Вакцина против ящура генотипа Азия-1/G-V из штамма «Азия-1/G-V/2006» культуральная инактивированная эмульсионная Российский патент 2024 года по МПК A61K39/135 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура генотипа Азия-1/G-V из штамма «Азия-1/G-V/2006» культуральной инактивированной эмульсионной.

Ящур - крайне заразное заболевание парнокопытных животных, включая крупный рогатый скот, овец, коз, свиней, всех диких жвачных [1]. Заболеваемость высока среди инфицированного взрослого скота, но это заболевание редко приводит к летальному исходу у взрослых животных. Напротив, высокая смертность может наблюдаться у молодых животных из-за миокардита. После заражения инкубационный период может составлять от 2 до 21 дня, в зависимости от вида, инфекционной дозы, серотипа и штамма, в среднем от 3 до 8 дней [2]. Инфицированные животные могут выделять большое количество вируса до того, как проявятся клинические признаки [3]. У инфицированных животных могут появиться волдыри и язвы во рту, на языке, губах, ногах и вымени; они теряют вес и перестают производить молоко, что приводит к серьезным производственным потерям [4].

Выделяют семь следующих серотипов вируса ящура: O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и Азия-1, при этом представители серотипа Азия-1 являются довольно распространенными, особенно в странах Азии, что определяет актуальность изготовления вакцин для защиты от ящура данного серотипа.

Вирус существует в виде семи серотипов и многочисленных генотипов, и в полевых условиях возбудитель ящура продолжает эволюционировать, приводя к появлению новых штаммов, которые вызывают периодические всплески числа случаев и увеличивают риск распространения в новые районы.

Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности высоковариабельного гена 1D, который кодирует аминокислотную последовательность поверхностного белка VP₁ [1]. Учитывая, что возбудитель ящура является РНК-содержащим вирусом, для него характерно образование большого количества мутаций во время репликации вирусного генома (преимущество в 5´-участке) и явление рекомбинации (преимущественно в 3´-участке). Именно по этой причине в пределах серотипов выделяют более 60 генетических линий и сублиний [2]. Восстановление после переболевания животным каким-либо одним серотипом не обеспечивает иммунную защиту против другого серотипа и даже некоторых других генетических линий [3].

Существует глобальная кластеризация вирусов ящура, и они были разделены на семь вирусных пулов, в которых встречается множество серотипов, но внутри которых есть топотипы или генетические линии, которые остаются в основном ограниченными этим пулом. Три пула охватывают Европу, Ближний Восток и Азию; три пула охватывают Африку; и один пул охватывает Америку (фиг. 1) [5]. Это позволяет осуществлять глобальную борьбу с ящуром на региональном уровне. Расширение региональных знаний о вспышках ящура и их выявление в конкретных резервуарах или пулах активности ящура может в значительной степени способствовать глобально информированным региональным программам борьбы с ящуром. Такой подход также позволяет быстро идентифицировать перемещение вирусов из их локального пула и их проникновение в другие пулы.

Поскольку вакцинация используется в качестве основного инструмента контроля в эндемичных районах, анализ каждого пула и генотипов в нем может подобрать наиболее специфичные вакцины, соответствующих топотипам, присутствующим в этом пуле, вместо того, чтобы продолжать полагаться на более широко доступные в настоящее время генетические вакцины.

По данным WRLFMD (Всемирная справочная лаборатория ящура) в серотип Азия-1 вируса ящура входят 8 охарактеризованных генетических линий G-I, G-II, G-III, G-IV, G-V, G-VI, G-VIII, Sindh-08 и некоторые изоляты, которые в настоящее время еще не отнесли ни к одной линии. Подразделения на сублинии не отмечается в настоящее время [3].

Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа Азия-1 и, в частности, генотипа Азия-1/G-V, представители которого распространяются на территории Азиатских странах. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении ящура генотипа Азия-1/G-V.

С целью недопущения возникновения ящура в хозяйствах Российской Федерации применяется комплекс мероприятий по борьбе и профилактике ящура, который направлен на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую вакцинацию животных в буферной зоне, проведение мониторинга иммунного статуса крупного, мелкого рогатого скота и свиней.

Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам, что подтверждено исследованиями многих ученых [6, 7, 8, 9, 10, 11].

Данная инфекция продолжает оставаться экономически значимой проблемой. Цельновирионные вакцины на сегодняшний день в отношении ящура по-прежнему признаются наиболее эффективными, что крайне важно для борьбы с самым контагиозным заболеванием в мире [8, 9, 12, 13].

Для проведения эффективной кампании по вакцинации нужно наличие эффективной и безопасной вакцины, содержащей в качестве иммуногенной составляющей антиген вируса, соответствующей эпизоотическому распространяющемуся изоляту определенного генотипа. Создание подобных вакцин по-прежнему является крайне актуальной задачей. Достижение данной цели позволит эффективно применять вакцину в неблагополучных регионах и угрожаемой зоне для формирования иммунитета против конкретного генотипа вируса ящура с целью обеспечения ветеринарного благополучия [14, 15, 16].

