Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к серодиагностике блютанга. По определению МЭБ, вирус блютанга отнесен к особо опасным болезням животных списка А. Согласно классификации Государственного Комитета по эпидемиологическому надзору, возбудитель блютанга относится ко 2-й группе патогенности для человека.
В XX столетии блютанг нанес овцеводству многих стран мира огромный экономический ущерб, больше, чем все другие инфекционные заболевания овец вместе взятые. Особенно проблема блютанга стала актуальной для России после эпизоотии болезни в Республике Бурятия в 1993 году. Учитывая, что в последние годы в странах, имеющих тесные экономические контакты с Россией (Турция, Болгария, Югославия, Голландия и др.) отмечали обширные эпизоотии, вызванные вирусом блютанга, одним из наиболее достоверных способов прижизненного выявления этого возбудителя является серодиагностика, основывающаяся на определении наличия специфических антител в сыворотках крови при их взаимодействии с антигеном вируса блютанга в реакциях связывания комплемента (РСК), реакции диффузионной приципитации (РДП) и при постановке иммуноферментного анализа (ИФА).
Ранее для постановки РСК антиген готовили из ткани мозга хомячков и мышей (Clark D. and Casals J.,1958, B.H.Сюрин, 1966 г.). Впоследствии был разработан способ получения культурального антигена (А.А.Стрижаков, 1997 г.). Культуру клеток ПСГК заражали вирусом блютанга и культивировали в течение 60-62 ч. Затем культуральную жидкость сливали, а инфицированные клетки дважды замораживали-оттаивали, центрифугировали при 3000 об/мин 30 мин и надосадочную жидкость использовали в качестве антигена.
Главным недостатком такого антигена является то, что он содержит инфекционный вирус и использовать его можно только при получении разрешения на работу с микроорганизмами 2 группы патогенности и требует наличия специальных средств защиты, оборудования и соблюдения особой осторожности.
Поэтому целью изобретения является получение инактивированного универсального антигена для серодиагностики, не уступающего по антигенной активности и пригодного к использованию в любых диагностических лабораториях.
Указанная цель достигается тем, что способ получения универсального инактивированного антигена вируса блютанга включает заражение перевиваемой культуры клеток, культивирование инфицированной культуры, осаждение клеток и клеточного дебриса центрифугированием, приготовление лизата клеток, замораживание-оттаивание, при этом лизат клеток обрабатывают 2 раза ультразвуком по 12 мкм в течение 1 мин с интервалом 1 мин, а оставшиеся после центрифугирования осадок дебриса повторно заливают дистиллированной водой, обрабатывают ультразвуком в том же режиме, надосадочные жидкости с антигеном объединяют, затем антиген дважды инактивируют β-пропиолактоном в соотношении 1:1000, при этом сначала при 37° при постоянном перемешивании, затем снова вносят β-пропиолактон в том же соотношении при экспозиции 18 часов +4°С.
Предлагаемый способ приготовления антигена отличается тем, что:
1) для большей деструкции клеток используют ультразвуковую обработку, позволяющую увеличить выход вирусного антигена, связанного с дебрисом клеток;
2) повторная обработка клеточного дебриса, оставшегося в осадке после центрифугирования, позволяет увеличить в 2 раза выход получаемого антигена при использовании того же количества вирусного сырья;
3) применение инактиванта β-пропиолактона позволяет получить инактивированный экологически безопасный антиген, который может широко использоваться в ветеринарной практике для серодиагностики блютанга.
