидкий раствор охлаждали до +50-60°C, добавляли бромистый этидий до конечной концентрации 0,5 мкг/мл и осторожно перемешивали, избегая появления в геле пузырьков воздуха. Теплую агарозу выливали в соответствующую форму и следили за тем, чтобы она равномерно распределилась по форме. Вертикально вставляли гребенку так, чтобы ее зубцы не доставали до дна примерно 1 мм. Оставляли кювету с агарозным гелем на 30 минут, затем осторожно удаляли гребенку. Кювету с гелем помещали в электрофорезную камеру, содержащую необходимое количество однократного TBE-буфера. Подготавливали к электрофорезу исследуемые образцы, смешивая их с шестикратным буфером для нанесения (5:1, о/о), содержащим бромфеноловый синий и ксиленцианол в 30% растворе глицерина. Аккуратно вносили образцы в соответствующие лунки геля. В лунки, обозначенные как «М», вносили маркер молекулярных масс ДНК фага λ, обработанную рестриктазой HindIII. Электрофорез проводили при постоянной напряженности электрического поля (6,5 В/см) в течение 40 минут (до тех пор, пока бромфеноловый синий не дойдет до конца геля). Помещали гель в УФ-трансиллюминатор и фотографировали. Сравнивали интенсивность свечения опытных препаратов ДНК с интенсивностью свечения проб с контрольными образцами, определяется количество ДНК в исследуемой пробе (Корниенко И.В., Харламов С.Г. Методы исследования ДНК человека. Выделение ДНК и ее количественная оценка в аспекте судебно-медицинского исследования вещественных доказательств биологического происхождения: Учебно-методическое пособие. Ростов н/Д: ЮФУ. - 2012. - 216 с.).

Результаты электрофореза препаратов ДНК, выделенных при помощи наборов реагентов PrepFiler™ User Guide (Applied Biosystems, США), «DNA IQ™» (Promega, США) и жидких буферных композиций 1, 2 (буферов 1, 2) в 1% геле агарозы в трех параллелях представлены на Фиг. 1.

Μ - маркер молекулярных масс Lambda DNA/HindIII Markers;

1 - препарат ДНК, выделенный при помощи набора реагентов PrepFiler™ User Guide;

2 - препарат ДНК, выделенный при помощи набора реагентов «DNA IQ™»;

3 - препарат ДНК, выделенный при помощи жидкой буферной композиции 1 (буфера 1);

4 - препарат ДНК, выделенный при помощи жидкой буферной композиции 2 (буфера 2);

5 - контрольный препарат ДНК, не подвергавшийся инкубации.

6 - контрольный препарат ДНК, подвергавшийся инкубации при +70°C в течение 30 минут.

Отмечается заметное снижение концентрации ядерной ДНК в препаратах, выделенных при помощи наборов реагентов PrepFiler™ User Guide (Applied Biosystems, США) и «DNA IQ™» (Promega, США) по сравнению с контрольным образцом ДНК, не подвергшимся процессу экстракции ДНК. В данных образцах (1 и 2 на Фиг. 1) отмечается выраженная деградация и значительная потеря высокомолекулярной ДНК, что представлено в виде «шмера» низкомолекулярной ДНК. Выделение ДНК при помощи жидких буферных композиций 1, 2 (буферов 1, 2) (образцы 3 и 4 на Фиг. 1) не сопровождается потерей высокомолекулярной ДНК: в районе, между полосами 21226 и 5148 отчетливо видна фракция митохондриальной ДНК (мтДНК) размером 16569 нуклеотидных пар. Благодаря компонентам, входящим в состав жидких буферных композиций 1, 2, происходит стабилизация молекул ДНК и обеспечивается ее защита от деградации: в лунках геля отчетливо видны полосы высокомолекулярной ядерной ДНК, в то время как в контрольном препарате, инкубировавшемся в при +70°C в течение 30 минут, ДНК не визуализируется либо визуализируется слабо. Таким образом установлено, что заявленные в настоящем изобретении жидкие буферные композиции 1, 2 (буферы 1, 2) способствуют стабилизации ДНК.

III. Для оценки качества методов выделения ДНК при помощи наборов реагентов PrepFiler™ User Guide (Applied Biosystems, США), «DNA IQ™» (Promega, США) и метода с использованием жидких буферных композиций 1, 2 (буферов 1, 2), предлагаемых в настоящем изобретении, проводили генотипирование локусов ДНК по STR-локусам панели COrDIS Plus (D3S1358, THO1, D12S391, D1S1656, D10S1248, D22S1045, D2S441, D7S820, D13S317, FGA, ТРОХ, D18S51, D16S539, D8S1179, CSF1PO, D5S818, vWA, D21S11, SE33 и локусу Amelogenin, определяющему половую принадлежность) набора реагентов COrDIS Plus для ДНК-идентификации 19 маркеров и локуса амелогенина человека в соответствии с руководством фирмы производителя (COrDIS Plus. Набор реагентов для мультиплексного анализа 19 STR-маркеров и локуса амелогенина человека. Инструкция пользователя. - 2014. - 19 с.) ООО «ГОРДИЗ» (регистрационное удостоверение №ФСР 2012/13548).

Для постановки энзиматической амплификации в ПЦР-пробирки из набора, содержащие лиофилизированные компоненты ПЦР (Taq-полимеразу, смесь дНТФ, реакционный буфер, праймерную смесь), помещали по 10 мкл деионизованной воды, затем добавляли по 5 мкл раствора активатора, содержащего буферный раствор и ионы магния Mg²⁺. Затем вносили по 10 мкл исследуемых препаратов ДНК. Смесь перемешивали и кратко центрифугировали. Для оценки специфичности реакции амплификации использовали положительный (проба с контрольной ДНК MK1 из набора реагентов «COrDIS Plus») и отрицательный (проба с деионизованной водой вместо препарата ДНК) контроли.

При проведении амплификации скорость нагрева составляла 0,3°C/сек на этапе повышения с температуры с 59°C до 72°C.

Использовали следующие параметры ПЦР:

94°C 3 мин 98°C 30 сек 59°C* 120 сек, 4 цикла 72°C 90 сек 94°C 30 сек 59°C* 120 сек, 6 циклов 72°C 90 сек 90°C 30 сек 59°C 120 сек, 20 циклов 72°C* 75 сек 68°C 10 мин 15°C ∞

* Скорость нагрева с 59°C до 72°C - не более 0,3°C/1 сек.

Амплификацию осуществляли с помощью термоциклера «GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) с алюминиевым блоком в режиме эмуляции GeneAmp 9600.

Идентификацию аллелей проводили по размерному стандарту S450 и относительно аллельного леддера, прилагаемого к тест-системе «COrDIS Plus».

Для загрузки образцов в прибор готовили смесь Hi-Di™ формамида и размерного стандарта S450 в следующем соотношении: 10 мкл Hi-Di™ формамида и 1 мкл размерного стандарта S450 в расчете на один образец.

Идентификацию продуктов амплификации по STR-локусам панели «COrDIS Plus» проводили с помощью автоматического секвенатора ABI PRISM 3130xl в соответствии с руководством по использованию (COrDIS Plus. Набор реагентов для мультиплексного анализа 19 STR-маркеров и локуса амелогенина человека. Инструкция пользователя. - 2014. - 19 с. и Руководство по использованию генетического анализатора 3130/3130xl. - Applied Biosystems).

В процессе электрофореза информация о сканировании геля лазером и детекции флуоресценции автоматически передавалась на управляющий компьютер и обрабатывалась программой Run 3130 Data Collection v.3.0.

Обработка результатов и идентификация аллелей проходила автоматически с помощью программы GeneMapper^® ID 3.2.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы STADIA (Кулайчев А.П. Методы и средства анализа данных в среде Windows. Stadia 6.0. - Μ.: Информатика и компьютеры. - 1996. - 257 с.).

Результаты генотипирования опытных и контрольных образцов представлены в табл. 3.

Примечания: «+» - обозначает наличие всех аллельных состояний в исследуемых локусах; «+/-» - обозначает выпадение одного из пары аллелей (так называемый эффект «ложной гомозиготы») в исследуемых локусах; «-» -обозначает отсутствие продукта амплификации (выпадение всех аллелей) в исследуемых локусах.