На территории Юго-Восточной, Южной, Восточной Азии вспышки ящура генотипа Азия-1/G-V теперь имеют спорадический характер. Следует отметить, что в последние годы усилились торгово-экономические связи России со странами этого региона, в частности, Монголии, Китая, Индии и др. Исходя из этого, крайне высоки риски заноса изолятов данного генотипа на территорию Российской Федерации, что угрожает биологической безопасности нашей страны по ящуру.

На протяжении многих лет периодически фиксировали вспышки ящура генотипа Азия-1/G-V в странах Азии, в частности, в Индии в 2007, 2010 гг., Республике Союз Мьянма в 2005, 2009, 2017 гг. В настоящее время изоляты данного генотипа по-прежнему циркулируют среди поголовья скота по причине недостаточной экстренной вакцинации животных. Наличие тесных торговых отношений Российской Федерации с этими государствами является угрожающим фактором в отношении распространения возбудителя ящура на территории нашей страны и требует исследования штаммов данного генотипа для создания средств диагностики и специфической профилактики ящура генотипа Азия-1/G-V.

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа Азия-1, которые применяются или использовались ранее в мире для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «Asia1/AFG 1/2001» (генотип Азия-1/G-I),

- штамм «Asia1/IRN/10/2004» (генотип Азия-1/G-II),

- штамм «Asia1/IND/762-03» (генотип Азия-1/G-III),

- штамм «Asia1/HKN/19/1974» (генотип Азия-1/G-IV),

- штамм «Asia1/IND/18/80» (генотип Азия-1/G-V),

- штамм «Asia1/IND/14/95» (генотип Азия-1/G-VI),

- штамм «Asia1/BAR/8/2009» (генотип Азия-1/G-VIII),

- штамм «Азия-1 №2356/14/2018» (генотип Азия-1/ASIA/Sindh-08).

Изолят вируса ящура был выделен в результате лабораторно-диагностических исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из патологического материала, отобранного от крупного рогатого скота на территории Тамбовского района Амурской области РФ в феврале 2006 г. При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» был охарактеризован и получил название - штамм «Азия-1/G-V/2006».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу Азия-1/G-V вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1, в том числе, от штамма «Asia1/IND/18/80» (прототип) (Фиг. 2).

По причине значительного увеличения торгово-экономических взаимоотношений между Россией и странами Азии, в которых стабильно регистрируют вспышки ящура генотипа Азия-1/G-V, возникает опасность новых случаев возникновения ящура в Российской Федерации и особое значение приобретает проблема возможной экстренной профилактики данного заболевания для формирования иммунитета у восприимчивых животных. Таким образом, возникла необходимость разработать вакцину против ящура генотипа Азия-1/G-V из штамма «Азия-1/G-V/2006» культуральную инактивированную эмульсионную для обеспечения биологической безопасности и ветеринарного благополучия территории Российской Федерации, сопредельных государств и стран, эндемичных по ящуру, которые будут использовать данный препарат для профилактики заболевания.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина для ранней защиты против ящура типа Азия-1 инактивированная эмульсионная (штамм «Азия-1 №2356/14/2018», генотип Азия-1/ASIA/Sindh-08) [17], содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма «Азия-1 №2356/14/2018», полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG («Seppic», Р. Франция): концентрация антигена (инактивированные 146S+75S компоненты вируса ящура) не менее 3,0 мкг/см³, содержание масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG - 50% по массе, добавка в виде поддерживающей среды - до 1,0 см³ (прототип).

В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую клеточную линию почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17, в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла DMEM без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,45-7,65.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). При изготовлении эмульсионной вакцины в качестве адъюванта служит масляный адъювант Montanide ISA-206 VG («Seppic», Р. Франция). Очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей осуществляют с применением полигексаметиленгуанидин гидрохлорида (ПГМГ).

Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его низкой иммуногенной активности относительно появившихся штаммов/изолятов вируса ящура генотипа Азия-1/G-V.

Для решения указанной проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка вакцины против ящура генотипа Азия-1/G-V из штамма «Азия-1/G-V/2006» культуральной инактивированной эмульсионной. Данная вакцина предполагает высокое содержание 146S иммуногенного компонента в дозе препарата [17, 18].

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала противоящурных инактивированных культуральных эмульсионных вакцин для защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура серотипа Азия-1 и, в частности, генотипа Азия-1/G-V.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ящура генотипа Азия-1/G-V из штамма «Азия-1/G-V/2006» культуральной инактивированной эмульсионной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.

Разработанная вакцина в 1,0 см³ препарата содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «Азия-1/G-V/2006» (генотип Азия-1/G-V) вируса ящура, репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 6,0 мкг; 2) масляный адъювант DMIXVAC 406 V («Дмитриевский химический завод», РФ), обеспечивающий усиление иммунного ответа у животных с содержанием 50% по массе, 3) поддерживающая среда - до 1,0 см³.