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Суспензионную культуру клеток ПСГК-60 в количестве 10 л с концентрацией клеток 0,7-1,0 млн кл/мл заражали вирусом блютанга с множественностью заражения 0, 01 ТЦД50/кл. Поддерживающая среда - 0,25% ФГМ с 2% сыворотки крупного рогатого скота (КРС). Вирус культивировали при 37°С, поддерживая рН среды в пределах 7,0-7,4 в течение 40-60 часов до появления в суспензии 30% мертвых клеток. После этого клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин 30 мин и готовили лизат инфицированных клеток. С этой целью к осадку добавляли дистиллированную воду до 100 мл, ресуспендировали и замораживали при минус 20°С. После оттаивания обрабатывали ультразвуком 2 раза по 12 мкм в течение 1 минуты с интервалом 1 мин и снова суспензию с клеточным дебрисом замораживали и оттаивали, затем центрифугировали при 4000 об/мин 30 мин. Надосадочную жидкость, содержащую антиген блютанга, отбирали, а к осадку добавляли такое же количество дистиллированной воды, ресуспедировали его и с ним проводили те же операции. Полученный вторичный осветленный лизат объединяли с первым и инактивировали β-пропиолактоном. С этой целью к 200 мл объединенного надосадка лизированных клеток, содержащего антиген вируса блютанга, прогретого до 37°С, вносили 0,2 мл β-пропиолактона и выдерживали при этой температуре 2 ч при постоянном перемешивании. Затем снова вносили β-пропиолактон в том же количестве и выдерживали 18 часов при +4°С. Полноту инактивации антигена проверяли в 3-х последовательных пассажах в чувствительной культуре клеток ПСГК. Полученный антиген не содержал остаточной инфекционности, обладал высокой специфичностью и активностью в реакциях РСК (1:32-1:64), РДП (1:2-1:4), ИФА (1:729-1:2187, табл.).
Пример 2. Суспензионную культуру клеток ВНК-21/13 в количестве 12 л с концентрацией клеток 0,7-1,0 млн кл/мл заражали вирусом блютанга с множественностью заражения 0, 001 ТЦД50/кл. Поддерживающая среда - 0,25% ФГМ с 2% сыворотки КРС. Вирус культивировали в биореакторе емкостью 30 л при 37°С, поддерживая рН среды в пределах 7,0-7,4 в течение 45-55 часов до появления в суспензии 40% мертвых клеток. После чего клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин 30 мин и готовили лизат инфицированных клеток. С этой целью к осадку добавляли дистиллированную воду до 120 мл, ресуспендировали и замораживали при минус 20°С. После оттаивания обрабатывали ультразвуком 2 раза по 12 мкм в течение 1 минуты с интервалом 1 мин и снова суспензию с клеточным дебрисом замораживали и оттаивали, затем центрифугировали при 4000 об/ мин 30 мин. Надосадочную жидкость, содержащую антиген блютанга, отбирали, а к осадку добавляли такое же количество дистиллированной воды, ресуспедировали его и с ним проводили те же операции. Полученный вторичный осветленный лизат объединяли с первым и инактивировали β-пропиолактоном. С этой целью к 240 мл объединенного надосадка лизированных клеток, содержащего антиген вируса блютанга, прогретого до 37°С, вносили 0,24 мл р-пропиолактона и выдерживали при этой температуре 2 ч при постоянном перемешивании. Затем снова вносили β-пропиолактон в том же количестве и выдерживали 18 часов при +4°С. Полноту инактивации антигена проверяли в 3-х последовательных пассажах в элективной культуре клеток ПСГК. Полученный антиген не содержал остаточной инфекционности, обладал высокой специфичностью и активностью в реакциях РСК (1:64-1:128), РДП (1:2-1:4), ИФА (1:2187-1:6561, табл.).
Пример 3. Монослойную культуру клеток CV-1, выращенную в круговом монослое в 20 культуральных сосудах емкостью 3 л, объем заполнения 0,5 л заражали вирусом блютанга с множественностью заражения 0,004 ТЦД50/кл. Поддерживающая среда - Игла (MEM) с 2% КРС. Вирус культивировали при 37°С и 8-12 об/час, поддерживая рН среды в пределах 7,0-7,4 в течение 60 часов до развития 30-35% ЦПД вируса. Затем культуральную среду сливали, монослой клеток замораживали с последующим оттаиванием и после этого из всех бутылей собирали лизат с разрушенными инфицированными клетками. Затем добавляли дистиллированную воду до 100 мл, ресуспендировали и обрабатывали ультразвуком 2 раза по 12 мкм в течение 1 минуты с интервалом 1 мин и снова суспензию с клеточным дебрисом замораживали и оттаивали, затем центрифугировали при 4000 об/мин 30 мин. Надосадочную жидкость, содержащую антиген блютанга, отбирали, а к осадку добавляли такое же количество дистиллированной воды, ресуспендировали его и с ним проводили те же операции. Полученный вторичный осветленный лизат объединяли с первым и инактивировали β-пропиолактоном. С этой целью к 200 мл объединенного надосадка лизированных клеток, содержащего антиген вируса блютанга, прогретого до 37°С, вносили 0,2 мл β-пропиолактона и выдерживали при этой температуре 2 ч при постоянном перемешивании. Затем снова вносили β-пропиолактон в том же количестве и выдерживали 18 ч при +4°С. Полноту инактивации антигена проверяли в 3-х последовательных пассажах в элективной культуре клеток ПСГК. Полученный антиген не содержал остаточной инфекционности, обладал высокой специфичностью и активностью в реакциях РСК (1:64-1:128), РДП (1:2-1:4), ИФА (1:2187-1:6561, табл.).