При генотипировании препаратов ДНК, выделенных при помощи набора реагентов PrepFiler™ User Guide (Applied Biosystems, США), удается получить полный генетический профиль по всем исследованным локусам системы COrDIS Plus (100% случаев), а при использовании набора реагентов «DNA IQ™» (Promega, США) - лишь в 61,7%. При генотипировании препаратов ДНК, выделенных при помощи предлагаемых жидких буферных композиций 1, 2 (буферов 1, 2), удается получить полный генетический профиль по 18 исследованным локусам системы COrDIS Plus и локусу амелогенина человека, за исключением локуса D22S1045.

Пример 2.

Проводили количественную оценку извлеченной эффективной ДНК-матрицы при хранении на бумаге для хроматографии FN100, пропитанной в деионизованной воде или жидкой буферной композиции 1 (буфере 1), предлагаемой в настоящем изобретении, а также сравнительное исследование ингибирующего влияния на ПЦР материалов-носителей (хроматографической бумаги и хлопчатобумажной ткани).

Состав жидкой буферной композиции 1 (10 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,5% об. Твин 20, 50 мМ K₂SO₄, 0,1 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), 5% глицерин, 0,1% NaN₃ (азид натрия)): смесь растворов 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Твина 20, 87,1 мг K₂SO₄, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенная до 10 мл стерильной деионизованной водой.

В качестве пористых предметов-носителей использовали бумагу для хроматографии FN100 (серия 527, удельный вес 195 г/м², толщина 0,35 мм, высота абсорбции 130 мм/30 мин) и хлопчатобумажную ткань (ткань с плотным плетением волокон и марлю).

В качестве генетического материала использовали контрольную ДНК человека из тест-набора «XY-Детект» (ООО «Синтол»).

Для проведения количественной оценки извлеченной эффективной ДНК-матрицы, хранящейся на предмете-носителе, пропитывали бумагу для хроматографии FN100 размером 0,5×0,5 см 25 мкл буфера 1 или деионизованной воды с добавлением контрольной ДНК в конечной концентрации 0,1 нг/мкл.

Для проведения сравнительного исследования ингибирующего влияния на ПЦР предметов-носителей пропитывали бумагу для хроматографии FN100 размером 0,5×0,5 см 25 мкл буфера 1 или деионизованной воды.

Сразу после пропитки каждый предмет-носитель переносили на стерильную интактную пластиковую поверхность и сушили в течение 24 часов при +22°C в закрытом ПЦР-боксе без доступа УФИ и контакта с посторонними объектами.

Потенциально ингибирующее влияние хлопчатобумажной ткани (ткани с плотным плетением волокон и марли) исследовали без пропитки в буфере 1 или деионизованной воде.

Вырезали из предметов-носителей при помощи стерильных ножниц и панчера (Harris Uni-Core) по два диска диаметром 1,2 мм, которые помещали в ПЦР-пробирки. Исследования каждого предмета-носителя проводили в шести параллелях.

I. Проводили оценку количества ДНК и ингибирующее влияние на ПЦР материалов-носителей при помощи ПЦР-РВ в соответствии с инструкцией производителя. С этой целью использовали термоциклер с мультиканальным детектором для оценки ПЦР-продуктов в режиме реального времени iQ5 (США) Bio-Rad.

Регистрацию накопления ампликонов и построение калибровочных кривых проводили по технологии выполнения ПЦР-РВ, основанной на гибридизационно-флуоресцентной детекции с использованием специфических зондов с флуоресцентными метками (формат TaqMan). Использовали наборы реактивов для определения количества фрагментов ДНК гена β-актина, фрагментов гена амелогенина, локализованного на X (р22.1-22.3) и Υ (р11.2) хромосомах человека «XY-Детект» (ООО «Синтол»). Для оценки эффективности (Е) ПЦР строили калибровочную кривую для проб, содержащих следующие концентрации ДНК: 5 нг/мкл, 1 нг/мкл, 0,2 нг/мкл, 0,04 нг/мкл и 0,008 нг/мкл. Для амплификации гена β-актина рассчитанная эффективность ПЦР составила Е=0,971.

В табл. 4 представлены объемы компонентов, используемые при приготовлении реакционной смеси в расчете на одну пробирку.

Перед проведением ПЦР в пробирки с фрагментами предмета-носителя добавляли по 22,5 мкл готовой реакционной смеси и по 2,5 мкл деионизованной воды (в пробы, где предмет-носитель пропитан буфером 1 или деионизованной водой, содержащими ДНК) или по 2,5 мкл контрольной ДНК человека из тест-набора «XY-Детект» (Синтол) в концентрациях 15 нг/мкл (в пробы, где предмет-носитель пропитан буфером 1 или деионизованной водой, не содержащими ДНК, либо не пропитан ничем (хлопчатобумажная ткань)). В качестве контроля в ПЦР-пробирки с реакционной смесью помещали по 2,5 мкл стандартных препаратов ДНК с известной концентрацией: 5 нг/мкл, 1 нг/мкл, 0,2 нг/мкл, 0,04 нг/мкл и 0,008 нг/мкл.

Проводили амплификацию в следующем режиме:

Анализ данных ПЦР-РВ проводили с помощью программы «iQ5 Optical System Software» (версия 2.0, 2006).

Результаты сравнительного исследования концентрации ДНК, извлеченной из предмета-носителя (бумаги для хроматографии FN100), пропитанного жидкой буферной композицией 1 (буфером 1) или деионизованной водой, представлены в табл. 5.

Результаты сравнительного исследования концентрации ДНК и ингибирующего влияния на ПЦР предметов-носителей представлены в табл. 6 и на Фиг. 2.

Примечание: C_t (Threshold Cycle) - пороговый цикл.

По результатам сравнительного исследования концентрации ДНК, извлеченной из предмета-носителя (бумаги для хроматографии FN100), установлено, что в более чем в 1,5 раза больше удается получить активной ДНК-матрицы из бумаги, пропитанной деионизованной водой, нежели буфером 1. Полученный результат можно объяснить небольшой степенью ингибирования фермента ДНК-Taq-полимеразы в присутствии буфера 1.

На Фиг. 2 на графиках накопления продуктов ПЦР, начиная с 25-26 циклов, виден подъем кривых всех опытных образцов ДНК в присутствии бумаги для хроматографии FN100, пропитанной жидкой буферной композицией 1 (буфером 1) или деионизованной водой, так и в присутствии хлопчатобумажной ткани (с плотным плетением волокон и марли). Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии существенного ингибирующего влияния на ПЦР как компонентов предлагаемой жидкой буферной композиции 1 (буфера 1), так и материалом потенциального предмета-носителя биологических образцов.

II. Проводили качественную и количественную сравнительную оценку продуктов ПЦР-РВ, при помощи электрофореза в 2% геле агарозы.

Готовили однократный TBE-буфер в объеме, достаточном для заполнения камеры электрофореза и приготовления геля. Добавляли к однократному TBE-буферу порошок агарозы в количестве, необходимом для получения 2% раствора и нагревали в микроволновой печи до полного ее расплавления. Полученный жидкий раствор охлаждали до +50-60°C, добавляли бромистый этидий до конечной концентрации 1,0 мкг/мл (при 0,8% было 0,5 мкг/мл) и осторожно перемешивали, избегая появления в геле пузырьков воздуха. Теплую агарозу выливали в соответствующую форму и следили за тем, чтобы она равномерно распределилась по форме. Вертикально вставляли гребенку так, чтобы ее зубцы не доставали до дна примерно 1 мм. Оставляли кювету с агарозным гелем на 30 минут, затем осторожно удаляли гребенку. Кювету с гелем помещали в электрофорезную камеру, содержащую необходимое количество однократного TBE-буфера. Подготавливали к электрофорезу исследуемые образцы, смешивая их с шестикратным буфером для нанесения (5:1, о/о), содержащим бромфеноловый синий и ксиленцианол в 30% растворе глицерина. Аккуратно вносили образцы в соответствующие лунки геля. В лунки, обозначенные как «М», вносили маркер молекулярных масс Bench Тор 100 bp DNA Ladder. Электрофорез проводили при постоянной напряженности электрического поля (6,5 В/см) в течение 40 минут (до тех пор, пока бромфеноловый синий не дойдет до конца геля). Помещали гель в УФ-трансиллюминатор и фотографировали. Сравнивали интенсивность свечения опытных препаратов ДНК с интенсивностью свечения проб с контрольными образцами, определяя количество ДНК в исследуемой пробе (Корниенко И.В., Харламов С.Г. Методы исследования ДНК человека. Выделение ДНК и ее количественная оценка в аспекте судебно-медицинского исследования вещественных доказательств биологического происхождения: Учебно-методическое пособие. Ростов н/Д: ЮФУ. - 2012. - 216 с.).