Штамм вируса ящура «Азия-1/G-V/2006» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №443 - деп / 22-77 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным монослойным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы предпочтительно используют перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применяют среду Хэнкса без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 5,0% от общего объема при рН среды 7,40-7,72. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,028% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,025% от общего объема.

Авирулентный и очищенный антиген штамма «Азия-1/G-V/2006» (генотип Азия-1/G-V) вируса ящура представляет собой суспензию, содержащую инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура. Концентрацию компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [19, 20].

Для создания вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1,0 см³ не менее 6,0 мкг инактивированных иммуногенных 146S частиц вируса ящура. Заявленную концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall.

Вакцину против ящура генотипа Азия-1/G-V из штамма «Азия-1/G-V/2006» культуральную инактивированную эмульсионную получают путем смешивания очищенного антигена и масляного адъюванта DMIXVAC 406 V в соотношении 50% на 50% по массе, соответственно. Полученная вакцина представляет собой стабильную сложную эмульсию (вода в масле в воде, фиг. 3) белого или бледно-розового цвета, содержащую инактивированный 146S компонент вируса ящура, который обеспечивают формирование специфического иммунитета.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ящура генотипа Азия-1/G-V из штамма «Азия-1/G-V/2006» культуральная инактивированная эмульсионная.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антиген штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антиген штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура, полученный в суспензионной перевиваемой клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антиген штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура, полученный в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 6,0 мкг в 1,0 см³ готового вакцинного препарата.

3. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант DMIXVAC 406 V.

4. Вакцина содержит масляный адъювант DMIXVAC 406 V в количестве 50% (по массе) в 1,0 см³ готового препарата.

5. Авирулентный и очищенный антиген штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура, полученного в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, масляный адъювант DMIXVAC 406 V, добавка в готовом препарате в виде поддерживающей среды в следующих количествах:

Авирулентный и очищенный антиген штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа
Азия-1/G-V вируса ящура не менее 6,0 мкг/см³ Масляный адъювант DMIXVAC 406 V 50% (по массе) Поддерживающая среда до 1,0 см³

Предлагаемая вакцина против ящура из штамма
«Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V культуральная инактивированная эмульсионная обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против изолятов вируса ящура генотипа Азия-1/G-V.

Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной эмульсионной вакцины в качестве активного вещества введен антиген штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против изолятов вируса ящура представленного генотипа, которые в последние годы вызывают вспышки в мире.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1 - Глобальная ситуация с ящуром и положение вирусных пулов. https://www.oie.int/app/uploads/2021/05/fmd-world-eng.png (дата обращения 13 сентября 2023 года). Источник: Всемирная организация охраны здоровья животных (ВОЗЖ).

Фиг. 2 - Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа О. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VР₁.

Фиг. 3 - Модель сложной эмульсии («вода в масле в воде»).

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена белка VР₁ штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура генотипа Азия-1/G-V;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот 1D-гена белка VР₁ штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура генотипа Азия-1/G-V.

Штамм «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура имеет следующую таксономию: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип Азия-1, генотип Азия-1/G-V. Штамм возбудителя обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 25 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура относится к серотипу Азия-1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой, не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются специфические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура принадлежит к генотипу Азия-1/G-V (Фиг. 2).

Антигенное родство (r₁) штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура изучено в реакции микронейтрализации вируса, в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм «Asia1/AFG 1/2001» (генотип Азия-1/G-I),

- штамм «Asia1/IRN/10/2004» (генотип Азия-1/G-II),

- штамм «Asia1/IND/762-03» (генотип Азия-1/G-III),

- штамм «Asia1/HKN/19/1974» (генотип Азия-1/G-IV),

- штамм «Asia1/IND/18/80» (генотип Азия-1/G-V),

- штамм «Asia1/IND/14/95» (генотип Азия-1/G-VI),

- штамм «Asia1/BAR/8/2009» (генотип Азия-1/G-VIII),

- штамм «Азия-1 №2356/14/2018» (генотип Азия-1/Sindh-08).

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа Азия-1, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7, 8, 9].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;

при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.

Максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящимся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «Азия-1/G-V/2006» составили r₁ от 0,01 до 0,28, а именно:

- штамм «Asia1/AFG 1/2001» (генотип Азия-1/G-I) - 0,12,

- штамм «Asia1/IRN/10/2004» (генотип Азия-1/G-II) - 0,14,

- штамм «Asia1/IND/762-03» (генотип Азия-1/G-III) - 0,17,

- штамм «Asia1/HKN/19/1974» (генотип Азия-1/G-IV) - 0,19,

- штамм «Asia1/IND/18/80» (генотип Азия-1/G-V) - 0,28,

- штамм «Asia1/IND/14/95» (генотип Азия-1/G-VI) - 0,04,

- штамм «Asia1/BAR/8/2009» (генотип Азия-1/G-VIII) - 0,01,

- штамм «Азия-1 №2356/14/2018» (генотип Азия-1/Sindh-08) - 0,09.