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
ШТАММ "Г 244/11" ВИРУСА БЛЮТАНГА 14 СЕРОТИПА ДЛЯ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ, ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ | 2013 |
|
RU2528057C1 |
ШТАММ "ТАПХАР" ВИРУСА БЛЮТАНГА FEBRIS INFECTHIOSA CATARHALISS OVIUM, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ | 1995 |
|
RU2077583C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯЩУРНОГО АНТИГЕНА ТИПА О ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ | 2002 |
|
RU2218398C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯЩУРНОГО АНТИГЕНА ТИПА А ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ | 1999 |
|
RU2141116C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ | 2015 |
|
RU2609766C1 |
ИНАКТИВИРОВАННАЯ ЭМУЛЬГИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ БЛЮТАНГА | 2008 |
|
RU2378012C1 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЫВОРОТКИ ДЛЯ СЕРОДИАГНОСТИКИ ЯЩУРА ТИПА О | 2002 |
|
RU2217167C1 |
ШТАММ ВИРУСА ЯЩУРА Aphtae epizooticae ТИПА А ДЛЯ КОНТРОЛЯ АНТИГЕННОЙ И ИММУНОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ И ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ И СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ ЯЩУРА ТИПА А | 2014 |
|
RU2553219C1 |
ШТАММ № 1734 "ПРИМОРСКИЙ-2000" ВИРУСА ЯЩУРА ТИПА О ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ | 2001 |
|
RU2204599C1 |
ШТАММ N 1707 "АРМЕНИЯ-98" ВИРУСА ЯЩУРА ТИПА A ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ВАКЦИННЫХ ПРЕПАРАТОВ | 1999 |
|
RU2140452C1 |
Изобретение относится к области ветеринарии. Способ включает заражение перевиваемой культуры клеток, культивирование инфицированной культуры, осаждение клеток и клеточного детрита центрифугированием, приготовление лизата клеток, замораживание-оттаивание. При этом лизат клеток обрабатывают 2 раза ультразвуком по 12 мкм в течение 1 мин с интервалом 1 мин. Оставшиеся после центрифугирования осадки дебриса повторно заливают дистиллированной водой, обрабатывают ультразвуком в том же режиме. Надосадочные жидкости, содержащие антиген, объединяют. Затем антиген дважды инактивируют β-пропиолактоном в соотношении 1:1000, при этом сначала при 37° при постоянном перемешивании, затем снова вносят β-пропиолактон в том же соотношении при экспозиции 18 часов и температуре +4°С. Полученный инактивированный антиген блютанга обладает высокой специфичностью и активностью (табл.) и может быть использован для серодиагностики в реакциях РСК, РДП и ИФА. 1 табл.
Способ получения универсального инактивированного антигена вируса блютанга, включающий заражение перевиваемой культуры клеток, культивирование инфицированной культуры, осаждение клеток и клеточного дебриса центрифугированием, приготовление лизата клеток, замораживание-оттаивание, отличающийся тем, что лизат клеток обрабатывают 2 раза ультразвуком по 12 мкм в течение 1 мин с интервалом 1 мин, а оставшиеся после центрифугирования осадки дебриса повторно заливают дистиллированной водой, обрабатывают ультразвуком в том же режиме, надосадочные жидкости, содержащие антиген, объединяют, затем антиген дважды инактивируют β-пропиолактоном в соотношении 1:1000, при этом сначала при 37° при постоянном перемешивании, затем снова вносят β-пропиолактон в том же соотношении при экспозиции 18 ч и температуре +4°С.
STOTT J.L | |||
et al | |||
Simple procedure for preparation of bluetongue virus and epizootic haemorrhagic disease virus antigens for agar gel immunodiffusion | |||
- J | |||
Clinical Vicrobibl, 1983, 18, 6, 1310-1313 | |||
СТРИЖАКОВ A.A | |||
и др | |||
Сэндвич-метод твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител для обнаружения антигенов вируса блютанга. |
Авторы
Даты
2009-04-20—Публикация
2007-08-28—Подача