Результаты электрофореза ПЦР-продуктов, полученных при ПЦР-РВ, в 2% геле агарозы представлены на Фиг. 3 в двух параллелях (1) и (2).

Μ - маркер молекулярных масс Bench Тор 100 bp DNA Ladder;

1, 7 - Бумага для хроматографии FN100, пропитанная буфером 1 с добавлением ДНК;

2, 8 - Бумага для хроматографии FN100, пропитанная деионизованной водой с добавлением ДНК;

3, 9 - Бумага для хроматографии FN100, пропитанная буфером 1;

4, 10 - Бумага для хроматографии FN100, пропитанная деионизованной водой;

5, 11 - Хлопчатобумажная ткань (с плотным плетением волокон);

6, 12 - Хлопчатобумажная ткань (марля);

К1 - Контроль 1 нг/мкл;

К2 - Контроль 0,2 нг/мкл;

К3-Контроль 0,04 нг/мкл;

К4 - Контроль 0,008 нг/мкл.

На Фиг. 3 ((1), (2)) отчетливо визуализируются полоски ПЦР-продукта опытных образцов, соответствующие таковым в контрольных образцах, что свидетельствует о наличии качественного ПЦР-продукта в присутствии компонентов жидкой буферной композиции 1 (буфера 1) и потенциальных предметов-носителей (хроматографической бумаги, хлопчатобумажной ткани) биологического материала. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии ингибиторного действия, оказываемого на ПЦР, компонентами, входящими в состав буфера 1 и исследуемых материалов, что дает возможность их применения в качестве предметов-носителей биологического материала и их использования для проведения «прямой» ПЦР.

Пример 3.

Проводили сравнительное исследование деградации ДНК в смывах, выполненных на хлопчатобумажную ткань, пропитанную в деионизованной воде или жидких буферных композициях 1, 3 (буферах 1, 3), предлагаемых в настоящем изобретении.

Состав жидкой буферной композиции 1 (10 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,5% об. Твин 20, 50 мМ K₂SO₄, 0,1 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), 5% глицерин, 0,1% NaN₃ (азид натрия)): смесь растворов 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Твина 20, 87,1 мг K₂SO₄, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенная до 10 мл стерильной деионизованной водой.

Состав жидкой буферной композиции 3 (10 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,5% об. Твин 20, 50 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), 5% глицерин, 0,1% NaN₃ (азид натрия)): смесь растворов 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Твина 20, 37,3 мг KCl, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенная до 10 мл стерильной деионизованной водой.

В качестве генетического материала использовали контрольную ДНК человека из тест-набора «XY-Детект» (ООО «Синтол») в конечной концентрации 0,25 нг/мкл. Наносили по 20 мкл препаратов ДНК на стерильную интактную пластиковую поверхность и сушили в течение двух суток при +22°C в закрытом ПЦР-боксе без доступа УФИ. Проводили смывы при помощи стерильной хлопчатобумажной ткани размером 0,5×0,5 см, смоченной в 15 мкл деионизованной воды или жидких буферных композициях 1 и 3. Хранили выполненные смывы при +22°C в закрытом ПЦР-боксе без доступа УФИ. По истечении срока хранения на ткань наносили по 15 мкл деионизованной воды для растворения нанесенной и высушенной ДНК.

Были сформированы группы: контроль (0 суток, то есть смывы не подвергались хранению) и смывы, хранимые в течение 7 и 30 суток. Каждому сроку хранения соответствовали 15 параллелей в соответствующей среде. Помещали ткань с осуществленными смывами в пластиковые колонки с решетчатым дном для отжима предмета-носителя, которые вставляли в 1,5 мл пробирки типа Эппендорф. Центрифугировали пробирки при 13000-14000 g в течение 5 минут.

I. Проводили оценку количества ДНК в фильтрате при помощи ПЦР-РВ в соответствии с инструкцией производителя. С этой целью использовали термоциклер с мультиканальным детектором для оценки ПЦР-продуктов в режиме реального времени iQ5 (США) Bio-Rad.

Регистрацию накопления ампликонов и построение калибровочных кривых проводили по технологии выполнения ПЦР-РВ, основанной на гибридизационно-флуоресцентной детекции с использованием специфических зондов с флуоресцентными метками (формат TaqMan). Использовали наборы реактивов для определения количества фрагментов ДНК гена β-актина, фрагментов гена амелогенина, локализованного на X (р22.1-22.3) и Υ (р11.2) хромосомах человека «XY-Детект» (ООО «Синтол»). Для оценки эффективности (Е) ПЦР строили калибровочную кривую для проб, содержащих следующие концентрации ДНК: 5 нг/мкл, 1 нг/мкл, 0,2 нг/мкл, 0,04 нг/мкл и 0,008 нг/мкл. Для амплификации гена β-актина рассчитанная эффективность ПЦР составила Е=0,971.

В табл. 7 представлены объемы компонентов, используемые при приготовлении реакционной смеси в расчете на одну пробирку.

Перед проведением ПЦР в пробирки с 23 мкл готовой реакционной смеси добавляли по 2 мкл фильтрата выполненных смывов. В качестве контроля в ПЦР-пробирки с реакционной смесью помещали по 2 мкл стандартных препаратов ДНК с известной концентрацией: 5 нг/мкл, 1 нг/мкл, 0,2 нг/мкл, 0,04 нг/мкл и 0,008 нг/мкл.

Проводили амплификацию в следующем режиме:

Анализ данных ПЦР «в реальном времени» проводили с помощью программы «iQ5 Optical System Software» (версия 2.0, 2006).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы STADIA (Кулайчев А.П. Методы и средства анализа данных в среде Windows. Stadia 6.0. - Μ.: Информатика и компьютеры. - 1996. -257 с.).

Концентрация ДНК, хранящейся в различных средах в течение 0, 7 и 30 суток, в сухом виде при комнатной температуре, представлена в табл. 8. Графики кривых ПЦР представлены на Фиг. 4.

Примечание: «±» - обозначает стандартное отклонение.

Сравнение различий в концентрации ДНК, хранящейся в различных средах в течение 0, 7 и 30 суток в сухом виде при комнатной температуре, представлено в табл. 9.

Отмечается заметное снижение концентрации активной ДНК-матрицы с течением времени в хранящихся при комнатной температуре смывах, осуществленных при помощи деионизованной воды: уже спустя 7 суток происходит снижение концентрации ДНК в 7,5 раз, а спустя 30 суток - в более чем 18,5 раз. В смывах, которые были выполнены при помощи предлагаемых жидких буферных композиций 1 и 3 (буферы 1 и 3), концентрация активной ДНК-матрицы снизилась спустя 7 суток в 4,9 (буфер 1) и 3,2 (буфер 3) раза, а спустя месяц - в 17,5 (буфер 1) и 7,9 (буфер 3) раза по сравнению с контролем (0 суток) (табл. 8). Следует отметить, что спустя 30 суток отсутствует существенное отличие в концентрации ДНК, хранящейся в смывах, выполненных при помощи жидкой буферной композиции 1 (буфер 1) и деионизованной воды, в то время как жидкая буферная композиция 3 (буфер 3) продолжает оказывать свое стабилизирующее влияние на ДНК. То есть, например, хранение смывов, выполненных при помощи предлагаемой жидкой буферной композиции 3 (буфера 3) в течение 30 суток, равнозначно хранению смывов, выполненных при помощи деионизованной воды, в течение одной недели.

На Фиг. 4 на графиках накопления продуктов ПЦР показано, что после 35-го цикла виден подъем кривых образцов смывов ДНК, выполненных деионизованной водой, хранящихся 7 и 30 суток. При этом характер данных кривых нестабилен и в некоторых образцах отсутствует их подъем, что отражает крайне низкое содержание, либо отсутствие в данных образцах активной ДНК-матрицы. В образцах смывов ДНК, выполненных при помощи предлагаемых жидких буферных композиций 1, 3 (буферов 1, 3), подъем кривых на графиках ПЦР начинался всегда до 35 цикла и характеризовался относительной стабильностью кривых.