что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа Азия-1.

Гено- и хемотаксономические характеристики

Штамм «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,085×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,86×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех структурных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,0% РНК и 69,0% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса, в том числе такой важный фермент как РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,46×10^-18 г. Плавучая плотность 1,48 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «Азия-1-1/G-V/2006» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,40-7,72. Сдвиги pH в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,5°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного генотипом Азия-1/G-V, и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки новой безопасной и эффективной вакцины.

Получена безопасная и эффективная вакцина против ящура генотипа Азия-1/G-V из штамма «Азия-1/G-V/2006» культуральная инактивированная эмульсионная.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Генетическая характеристика штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура по данным ПЦР и нуклеотидного секвенирования.

Проводили анализ первичной структуры гена 1D (белок VP₁) (633 н.о.) штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определении положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура серотипа Азия-1. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (белок VP₁) испытуемого изолята/штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами/штаммами (11 представителей) вируса ящура серотипа Азия-1.

Было необходимо провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP₁ вируса ящура вакцинного штамма «Азия-1/G-V/2006» с другими изолятами и штаммами. Последовательность нуклеотидов гена белка VР₁ штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура представлена SEQ ID NO:1. Последовательность аминокислот 1D-гена, кодирующего белок VР₁ штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура отражена на SEQ ID NO:2.

Осуществлен филогенетический анализ для штамма «Азия-1/G-V/2006». Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA 6 и алгоритма Neighbor-Joining [21]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (увеличили со стандартных 100 до 1000 повторов для высокой степени достоверности), показан рядом с ветвями [22, 23]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [24] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 11 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность 1D-гена штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 633 позиций. Эволюционный анализ проводился в MEGA 6 [25].

В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP₁) штамма «Азия-1/G-V/2006» и других изолятов/штаммов вируса ящура серотипа О определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг. 2). Таким образом, исследуемый штамм «Азия-1/G-V/2006» относится к генотипу Азия-1/G-V, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Пример 2. Адаптация штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V к перевиваемой монослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30.

Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30 использовали 10%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт свиньи (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,20-0,25 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,001 ТЦД₅₀/кл. По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 16-18 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 6,25±0,10 до 8,00±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (8,00±0,10 lg ТЦД₅₀/см³). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,50±0,02 до 1,80±0,02 мкг/см³. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (1,80±0,02 мкг/см³). Степень достоверности (R²) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 98,38 до 100,00%. Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура к перевиваемой монослойной клеточной линии ПСГК-30.

Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V в промышленных масштабах.

В процессе промышленного культивирования штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса по поддерживающей среде, температурному фактору и дозе заражения исследуемым вирусом клеток.

На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 в масштабах производства (на этапе с 5-го на 6-ой пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2,0% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла DМЕМ; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хэнкса. Посевная концентрация клеток составляла 0,20 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,1000-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,2 - 38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя не менее 85%. Результаты репродукции штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 1.

Из данных таблицы видно, что при репродукции штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Хэнкса, позволяющая за 17-18 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 1,90±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности 8,15±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. При использовании среды RPMI-1640 и Игла DMEM показатели репродукции вируса были ниже.

На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в среде Игла DМЕМ с 2% сыворотки КРС при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 85-100% в течение 17-30 ч (табл.1). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой за 17-18 ч развитие ЦПД достигало 95-100% с накоплением 146S частиц, равным 1,90±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности вируса 8,15±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии ПСГК-30 штаммом «Азия-1/G-V/2006» при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД₅₀/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду Игла МЕМ с 2% сыворотки крови КРС. Репродукцию вируса проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 17-28 ч до специфического разрушения клеток на 85-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 1, наибольшее накопление 146S компонента вируса достигалось при дозе заражения 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл. и составило 1,90±0,02 мкг/см³ с титром инфекционной активности вируса 8,15±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры репродукции штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура в монослойной клеточной линии ПСГК-30: 1) поддерживающая среда - среда Хэнкса; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом - 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура в промышленных масштабах.

При промышленном культивирования штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температурные условия и дозу заражения вирусом.

На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 млн кл./см³. Водородный показатель рН поддерживали в диапазоне 7,42-7,72. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,02°С, доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%, которая осуществлялась в течение 9-20 ч. Результаты суспензионного культивирования штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 2.