В сухом виде при пропитке гигроскопичных материалов-носителей (например, хлопчатобумажная ткань) предлагаемыми в настоящем изобретении буферными жидкими композициями срок хранения ДНК биологического материала при комнатной температуре значительно выше, чем в жидком виде. Это связано с крайне низким содержанием либо отсутствием одного из ключевых компонентов реакции гидролиза внутримолекулярных фосфодиэфирных связей - воды.

II. Проводили качественную и количественную сравнительную оценку продуктов ПЦР-РВ с помощью электрофореза в 2% геле агарозы. Исследовали образцы, полученные из смывов, проводимых предлагаемыми буферными жидкими композициями 1, 3 (буферами 1, 3) или деионизованной водой, которые хранились в течение 0 (контроль), 5 и 7 суток.

Готовили однократный TBE-буфер в объеме, достаточном для заполнения камеры электрофореза и приготовления геля. Добавляли к однократному TBE-буферу порошок агарозы в количестве, необходимом для получения 2% раствора, и нагревали в микроволновой печи до полного ее расплавления. Полученный жидкий раствор охлаждали до +50-60°C, добавляли бромистый этидий до конечной концентрации 1,0 мкг/мл (при 0,8% было 0,5 мкг/мл) и осторожно перемешивали, избегая появления в геле пузырьков воздуха. Теплую агарозу выливали в соответствующую форму и следили за тем, чтобы она равномерно распределилась по форме. Вертикально вставляли гребенку так, чтобы ее зубцы не доставали до дна примерно 1 мм. Оставляли кювету с агарозным гелем на 30 минут, затем осторожно удаляли гребенку. Кювету с гелем помещали в электрофорезную камеру, содержащую необходимое количество однократного TBE-буфера. Подготавливали к электрофорезу исследуемые образцы, смешивая их с шестикратным буфером для нанесения (5:1, о/о), содержащим бромфеноловый синий и ксиленцианол в 30% растворе глицерина. Аккуратно вносили образцы в соответствующие лунки геля. В лунки, обозначенные как «М», вносили маркер молекулярных масс Bench Тор 100 bp DNA Ladder. Электрофорез проводили при постоянной напряженности электрического поля (6,5 В/см) в течение 40 минут (до тех пор, пока бромфеноловый синий не дойдет до конца геля). Помещали гель в УФ-трансиллюминатор и фотографировали. Сравнивали интенсивность свечения опытных препаратов ДНК с интенсивностью свечения проб с контрольными образцами, определяя количество ДНК в исследуемой пробе (Корниенко И.В., Харламов С.Г. Методы исследования ДНК человека. Выделение ДНК и ее количественная оценка в аспекте судебно-медицинского исследования вещественных доказательств биологического происхождения: Учебно-методическое пособие. Ростов н/Д: ЮФУ. - 2012. - 216 с.).

Результаты электрофореза в 2% геле агарозы продуктов ПЦР-РВ образцов, хранившихся в течение 0 суток (контроль) (1), 5 суток (2) и 7 суток (3) при комнатной температуре, представлены на Фиг. 5.

Μ - маркер молекулярных масс Bench Тор 100 bp DNA Ladder;

1-5: смывы, выполненные деионизованной водой;

6-10: смывы, выполненные жидкой буферной композицией 1 (буфером 1);

11-15: смывы, выполненные жидкой буферной композицией 3 (буфером 3);

К1 - Контроль 5 нг/мкл;

К2 - Контроль 1 нг/мкл;

К3 - Контроль 0,2 нг/мкл;

К4 - Контроль 0,04 нг/мкл;

К5 - Контроль 0,008 нг/мкл.

На Фиг. 5 отчетливо визуализируются полоски высокомолекулярного ПЦР-продукта образцов, полученных из смывов, проводимых предлагаемыми буферными жидкими композициями 1, 3 (буферами 1, 3), которые хранились в течение 0 (контроль) (Фиг. 5 (1)), 5 (Фиг. 5 (2)) и 7 (Фиг. 5 (3)) (за исключением проб 6, 9, 13 спустя 7 суток) суток, соответствующие таковым в контрольных образцах, что свидетельствует о наличии качественного ПЦР-продукта в присутствии компонентов буферов 1 и 3. При этом полоски высокомолекулярного ПЦР-продукта образцов, полученных из смывов, проводимых деионизованной водой, уже на 5 суток (Фиг. 5 (2)) хранения при комнатной температуре слабо визуализируются в нескольких образцах, а на 7 сутки (Фиг. 5 (3)) отсутствуют во всех образцах.

III. Для оценки деградации ДНК в фильтратах из смывов, выполненных на хлопчатобумажную ткань, пропитанную в деионизованной воде и жидких буферных композициях 1 и 3, хранимых в течение 0 (контроль), 7 и 30 суток при комнатной температуре, проводили генотипирование локусов ДНК по STR-локусам панели COrDIS Plus (D3S1358, THO1, D12S391, D1S1656, D10S1248, D22S1045, D2S441, D7S820, D13S317, FGA, ТРОХ, D18S51, D16S539, D8S1179, CSF1PO, D5S818, vWA, D21S11, SE33 и локусу Amelogenin, определяющему половую принадлежность) набора реагентов COrDIS Plus для ДНК-идентификации 19-маркеров и локуса амелогенина человека в соответствии с руководством фирмы производителя (COrDIS Plus. Набор реагентов для мультиплексного анализа 19 STR-маркеров и локуса амелогенина человека. Инструкция пользователя. - 2014. -19 с.) ООО «ГОРДИЗ» (регистрационное удостоверение №ФСР 2012/13548).

Для постановки энзиматической амплификации в ПЦР-пробирки из набора, содержащие лиофилизированные компоненты ПЦР (Taq-полимеразу, смесь дНТФ, реакционный буфер, праймерную смесь), помещали по 10 мкл деионизованной воды, затем добавляли по 5 мкл раствора активатора, содержащего буферный раствор и ионы магния Мд²⁺. Затем вносили по 10 мкл исследуемых препаратов ДНК. Смесь перемешивали и кратко центрифугировали. Для оценки специфичности реакции амплификации использовали положительный (проба с контрольной ДНК MK1 из набора реагентов «COrDIS Plus») и отрицательный (проба с деионизованной водой вместо препарата ДНК) контроли.

При проведении амплификации скорость нагрева составляла 0,3°C/сек на этапе повышения с температуры с 59°C до 72°C.

Использовали следующие параметры ПЦР:

94°C 3 мин 98°C 30 сек 59°C* 120 сек, 4 цикла 72°C 90 сек 94°C 30 сек 59°C* 120 сек, 6 циклов 72°C 90 сек 90°C 30 сек 59°C 120 сек, 20 циклов 72°C* 75 сек 68°C 10 мин 15°C ∞

* Скорость нагрева с 59°C до 72°C - не более 0,3°C/1 сек.

Амплификацию осуществляли с помощью термоциклера «GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) с алюминиевым блоком в режиме эмуляции GeneAmp 9600.

Идентификацию аллелей проводили по размерному стандарту S450 и относительно аллельного леддера, прилагаемого к тест-системе «COrDIS Plus».

Для загрузки образцов в прибор готовили смесь Hi-Di™ формамида и размерного стандарта S450 в следующем соотношении: 10 мкл Hi-Di™ формамида и 1 мкл размерного стандарта S450 в расчете на один образец.

Идентификацию продуктов амплификации по STR-локусам панели «COrDIS Plus» проводили с помощью автоматического секвенатора ABI PRISM 3130xl в соответствии с руководством по использованию (COrDIS Plus. Набор реагентов для мультиплексного анализа 19 STR-маркеров и локуса амелогенина человека. Инструкция пользователя. - 2014. - 19 с.) и (Руководство по использованию генетического анализатора 3130/3130xl. - Applied Biosystems).

В процессе электрофореза информация о сканировании геля лазером и детекции флуоресценции автоматически передавалась на управляющий компьютер и обрабатывалась программой Run 3130 Data Collection v.3.0.

Обработка результатов и идентификация аллелей проходила автоматически с помощью программы GeneMapper® ID 3.2.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы STADIA (Кулайчев А.П. Методы и средства анализа данных в среде Windows. Stadia 6.0. - Μ.: Информатика и компьютеры. - 1996. -257 с.).

Результаты генотипирования опытных образцов представлены в табл. 10. Представленные в таблице 10 средние значения рассчитаны по результатам типирования образцов после их хранения на хлопчатобумажном носителе, пропитанном соответствующей средой, в течение 7 суток (15 параллелей) и 30 суток (5 параллелей).

Примечания: «+» - обозначает наличие всех аллельных состояний в исследуемых локусах; «+/-» - обозначает выпадение одного из пары аллелей (так называемый эффект «ложной гомозиготы») в исследуемых локусах; «-» -обозначает отсутствие продукта амплификации (выпадение всех аллелей) в исследуемых локусах.

Отмечается заметное уменьшение ПЦР-продуктов с течением времени в хранящихся при комнатной температуре смывах, осуществленных при помощи деионизованной воды: уже спустя 7 суток удается идентифицировать аллели в 8,3% исследованных локусах, а спустя 30 суток - лишь в 2%. В смывах, которые были выполнены при помощи предлагаемой жидкой буферной композиции 1 (буфера 1), спустя 7 суток удается идентифицировать аллели в 40,4%, а спустя 30 суток - в 21% исследованных локусах. В смывах, выполненных при помощи предлагаемой жидкой буферной композиции 3 (буфера 3), спустя 7 суток удается идентифицировать аллели в 37,5%, а спустя 30 суток - в 43% исследованных локусах.

Таким образом, при хранении следов биологического происхождения в выполненных смывах с использованием деионизованной воды, происходит существенная деградация ДНК с течением времени. Использование предлагаемых жидких буферных композиций 1, 3 (буферов 1 и 3) в качестве среды для осуществления смывов следов биологического происхождения и дальнейшего хранения выполненных смывов при комнатной температуре способствует стабилизации и повышает сохранность ДНК на носителе. Следует отметить, что использование жидкой буферной композиции 3 (буфера 3) способствует получению большего количества генетической информации о хранимом объекте.

Пример 4.

Исследовали эффективность экстракции ДНК из клеток, а также возможность одновременного проведения «прямой» ПЦР полученных образцов путем оценки ингибиторного потенциала сравниваемых растворителей, включая жидкую буферную композицию 3 (буфер 3), предлагаемую в настоящем изобретении. Использовали следующие растворы:

1. Состав жидкой буферной композиции 3 (10 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,5% об. Твин 20, 50 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), 5% глицерин, 0,1% NaN₃ (азид натрия)): смесь растворов 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Твина 20, 37,3 мг KCl, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенная до 10 мл стерильной деионизованной водой.

2. Физиологический раствор, содержащий NaCl в концентрации 150 мМ.

3. Лизирующий раствор, условно обозначаемые в данном примере «А», содержащий: 10 мМ трис-HCl, рН 7,5, 10 мМ Na₂ЭДТА, 50 мМ NaCl, 2% SDS и деионизованную воду.

4. Коммерческий лизирующий раствор (Lysis buffer) набора реагентов DNA IQ™ System (Promega, США).

5. Коммерческий лизирующий раствор (Lysis buffer) набора реагентов PrepFiler™ User Guide (Applied Biosystems, США).

6. Коммерческий лизирующий раствор Prep-n-Go (Applied Biosystems, США).

7. Буфер ТЕ, содержащий 10 мМ Трис-HCl рН=8,0, 0,1-1,0 мМ ЭДТА и деионизованную воду.

8. Деионизованная вода.

Для оценки эффективности лизирования клеток при помощи сравниваемых растворов в качестве генетического материала использовали буккальный эпителий в составе слюны восьми добровольцев. Забор слюны осуществляли натощак спустя 30 минут после полоскания полости рта водой.

Помещали по 290 мкл каждого из растворов в 0,5 мл пробирки в двух параллелях. Добавляли по 10 мкл образцов слюны. Перемешивали на вортексе при низких оборотах 10 секунд, затем кратко центрифугировали. Первую параллель образцов оставляли при комнатной температуре (+22°C) в течение 30 минут. Помещали пробирки второй параллели в термошейкер и инкубировали при +70°C в течение 30 минут. После проведения инкубации образцы перемешивали на вортексе при низких оборотах 5 секунд, затем кратко центрифугировали.

Проводили оценку ингибирующего эффекта на ПЦР исследуемых растворов при помощи ПЦР-РВ в соответствии с инструкцией производителя. Использовали термоциклер с мультиканальным детектором для оценки ПЦР-продуктов в режиме реального времени iQ5 (США) Bio-Rad.

Регистрацию накопления ампликонов и построение калибровочных кривых проводили по технологии выполнения ПЦР-РВ, основанной на гибридизационно-флуоресцентной детекции с использованием специфических зондов с флуоресцентными метками (формат TaqMan). Использовали наборы реактивов для определения количества фрагментов ДНК гена β-актина, фрагментов гена амелогенина, локализованного на X (р22.1-22.3) и Υ (р11.2) хромосомах человека «XY-Детект» (ООО «Синтол»).

В табл. 11 представлены объемы компонентов, используемые при приготовлении реакционной смеси в расчете на одну пробирку.

Перед проведением ПЦР в пробирки с 20 мкл готовой реакционной смеси добавляли по 5 мкл исследуемых образцов. Для контроля ингибиторного влияния на ПЦР помещали в пробирки с реакционной смесью по 4 мкл исследуемых растворов 1-7 или деионизованной воды без добавления образцов слюны и по 1 мкл контрольной ДНК человека из тест-набора «XY-Детект» (ООО «Синтол») в концентрации 5 нг/мкл.

Проводили амплификацию в следующем режиме:

Анализ данных ПЦР «в реальном времени» проводили с помощью программы «iQ5 Optical System Software» (версия 2.0, 2006).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы STADIA (Кулайчев А.П. Методы и средства анализа данных в среде Windows. Stadia 6.0. - Μ.: Информатика и компьютеры. - 1996. -257 с.).

Результаты сравнительного исследования ингибирующего влияния на ПЦР исследуемых растворов в составе препаратов ДНК, полученных из образцов слюны, подвергшиеся инкубации при +22°C в течение 30 минут, по ингибированию ПЦР гена β-актина (канал FAM), представлены в табл. 12 и на Фиг. 6 (графики (1) и (3)).

Примечания: C_t (Threshold Cycle) - пороговый цикл_; ΔC_t - разница между контрольным (препарат 8) и опытным (препараты 1-7) пороговыми циклами; N/A - ПЦР-продукт отсутствует.

Результаты сравнительного исследования ингибирующего влияния на ПЦР исследуемых растворов в составе препаратов ДНК, полученных из образцов слюны, подвергшиеся инкубации при +70°C в течение 30 минут, по ингибированию ПЦР гена β-актина (канал FAM), представлены в табл. 13 и на Фиг. 6 (графики (2) и (4))

Примечания: C_t (Threshold Cycle) - пороговый цикл; ΔC_t - разница между контрольным (препарат 8) и опытным (препараты 1-7) пороговыми циклами; N/A - ПЦР-продукт отсутствует.

Результаты сравнительного исследования ингибирующего влияния на ПЦР исследуемых растворов, включая жидкую буферную композицию 3 (буфер 3), по ингибированию ПЦР внутреннего положительного контроль (канал Су5) представлены в табл. 14 и на Фиг. 7 (графики (1) и (2)).

Примечания: C_t (Threshold Cycle) - пороговый цикл_; ΔC_t - разница между контрольным (препарат 8) и опытным (препараты 1-7) пороговыми циклами; N/A - ПЦР-продукт отсутствует.