Как следует из таблицы 2, при культивировании вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 2,5 млн кл./см³ составило 0,98±0,02 мкг/см³, с концентрацией 3,0 млн кл./см³ - 1,85±0,02 мкг/см³, с концентрацией 3,5 млн кл./см³ - 3,85±0,02 мкг/см³, и с концентрацией 4,0 млн кл./см³ - 4,20±0,02 мкг/см³. Как следует из полученных данных для репродукции штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура достаточной является концентрация клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 3,5 млн кл./см³ (при концентрации 4,0 млн кл./см³ концентрация незначительно выше, но затраты на производство по количеству клеток выше, исходя из этого, экономически целесообразно использовать концентрацию клеток, равную 3,5 млн кл./см³). Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 10,50±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

На следующем этапе работы исследовали влияние температурного фактора на репродукцию штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура в суспензионной культуре клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Водородный показатель рН вирусной суспензии поддерживали в том же диапазоне. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного не менее 85% (приоритет отдавали полной специфической деструкции клеток), в течение 9-20 ч. По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой в течение 9-10 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (3,85±0,02 мкг/см³) и титром инфекционной активности вируса 10,50±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

В ходе работы по изучению условий суспензионного культивирования штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С в течение 9-20 ч до цитопатического действия, равного не менее 90%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура. Как видно из данных таблицы 2, наибольшее накопление 146S компонента отмечали при дозе заражения 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. (3,85±0,02 мкг/см³) с титром инфекционной активности вируса, равным 10,50±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение трех параметров суспензионного культивирования штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Выявлены оптимальные условия репродукции штамма «Азия-1/G-V/2006» в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH: 1) концентрация клеток перед заражением - 3,5 млн кл./см³; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V.

По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования (37,0±0,2°С), в вируссодержащую суспензию добавляли подкисленный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с рН, равным 8,2-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,028%. Инактивацию инфекционной активности вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V проводили в течение 12 часов при температуре 37,0±0,1°С и рН 7,45-7,72 с периодическим перемешиванием.

Для определения времени полной инактивации после добавления 1,2-АЭЭИ каждый час производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 3, из данных которой видно, что полная инактивация вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006», репродуцированного в культиваторах, произошла через 6 часов после внесения 1,2-АЭЭИ.

Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в РСК для оценки содержания в них компонентов вируса. Концентрация 146S компонента составила 3,79±0,02 мкг/см³, а 146S+75S компонента - 4,71±0,02 мкг/см³.

Пример 6. Подбор условий очистки суспензии вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V.

Суспензию вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V, полученную при репродукции в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали инактивации и очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,020, 0,025 и 0,030%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» в количественном варианте РСК определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов. Результаты анализа отражены в таблице 4, из которой следует, что в результате очистки антигена вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» с помощью ПГМГ в концентрации 0,020% отмечали снижение концентрации балластного белка на 15%, иммуногенных компонентов - на 1,8%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,025% наблюдали снижение количества балластного белка на 40%, 146S компонента - на 2,5%. Применяя ПГМГ в концентрации 0,030% содержание балластного белка уменьшалось на 45%, а иммуногенных компонентов - на 12%.

Таким образом, исследуя условия очистки антигена штамма «Азия-1/G-V/2006», пришли к выводу о том, что для получения очищенного продукта оптимально использовать ПГМГ с концентрацией 0,025%.

Пример 7. Подбор условий концентрирования суспензии антигена штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура генотипа Азия-1/G-V.

Культуральную инактивированною суспензию штамма «Азия-1/G-V/2006», полученную с применением суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 7 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч; 3) концентрирование с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall в течение 4 ч при рабочем давлении на фильтр 2,2-2,3 атм.

До и после процесса концентрирования суспензии антигена вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 5, из которой видно, что при концентрировании антигена штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 5,5 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 6,2 раз. Применяя метод концентрирования с помощью тангенциальной фильтрации, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура в суспензии в 7,0 раз. Таким образом, технология танценциальной фильтрации позволила получить антиген штамма «Азия-1/G-V/2006» с высокой концентрацией структурных вирусных белков.

Пример 8. Подбор адъюванта и соотношения антиген-адъювант.

Для изготовления противоящурной моновалентной эмульсионной вакцины из антигена штамма «Азия-1/G-V/2006» в качестве адъюванта использовали масляный адъювант DMIXVAC 406 V в количестве 50% по массе.

Пример 9. Компоновка вакцины против ящура из штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V культуральной инактивированной эмульсионной.

Из полученного концентрата антигена вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» изготовили вакцину против ящура генотипа Азия-1/G-V культуральную инактивированную эмульсионную с применением в качестве масляного адъюванта - DMIXVAC 406 V. Количество 146S иммуногенного компонента в 1,0 см³ антигена составило 25,90±0,02 мкг/см³ (табл. 5).

Пример 10. Иммунизация животных вакциной против ящура из штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V культуральной инактивированной эмульсионной.

Из полученной вакцины против ящура из штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) был приготовлен ряд разведений для свиней с 5-ти кратным шагом. 15 голов свиней разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см³. Первую группу животных (№№ 1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу свиней (№№ 6-10) привили вакциной, разведенной 1/5, третья группа животных (№№ 11-15) - вакциной, разведенной 1/25. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи. В качестве контроля вируса оставили 2 головы без вакцинации.

Пример 11. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура.