На Фиг. 6 на графиках накопления продуктов ПЦР показано, что, начиная с 27-го цикла, происходит подъем кривых образцов ДНК, инкубировавшихся при +22°C в течение 30 минут, в которых растворителем являются деионизованная вода, физиологический раствор и буфер ТЕ, а с 28 - образцы с жидкой буферной композицией 3 (буфером 3) (Фиг. 6 (1)). Инкубация образцов слюны (буккального эпителия) при +70°C в течение 30 минут способствует разрушению клеточных структур, что облегчает доступ фермента ДНК-Taq-полимеразы и праймеров к ДНК-матрице. Поэтому подъем кривых образцов слюны, инкубировавшейся при +70°C в течение 30 минут в деионизованной воде, физиологическом растворе или жидкой буферной композиции 3 (буфере 3) начинается уже с 26 цикла, а в буфере ТЕ - с 27 цикла. Характер кривых более равномерный и плавный (Фиг. 6 (2)). Образцы, в которых растворителем являлись лизирующие растворы из наборов реагентов DNA IQ™ System, PrepFiler™ User Guide и лизирующие растворы Prep-n-Go, «А», отсутствовал подъем кривых как при +22°C (Фиг. 6 (3)), так и при +70°C (Фиг. 6 (4)) инкубации, что отражает полное ингибирование ПЦР компонентами, входящими в их состав, и невозможность проведения «прямой» ПЦР в отличие от остальных растворителей, включая предлагаемую жидкую буферную композицию 3 (буфер 3).

На Фиг. 7 показано отсутствие ингибирующего влияния деионизованной воды, физиологического раствора, буфер ТЕ, жидкой буферной композиции 3 (буфера 3) (1), а также наличие ингибирующего влияния на ПЦР внутреннего положительного контроль (канал Су5) лизирующих растворов из наборов реагентов DNA IQ™ System, PrepFiler™ User Guide, Prep-n-Go, «А» (2).

Пример 5.

Проводили сравнительное исследование смывов биологических наложений, содержащих малое количество генетического материала, на примере потожирового вещества человека, оставленных на поверхности искусственной кожи, выполненных с помощью жидких буферных композиций 1, 3 (буферов 1, 3), предлагаемых в настоящем изобретении, либо деионизованной воды. Оценивали влияние режимов инкубации исследуемых образцов на количество получаемой ДНК и эффективность ее генотипирования.

1. Состав жидкой буферной композиции 1 (10 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,5% об. Твин 20, 50 мМ K₂SO₄, 0,1 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), 5% глицерин, 0,1% NaN₃ (азид натрия)): смесь растворов 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Твина 20, 87,1 мг K₂SO₄, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенная до 10 мл стерильной деионизованной водой.

2. Состав жидкой буферной композиции 3 (10 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,5% об. Твин 20, 50 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), 5% глицерин, 0,1% NaN₃ (азид натрия)): смесь растворов 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Твина 20, 37,3 мг KCl, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенная до 10 мл стерильной деионизованной водой.

В качестве генетического материала использовали потожировые выделения подушечек пальцев 20 человек (10 мужчин и 10 женщин) в возрасте от 18 до 48 лет.

Перед проведением исследования руки испытуемых не подвергались контакту с водой и очистке за 1-2 часа. Нанесение потожирового вещества подушечек пальцев обеих рук на заранее стерильную и очищенную от возможного наличия посторонней ДНК поверхность ткани искусственной кожи (состав: 62% полиамид, 34% полиэтиленовое волокно, 4% эластан) осуществлялось путем их однократного контакта умеренной силой нажатия и прокатыванием в течение 5 секунд. Поле контакта для каждого пальца составляло 6 см². Изъятие биологического материала проводили спустя 20-30 минут после нанесения отпечатков путем смывов на стерильную хлопчатобумажную ткань, размером 0,5×0,5 см, пропитанную в 25 мкл жидких буферных композициях (буфер 1 или 3), либо деионизованной воды. В ходе проведения эксперимента исследуемая поверхность искусственной кожи находилась в условиях комнатной температуры, без прямого попадания лучей солнечного света и контакта с посторонними объектами. Каждый смыв на хлопчатобумажной ткани, полученный от одного отпечатка пальца, помещали в отдельную колонку для фильтрации с решетчатым дном, которую вставляли в 1,5 мл пробирку типа Эппендорф. Центрифугировали пробирки при 14000-15000 об/мин в течение 5 минут. Колонку и предмет-носитель удаляли из пробирки. Фильтрат выполненных смывов, находящийся в 1,5 мл пробирках типа Эппендорф, инкубировали в термошейкере при +70°C в течение 15 минут. После проведенной инкубации образцы перемешивали на низких оборотах и кратко центрифугировали.

Дополнительно исследовали фильтрат смывов потожирового вещества, осуществленных при помощи жидкой буферной композиции (буфера 3). Проводили инкубацию фильтратов в трех режимах: при комнатной температуре в течение 30 минут (контрольные образцы), при +70°C в течение 30 минут и при +99°C в течение 8 минут.

После проведения инкубации образцы перемешивали на вортексе при низких оборотах 5 секунд, затем кратко центрифугировали.

Для последующего сравнительного генотипирования у испытуемых были отобраны образцы буккального эпителия. Забор слюны проводили при помощи ватных тампонов натощак спустя 30 минут после полоскания полости рта водой.

Выделение ДНК из образцов буккального эпителия осуществляли с использованием ионообменной смолы Chelex 100 в соответствии с методикой, изложенной в учебно-методическом пособии (Корниенко И.В., Харламов С.Г. Методы исследования ДНК человека. Выделение ДНК и ее количественная оценка в аспекте судебно-медицинского исследования вещественных доказательств биологического происхождения: учебно-методическое пособие / И.В. Корниенко, С.Г. Харламов. Ростов н/Д: ЮФУ, 2012. - 216 с.).

Вырезки ватных тампонов с образцами слюны помещали в отдельные стерильные микроцентрифужные 1,5 мл пробирки типа Эппендорф. В пробирки добавляли по 1 мл стерильной деионизованной воды. Инкубировали образцы при комнатной температуре в течение 30 минут, периодически перемешивая. Образцы центрифугировали 3 минуты при 13000 об/мин. Удаляли из пробирок по 970 мкл супернатанта, оставляя в пробирках приблизительно по 30 мкл и предмет-носитель. Добавляли по 190 мкл 5% взвеси Chelex и по 10 мкл протеиназы K (10 мг/мл). Инкубировали при температуре +56°C в термошейкере в течение 20 минут. Перемешивали на вортексе в течение 10 секунд. Затем пробы инкубировали при температуре +99°C в термошейкере в течение 8 минут. Перемешивали на вортексе в течение 10 секунд. Центрифугировали в течение 3 минут при 13000 об/мин. Для постановки ПЦР использовали супернатант.

I. Проводили оценку количества ДНК в исследуемых препаратах при помощи ПЦР-РВ в соответствии с инструкцией производителя. Использовали термоциклер с мультиканальным детектором для оценки ПЦР-продуктов в режиме реального времени iQ5 (США) Bio-Rad.

Регистрацию накопления ампликонов и построение калибровочных кривых проводили по технологии выполнения ПЦР-РВ, основанной на гибридизационно-флуоресцентной детекции с использованием специфических зондов с флуоресцентными метками (формат TaqMan).

Использовали наборы реактивов для определения количества фрагментов ДНК гена β-актина, фрагментов гена амелогенина, локализованного на X (р22.1-22.3) и Υ (р11.2) хромосомах человека «XY-Детект» (ООО «Синтол»). Для оценки эффективности (Е) ПЦР строили калибровочную кривую для проб, содержащих следующие концентрации ДНК: 5 нг/мкл, 1 нг/мкл, 0,2 нг/мкл, 0,04 нг/мкл и 0,008 нг/мкл. Для амплификации гена β-актина рассчитанная эффективность ПЦР составила Е=0,971.

В табл. 15 представлены объемы компонентов, используемые при приготовлении реакционной смеси в расчете на одну пробирку.

Перед проведением ПЦР в пробирки с 23 мкл готовой реакционной смеси добавляли по 2 мкл препаратов ДНК или стандартных препаратов ДНК с известной концентрацией: 0,008, 0,04, 0,2, 1,0 и 5,0 нг/мкл.

Проводили амплификацию в следующем режиме:

Анализ данных ПЦР «в реальном времени» проводили с помощью программы «iQ5 Optical System Software» (версия 2.0, 2006).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы STADIA (Кулайчев А.П. Методы и средства анализа данных в среде Windows. Stadia 6.0. - Μ.: Информатика и компьютеры. - 1996. -257 с.).

По результатам статистического анализа данных установлено, что распределение отличалось от нормального, поэтому в качестве количественной оценки использовали не средние значения, а медианы выборок.

Концентрация ДНК и пороговые циклы кривых ПЦР в смывах, выполненных при помощи жидких буферных композиций 1, 3 (буфера 1, 3), а также деионизованной воды, инкубировавшихся в течение 15 минут при +70°C, представлена в табл. 16.

Концентрация ДНК в смывах, выполненных при помощи жидкой буферной композиции 3 (буфера 3), подвергнутая различным режимам инкубации, представлена в табл. 17.

По результатам количественной оценки в смывах потожирового вещества, выполненных при помощи предлагаемых жидких буферных композиций 1 и 3 (буферов 1 и 3), концентрация ДНК более чем в 1,6 раз выше по сравнению с количеством ДНК в смывах, выполненных при помощи деионизованной воды.

На примере использования жидкой буферной композиции 3 (буфера 3) за счет ее больших стабилизирующих свойств, оказываемых на ДНК (доказано в примере 3), показано, что при использовании различных режимов инкубации фильтратов проведенных смывов удается получить качественные препараты ДНК.

II. Для оценки используемых растворителей в качестве жидкой среды для проведения смывов биологических следов (потожирового вещества) проводили генотипирование локусов ДНК фильтратов, инкубировавшихся 15 минут при +70°C, по STR-локусам панели COrDIS Plus (D3S1358, THO1, D12S391, D1S1656, D10S1248, D22S1045, D2S441, D7S820, D13S317, FGA, ТРОХ, D18S51, D16S539, D8S1179, CSF1PO, D5S818, vWA, D21S11, SE33 и локусу Amelogenin, определяющему половую принадлежность) набора реагентов COrDIS Plus для ДНК-идентификации 19-маркеров и локуса амелогенина человека в соответствии с руководством фирмы производителя (COrDIS Plus. Набор реагентов для мультиплексного анализа 19 STR-маркеров и локуса амелогенина человека. Инструкция пользователя. - 2014. - 19 с.) ООО «ГОРДИЗ» (регистрационное удостоверение №ФСР 2012/13548).

Для постановки энзиматической амплификации в ПЦР-пробирки из набора, содержащие лиофилизированные компоненты ПЦР (Taq-полимеразу, смесь дНТФ, реакционный буфер, праймерную смесь), помещали по 10 мкл деионизованной воды, затем добавляли по 5 мкл раствора активатора, содержащего буферный раствор и ионы магния Mg²⁺. Затем вносили по 10 мкл исследуемых препаратов ДНК. Смесь перемешивали и кратко центрифугировали. Для оценки специфичности реакции амплификации использовали положительный (проба с контрольной ДНК MK1 из набора реагентов «COrDIS Plus») и отрицательный (проба с деионизованной водой вместо препарата ДНК) контроли.

При проведении амплификации скорость нагрева составляла 0,3°C/сек на этапе повышения с температуры с 59°C до 72°C.

Использовали следующие параметры ПЦР:

94°C 3 мин 98°C 30 сек 59°C* 120 сек, 4 цикла 72°C 90 сек 94°C 30 сек 59°C* 120 сек, 6 циклов 72°C 90 сек 90°C 30 сек 59°C 120 сек, 20 циклов 72°C* 75 сек 68°C 10 мин 15°C ∞

* Скорость нагрева с 59°C до 72°C - не более 0,3°C/1 сек.

Амплификацию осуществляли с помощью термоциклера «GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems) с алюминиевым блоком в режиме эмуляции GeneAmp 9600.

Идентификацию аллелей проводили по размерному стандарту S450 и относительно аллельного леддера, прилагаемого к тест-системе «COrDIS Plus».

Для загрузки образцов в прибор готовили смесь Hi-Di™ формамида и размерного стандарта S450 в следующем соотношении: 10 мкл Hi-Di™ формамида и 1 мкл размерного стандарта S450 в расчете на один образец.

Идентификацию продуктов амплификации по STR-локусам панели «COrDIS Plus» проводили с помощью автоматического секвенатора ABI PRISM 3130xl в соответствии с руководством по использованию (COrDIS Plus. Набор реагентов для мультиплексного анализа 19 STR-маркеров и локуса амелогенина человека. Инструкция пользователя. - 2014. - 19 с.) и (Руководство по использованию генетического анализатора 3130/3130xl. - Applied Biosystems).

В процессе электрофореза информация о сканировании геля лазером и детекции флуоресценции автоматически передавалась на управляющий компьютер и обрабатывалась программой Run 3130 Data Collection v.3.0.

Обработка результатов и идентификация аллелей проходила автоматически с помощью программы GeneMapper^® ID 3.2.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы STADIA (Кулайчев А.П. Методы и средства анализа данных в среде Windows. Stadia 6.0. - Μ.: Информатика и компьютеры. - 1996. - 257 с.).

Результаты генотипирования опытных образцов представлены в табл. 18.

Представленные в таблице 18 средние значения рассчитаны по результатам типирования образцов потожирового вещества человека, отобранных с поверхности искусственной кожи при помощи смывов жидкими буферными композициями 1, 3 (буферов 1, 3), предлагаемыми в настоящем изобретении, либо деионизованной водой в семи параллелях.

Примечания: «+» - обозначает наличие всех аллельных состояний в исследуемых локусах; «+/-» - обозначает выпадение одного из пары аллелей (так называемый эффект «ложной гомозиготы») в исследуемых локусах; «-» - обозначает отсутствие продукта амплификации (выпадение всех аллелей) в исследуемых локусах.

При генотипировании смывов потожирового вещества, как наиболее сложного объекта идентификации за счет крайне низкого количества генетического материала, содержащегося в нем, выполненных при помощи предлагаемых жидких буферных композиций 1 и 3 (буферов 1 и 3), удается идентифицировать аллели в исследуемых локусах, в среднем в 13 раз больше и в более чем 1,7 раза меньше отмечается отсутствие продукта амплификации по сравнению со смывами, выполненными при помощи деионизованной воды.

Полученные результаты объясняются наличием в предлагаемых жидких буферных композициях 1, 3 (буферов 1, 3) хаотропных агентов Твина 20 и Тритона Х-100, под воздействием которых в процессе осуществления смыва, в выполненном смыве и его фильтрате, происходит разрушение клеточных структур, и тем самым облегчается доступ фермента ДНК-Taq-полимеразы и праймеров к ДНК-матрице. Благодаря входящим в состав предлагаемых жидких буферных композиций 1, 3 (буферов 1, 3) активаторам ПЦР (Твин 20, Тритон Х-100, KCl, K₂SO₄, глицерин) повышается время полужизни фермента ДНК-Taq-полимеразы при +95°C на этапе денатурации ДНК.

Пример 6.

Исследовали эффективность экстракции ДНК из смывов биологических наложений (потожирового вещества), выполненных при помощи различных растворителей, включая жидкую буферную композицию 3 (буфер 3), предлагаемую в настоящем изобретении. Использовали деионизованную воду и растворы, которые по результатам, представленным в примере 4, не оказали ингибирующего влияния на ПЦР:

1. Состав жидкой буферной композиции 3 (10 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,5% об. Твин 20, 50 мМ KCl, 0,1 мМ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетат), 5% глицерин, 0,1% NaN₃ (азид натрия)): смесь растворов 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Твина 20, 37,3 мг KCl, 2 мкл 0,5 Μ ЭДТА (этилендиамин-Ν,Ν,Ν',Ν'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенная до 10 мл стерильной деионизованной водой.

2. Физиологический раствор, содержащий NaCl в концентрации 150 мМ.

3. Буфер ТЕ, содержащий 10 мМ Трис-HCl рН=8,0, 0,1-1,0 мМ ЭДТА и деионизованную воду.

4. Деионизованная вода.

В качестве аналога биологических следов, содержащих малое количество генетического материала, использовали потожировое вещество, оставленное подушечками пальцев восьми добровольцев на гладком металлическом предмете спустя 9 месяцев после их нанесения. Проводили смывы при помощи стерильных ватных тампонов, смоченных в 50 мкл жидкой буферной композиции 3, физиологическом растворе, буфере ТЕ или деионизованной воде.

Помещали ватные тампоны с осуществленными смывами в пластиковые колонки с решетчатым дном, которые вставляли в 1,5 мл пробирки типа Эппендорф. Центрифугировали пробирки при 13000 - 14000 g в течение 5 минут. Фильтрат выполненных смывов, находящийся в 1,5 мл пробирках типа Эппендорф, помещали в термошейкер и инкубировали при +70°C в течение 30 минут в режиме перемешивания 1150 об/мин. После проведения инкубации образцы перемешивали на вортексе при низких оборотах 5 секунд, затем кратко центрифугировали.