Сыворотки крови от свиней, полученные до иммунизации и через 14 суток после иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (ВОЗЖ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «Prio CHECK^®FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 6, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови свиней < 50%).

Пример 12. Оценка авирулентности и безвредности вакцины против ящура из штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение).

Для определения авирулентности вакцины для свиней, отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см³. В исследовании использовали свиней массой 30-40 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.

Контроль безвредности продукта на животных проводили путём внутримышечного введения вакцины в дозе 6,0 см³ (тройная доза по 2,0 см³). Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации температура тела животного может повышаться до 40,2⁰С и удерживаться на этом уровне в течение 1-2 суток, что не выходит за рамки нормы после введения вакцинного препарата.

По результатам исследований вакцина против ящура из штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V культуральная инактивированная эмульсионная (предлагаемое изобретение) была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.

Пример 13. Изучение иммуногенных свойств вакцины против ящура из штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) по способности индуцирования вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных.

На 21 сутки после введения вакцины против ящура из штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) у свиней отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации [3]. Выявлено, что у свиней, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител составили 9,30±0,27 log₂ SN₅₀, с разведением 1/5 (5 голов) - 4,75±0,18 log₂ SN₅₀, с разведением 1/25 (5 голов) - 3,45±0,27 log₂ SN₅₀ (табл.7). Полученные данные реакции микронейтрализации свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log₂ SN₅₀), что соответствует требованиям международных стандартов [3].

Пример 14. Контрольное заражение естественно восприимчивых животных. Изучение защитной способности вакцины против ящура из штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) на естественно восприимчивых видах животных.

Свиней в количестве 15 голов, иммунизированных вакциной в цельном виде и в разведениях, заражали контрольным штаммом «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура, адаптированного к этим животным в дозе 10^4,0 ИД₅₀/0,20 см³ (в две точки по 0,10±0,05 см³). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.

Результаты контрольного заражения представлены в таблице 7, из которой следует, что вакцина против ящура из штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V культуральная инактивированная эмульсионная (предлагаемое изобретение) в цельном виде и в разведении 1/5, введенная в однократной дозе (2,0 см³) защищает свиней от заражения гомологичным штаммом всех животных (5 из 5 голов). А в разведении 1/25 из пяти свиней у одной отмечались признаки ящура.

По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 40,516 ПД₅₀ и 0,049 ИмД₅₀ для свиней.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина против ящура генотипа Азия-1/G-V из штамма «Азия-1/G-V/2006» культуральная инактивированная эмульсионная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как резервная для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура серотипа Азия-1, генотипа Азия-1/G-V. Кроме того, вакцина против ящура генотипа Азия-1/G-V из штамма «Азия-1/G-V/2006» культуральная инактивированная эмульсионная изготовлена с применением масляного адъюванта DMIXVAC 406 V отечественного производства («Дмитриевский химический завод», РФ, г. Кинешма).

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина против ящура генотипа Азия-1/G-V из штамма «Азия-1/G-V/2006» культуральная инактивированная эмульсионная»:

1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru/directions/epid_nadzor/146902 (Дата обращения: 15.08.2023).

2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 14.08.2023).

3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2022 - Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

4. Бурдов А. Н., Дудников А. И., Малярец П. В. и др. Ящур. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.

5. Пономарев А. П., Узюмов В. Л., Груздев К. Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp. 2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p. 13-21.

8. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J. M. Pachecoa, Т. Doel [et.al.] // Vaccine. - December 2005. - V. 23. - P. 5775-5782.

9. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

11. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_reports.htm (Дата обращения 19.07.2023).

12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - Р. 746-754.

13. Рахманов А.М. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля //Ветеринарная медицина мiжвiд. тем. наук. Харкiв, 2013. - С. 37-38.

14. Longjam N., Tayo T. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol. 4(10). - P. 475-479.

15. Мельник Р.Н., Хаустова Н.В., Мельник Н.В., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов/ Ветеринария и кормление. - 2019. - №3. - С.29-31.

16. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston B. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy/ Phil. Trans. R. Soc. B (2009) 364. - P. 2657-2667.

17. Патент РФ №2741639 Вакцина для ранней защиты против ящура типа Азия-1 инактивированная эмульсионная / Заявка №2020119505 от 05.06.2020 г., бюл. №4 от 28.01.2021 г.

18. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

19. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.

20. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.

21. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-42.

22. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791.

23. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

24. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.

25. Barnett P. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2002. - V. 25. - P. 345-364.

Таблица 1

Результаты адаптации штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура при культивировании в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 в разных условиях

(n=3, M±m, p<0,01)

Параметр Условия культивирования Время репродукции, ч ЦПД, % Концентрация 146S частиц по данным
ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см³ Титр инфекционной активности, lg ТЦД₅₀/см³ Состав поддерживающей среды Среда Игла DМЕМ+ 2% S_КРС 23-24 95-100 0,99±0,02 6,87±0,10 Среда RPMI-1640 + 2% S_КРС 25-26 95-100 0,89±0,02 6,50±0,10 Раствор Хэнкса с 5 % ГБК +
2% S_КРС 17-18 95-100 1,90±0,02 8,15±0,10 Температура, °С 35,0±0,2 29-30 85-90 0,45±0,02 5,39±0,10 36,0±0,2 21-23 85-90 1,02±0,03 6,95±0,10 37,0±0,2 17-18 95-100 1,90±0,02 8,15±0,10 38,0±0,2 20-21 90-95 0,90±0,02 6,50±0,10 Доза заражения 0,1-0,01 22-24 90-95 1,10±0,02 7,08±0,10 0,01-0,001 17-18 95-100 1,90±0,02 8,15±0,10 0,001-0,0001 26-28 85-90 0,45±0,02 5,40±0,10

Примечание: S_КРС - сыворотка крови крупного рогатого скота,

ГБК - гидролизат белков крови,

DМЕМ - название среды Игла,

RPMI-1640 - название культуральной среды,

ЦПД - цитопатическое действие.

Таблица 2

Результаты репродукции штамма «Азия-1/G-V/2006» вируса ящура в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разной концентрацией клеток

(n=3, M±m, p<0,01)

Параметр Условия культивирования Время репродукции, ч ЦПД, % Концентрация 146S частиц по данным
ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см³ Титр инфекционной активности, lg ТЦД₅₀/см³ Концентрация клеток перед заражением,
млн кл./см³ 2,5 9-10 95-100 0,98±0,02 7,00±0,10 3,0 9-10 95-100 1,85±0,02 8,15±0,10 3,5 9-10 95-100 3,85±0,02 10,50±0,10 4,0 11-12 95-100 4,20±0,02 10,89±0,10 Температура, °С 35,0±0,2 19-20 85-90 0,80±0,02 6,49±0,10 36,0±0,2 13-15 85-90 2,00±0,02 8,40±0,10 37,0±0,2 9-10 95-100 3,85±0,02 10,50±0,10 38,0±0,2 13-15 95-100 1,85±0,02 8,10±0,10 Доза заражения 0,1-0,01 13-14 95-100 1,80±0,02 8,04±0,10 0,01-0,001 9-10 95-100 3,85±0,02 10,50±0,10 0,001-0,0001 19-20 90-95 2,13±0,02 8,56±0,10

Примечание: ОТ-ПЦР-РВ - обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция,

ТЦД - тканевая цитопатическая доза,

ЦПД - цитопатическое действие.

Таблица 3

Исследование кинетики инактивации суспензии вируса ящура штамма
«Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V

(n=3, M±m, p<0,05)

Время отбора проб с момента инактивации, ч Титр инфекционной активности вируса ящура, lg ТЦД₅₀/см³ 0 10,50±0,10 1 8,05±0,10 2 6,00±0,10 4 4,00±0,10 5 1,95±0,10 6 0 12 0

Таблица 4

Содержание компонентов штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура в суспензиях до и после очистки

(n=3, M±m, p<0,005)

До очистки Условия очистки После очистки концентрация балластного белка, мг/см³ концентрация иммуногенных компонентов, мкг/см³ концентрация балластного белка, мг/см³ концентрация иммуногенных компонентов, мкг/см³ 146S компонент 146S+75S компоненты 146S компонент 146S+75S компоненты 9,40±0,10 3,79±0,02 4,71±0,02 ПГМГ,
0,020% 7,99±0,05 3,72±0,02 4,63±0,02 ПГМГ, 0,025% 5,64±0,05 3,70±0,02 4,59±0,02 ПГМГ,
0,030% 5,17±0,05 3,34±0,02 4,15±0,02

Примечание: концентрацию балластного белка определяли по формуле Калькара:

С=1,45 × А₂₈₀-0,74 × А₂₆₀,

где А₂₈₀ - значение оптической плотности при длине волны 280 нм,

А₂₆₀ - значение оптической плотности при длине волны 260 нм,

ПГМГ - полигексаметиленгуанидин (флокулянт).Таблица 5

Содержание компонентов антигена штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура в суспензиях до и после концентрирования

(n=3, M±m, p<0,01)

Концентрация компонентов до концентрирования, мкг/см³ Методы концентрирования
(в 5 раз) Концентрация компонентов после концентрирования, мкг/см³ ОВБ 146S компонент 146S+75S компонент ОВБ 146S компонент 146S+75S компонент 4,73±0,02 3,70±0,02 4,59±0,02 ПЭГ-6000,
4 ч 26,02±0,02 20,35±0,02 25,25±0,02 ПЭГ-6000,
12 ч 29,33±0,02 22,94±0,02 28,46±0,02 Тангенциальная фильтрация,
4 ч 33,11±0,02 25,90±0,02 32,13±0,02

Примечание: ПЭГ - полиэтиленгликоль,

ОВБ - общий вирусный белок.