Проводили оценку эффективность экстракции ДНК из смывов биологических наложений (потожирового вещества) при помощи ПЦР-РВ в соответствии с инструкцией производителя. Использовали термоциклер с мультиканальным детектором для оценки ПЦР-продуктов в режиме реального времени iQ5 (США) Bio-Rad.

Регистрацию накопления ампликонов и построение калибровочных кривых проводили по технологии выполнения ПЦР-РВ, основанной на гибридизационно-флуоресцентной детекции с использованием специфических зондов с флуоресцентными метками (формат TaqMan). Использовали наборы реактивов для определения количества фрагментов ДНК гена β-актина, фрагментов гена амелогенина, локализованного на X (р22.1-22.3) и Υ (р11.2) хромосомах человека «XY-Детект» (ООО «Синтол»).

В табл. 19 представлены объемы компонентов, используемые при приготовлении реакционной смеси в расчете на одну пробирку.

Перед проведением ПЦР в пробирки с 20 мкл готовой реакционной смеси добавляли по 5 мкл исследуемых образцов.

Проводили амплификацию в следующем режиме:

Анализ данных ПЦР «в реальном времени» проводили с помощью программы «iQ5 Optical System Software» (версия 2.0, 2006).

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с использованием программы STADIA (Кулайчев А.П. Методы и средства анализа данных в среде Windows. Stadia 6.0. - Μ.: Информатика и компьютеры. - 1996. - 257 с.).

Результаты сравнительного исследования эффективности экстракции ДНК из смывов биологических наложений (потожирового вещества) давностью 9 месяцев представлены в табл. 20 и на Фиг. 8.

Примечания: ΔC_t - разница между контрольным (препарат 4) и опытным (препараты 1-3) пороговыми циклами.

На Фиг. 8 на графике накопления продуктов ПЦР показано, что в среднем, начиная с 32-го цикла, происходит подъем кривых всех образцов ДНК потожирового вещества давностью 9 месяцев, в которых растворителем являются жидкая буферная композиция 3 (1), физиологический раствор (2), буфер ТЕ (3) или деионизованная вода (4). Полученные результаты показывают эффективность экстракции ДНК из смывов биологических наложений, содержащих крайне низкое количество генетического материала на примере длительно хранящегося потожирового вещества на поверхности гладкого металлического предмета.

Группа изобретений относится к области биохимии. Предложены композиции для сбора и хранения ДНК или ДНК-содержащих биологических следов (варианты), а также средство для пропитки гигроскопичных материалов-носителей и осуществления смывов ДНК-содержащих биологических следов, наложений или ДНК с целью их хранения и/или транспортировки, где данное средство представляет собой вышеуказанные композиции. Причём композиции включают 1-40 мΜ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,05-1% об. Твин 20, 0,05-1% об. Тритон Х-100, 1-200 мМ K₂SO₄, 1-200 мМ KCl, 0,01-0,5 мМ ЭДТА, 1-20% глицерин, 0,01-0,4% NaN₃ и воду. Изобретения обеспечивают стабильность ДНК биологических образцов в широком диапазоне температур в течение длительных периодов времени. 5 н. и 21 з.п. ф-лы, ил.,0 табл., 6 пр.

1. Композиция для сбора и хранения ДНК или ДНК-содержащих биологических следов, содержащая буферный раствор, включающий 1-40 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,05-1% об. Твин 20, 1-200 мМ K₂SO₄, 0,01-0,5 мМ ЭДТА (этилендиамин-N,N,N',N'-тетраацетат), 1-20% глицерин, 0,01-0,4% NaN₃ (азид натрия), вода - остальное.

2. Композиция по п. 1, где буферный раствор представляет собой смесь растворов 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Твина 20, 87,1 мг K₂SO₄, 2 мкл 0,5 М ЭДТА (этилендиамин-N,N,N',N'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.

3. Композиция по п. 1, где ДНК-содержащий след представляет собой биообразец.

4. Композиция по п. 3, где соотношение буфера к биообразцу составляет 10:1.

5. Композиция по п. 3, где биообразец представляет собой потожировое вещество, следы крови, слюны, влагалищного секрета, спермы, суспензии клеток, смешанные биологические следы, препараты ДНК.

6. Композиция для сбора и хранения ДНК или ДНК-содержащих биологических следов, содержащая буферный раствор, включающий 1-40 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,05-1% об. Тритон Х-100, 1-200 мМ K₂SO₄, 0,01-0,5 мМ ЭДТА (этилендиамин-N,N,N',N'-тетраацетат), 1-20% глицерин, 0,01-0,4% NaN₃ (азид натрия), вода - остальное.

7. Композиция по п. 6, где буферный раствор представляет собой смесь растворов 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Тритона Х-100, 87,1 мг K₂SO₄, 2 мкл 0,5 М ЭДТА (этилендиамин-N,N,N',N'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.

8. Композиция по п. 7, где ДНК-содержащий след представляет собой биообразец.

9. Композиция по п. 8, где соотношение буфера к биообразцу составляет 10:1.

10. Композиция по п. 8, где биообразец представляет собой потожировое вещество, следы крови, слюны, влагалищного секрета, спермы, суспензии клеток, смешанные биологические следы, препараты ДНК.

11. Композиция для сбора и хранения ДНК или ДНК-содержащих биологических следов, содержащая буферный раствор, включающий 1-40 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,05-1% об. Твин 20, 1-200 мМ KCl, 0,01-0,5 мМ ЭДТА (этилендиамин-N,N,N',N'-тетраацетат), 1-20% глицерин, 0,01-0,4% NaN₃ (азид натрия), вода - остальное.

12. Композиция по п. 11, где буферный раствор представляет собой смесь растворов 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Твина 20, 37,3 мг KCl, 2 мкл 0,5 М ЭДТА (этилендиамин-N,N,N',N'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.

13. Композиция по п. 12, где ДНК-содержащий след представляет собой биообразец.

14. Композиция по п. 13, где соотношение буфера к биообразцу составляет 10:1.

15. Композиция по п. 13, где биообразец представляет собой потожировое вещество, следы крови, слюны, влагалищного секрета, спермы, суспензии клеток, смешанные биологические следы, препараты ДНК.

16. Композиция для сбора и хранения ДНК или ДНК-содержащих биологических следов, содержащая буферный раствор, включающий 1-40 мМ Трис (гидроксиметил) аминометан, 0,05-1% об. Тритон Х-100, 1-200 мМ KCl, 0,01-0,5 мМ ЭДТА (этилендиамин-N,N,N',N'-тетраацетат), 1-20% глицерин, 0,01-0,4% NaN₃ (азид натрия), вода - остальное.

17. Композиция по п. 16, где буферный раствор представляет собой смесь растворов 12,1 мг Трис (гидроксиметил) аминометана, 50 мкл Тритона Х-100, 37,3 мг KCl, 2 мкл 0,5 М ЭДТА (этилендиамин-N,N,N',N'-тетраацетата), 500 мкл глицерина, 10 мг NaN₃ (азид натрия), доведенную до 10 мл стерильной деионизованной водой.

18. Композиция по п. 17, где ДНК-содержащий след представляет собой биообразец.

19. Композиция по п. 18, где соотношение буфера к биообразцу составляет 10:1.

20. Композиция по п. 18, где биообразец представляет собой потожировое вещество, следы крови, слюны, влагалищного секрета, спермы, суспензии клеток, смешанные биологические следы, препараты ДНК.

21. Применение композиции по любому из пп. 1-20 для пропитки гигроскопичных материалов-носителей и осуществления смывов ДНК-содержащих биологических следов, наложений или ДНК с целью их хранения и/или транспортировки.

22. Применение по п. 21, где гигроскопичный материал-носитель представляет собой хлопчатобумажную ткань, волокнистые вещества, бумажный носитель.

23. Применение по п. 22, где волокнистое вещество представляет собой ватный тампон.

24. Применение по п. 22, где бумажный носитель представляет собой хроматографическую бумагу.

25. Применение по п. 21, где ДНК-содержащий биологический след, наложение или ДНК представляют собой сухой биообразец.

26. Применение по п. 21, где ДНК-содержащий биологический след, наложение или ДНК находятся в жидком виде.