Таблица 6

Результаты исследования сывороток крови свиней на антитела к неструктурным белкам вируса ящура до и после вакцинации препаратом (предлагаемое изобретение), изготовленным с применением антигена вируса ящура штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V

№ жив-го п/п Значение оптической плотности пробы Процент ингибиции (PI), % тип образца референс-значения до вакцинации на 14 сутки после вакцинации тип образца референс-значения до вакцинации на 14 сутки после вакцинации СПК 0,412 -//- СПК 59,127 -//- ПК 0,053 ПК 94,742 ОК 1,008 ОК 0,000 1 -//- 0,899 0,823 -//- 10,813 18,353 2 0,896 0,822 11,111 18,452

Примечание: СПК - слабоположительный контроль,

ПК - положительный контроль,

ОК - отрицательный контроль, сыворотка отрицательная при PI, меньшим 50%

Таблица 7

Исследование гуморального иммунитета и иммуногенной активности вакцины против ящура из штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V культуральной инактивированной эмульсионной на свиньях

(n=5, p<0,01, M±m)

Наименование штамма для контрольного заражения Разведение вводимой вакцины № животных п/п Титр антител в РМН, log₂ SN₅₀ Результаты контрольного заражения ИмД₅₀/ПД₅₀ Азия-1/G-V/2006 без разведения 1 9,50 ─ 0,049/40,516 2 9,50 ─ 3 9,50 ─ 4 9,00 ─ 5 9,00 ─ M±m 9,30±0,27 0/5 1/5 6 4,75 ─ 7 4,75 ─ 8 4,50 ─ 9 4,75 ─ 10 5,00 ─ M±m 4,75±0,18 0/5 1/25 11 3,50 ─ 12 3,75 ─ 13 3,50 ─ 14 3,00 + 15 3,50 ─ M±m 3,45±0,27 1/5 контроль 1 ─ + контроль 2 ─ +

Примечание: «-» - отсутствие генерализации процесса ящура,

«+» - наличие генерализации процесса ящура,

РМН - реакция микронейтрализации,

ИмД₅₀ - иммуногенная доза,

ПД₅₀ - протективная доза.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="Vaccine

FMD-Asia1.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-10-16">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-10-16</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>547</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-10-16</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Вакцина против ящура генотипа

Азия-1/G-V из штамма «Азия-1/G-V/2006» культуральная

инактивированная эмульсионная</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>633</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..633</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>actaccaccactggcgagtccgcggacccagtaaccaccacggttgaga

actacggaggagagacccaaacggcccgacggcttcacactgatgtcgccttcgttctcgacaggttcgt

gaaactcacccagcccaagagcacccaaacccttgatctcatgcagatcccttcacacacactggtcggg

gcgcttctccggtctgcgacgtactacttctcagacctggaggttgcgctcgtccacacaggaccggtca

catgggtgcccaatggtgcgcccaagaccgccttgaacaaccacaccaacccgactgcctaccagaagca

gcccatcacccgcttggcactcccctacactgctccccaccgtgtgctgtcaacagtgtacaacgggaag

acaacgtacggagaagaatcctcgcggcgtggtgatcttgccgcccttgcacacagagtgaacaaccggc

tgcccacttccttcaactacggcgctgtgaaggccgacaccatcacggagctgttgatccgcatgaagcg

tgcggaaacatactgccccaggcctctgctggctcttgacaccacacaagaccgccgtaaacaggagatc

attgcacctgagaaacagactttg</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>211</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..211</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTTTGESADPVTTTVENYGGETQTARRLHTDVAFVLDRFVKLTQPKSTQ

TLDLMQIPSHTLVGALLRSATYYFSDLEVALVHTGPVTWVPNGAPKTALNNHTNPTAYQKQPITRLALPY

TAPHRVLSTVYNGKTTYGEESSRRGDLAALAHRVNNRLPTSFNYGAVKADTITELLIRMKRAETYCPRPL

LALDTTQDRRKQEIIAPEKQTL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана вакцина против ящура культуральная инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество и адъювант. Она содержит в качестве активного вещества авирулентный и очищенный антигенный материал гомологичного возбудителю инфекции штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура. Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала противоящурных инактивированных культуральных эмульсионных вакцин для защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура серотипа Азия-1 и, в частности, генотипа Азия-1/G-V. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 7 табл., 14 пр.

1. Вакцина против ящура культуральная инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество и адъювант, отличающаяся тем, что она содержит в качестве активного вещества авирулентный и очищенный антигенный материал гомологичного возбудителю инфекции штамма «Азия-1/G-V/2006» генотипа Азия-1/G-V вируса ящура, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №443 - деп / 22-77 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 6,0 мкг; в качестве адъюванта отечественный масляный адъювант DMIXVAC 406 V с содержанием 50% по массе и поддерживающую среду до 1,0 см³ готового препарата.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура серотипа Азия-1 в количестве не менее 6,0 мкг в 1,0 см³ готового препарата.