СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЯЩУРНОГО АНТИГЕНА ТИПА А ДЛЯ ИММУНОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/569 A61K39/135 C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при изготовлении диагностических антигенов, служащих для диагностики и изучения эпизоотологии и иммунологии ящура животных.

Размножение вируса ящура в культуре клеток наиболее перспективный и широко применяющийся в нашей стране метод получения больших количеств вируса, необходимых при изготовлении диагностикумов, в том числе антигена - одного из основных компонентов, используемого для постановки любой иммунохимической реакции.

Известно, что вирус ящура хорошо размножается в культуре клеток почек чувствительных животных, в культуре эксплантатов эпителия языка КРС и в некоторых перевиваемых линиях клеток ВНК-21, IBRS-2, IFFA-3, СПЭВ и др. В культуре клеток вирус размножается, как правило, с выраженным ЦПД и накапливается в титре 7-8 Ig ТЦД₅₀/мл (1).

К наиболее часто применяемым при ящуре тестам относятся реакция связывания комплемента (РСК), реакция диффузионной преципитации (РДП), реакция радиальной иммунодиффузии (РРИД), реакция угнетения связывания комплемента (РУСК), реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), реакция энзиммеченых антител (РЭМА).

Известен способ получения антигена типа А для РДП. Антиген готовят в виде 20% вирусной суспензии, которую очищают хлороформом, инактивируют теплом, концентрируют сернокислым аммонием (2).

Недостатком этого способа является то, что антикомплементарность, сообщаемая антигену сульфатом аммония, препятствует возможности его использования в РСК и РУСК.

Известен также способ получения антигена типа А для РУСК. Антиген для РУСК готовят в виде 10% вирусной суспензии, которую очищают хлороформом, инактивируют бетапропиолактоном и концентрируют полиэтиленгликолем (3).

Данный метод дает возможность получить активные и специфичные антигены. Однако указанный способ пригоден только для получения лабораторных образцов, так как он малопроизводителен и трудоемок.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является способ получения ящурного антигена типа А для иммунохимических реакций, включающий репродукцию вирусного антигена в чувствительной системе культивирования, очистку вируссодержащей суспензии хлороформом, инактивацию вируса аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ), концентрирование антигена полиэтиленгликолем (ПЭГ) с последующим высушиванием целевого продукта. В качестве вирусного антигена используют вирус ящура A₂₂ N 550, принятый в качестве производственного штамма (4).

Недостатки способа-прототипа состоят в том, что он не позволяет получить антиген, пригодный для диагностики изолятов вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Закавказья и Ближнего Востока (Иран, Турция) и имеющего антигенные отличия от производственного штамма A₂₂ N 550.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка способа получения антигена, обладающего высокой активностью и специфичностью и пригодного для диагностики изолятов вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Закавказья и Ближнего Востока.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в повышении активности и специфичности антигена.

Указанный технический результат достигнут созданием способа получения ящурного антигена для иммунохимических реакций, охарактеризованного следующей совокупностью признаков:
1) способ получения ящурного антигена для иммунохимических реакций;
2) репродукция вирусного антигена типа А в чувствительной системе культивирования;
3) в качестве вирусного антигена используют штамм N 1707 "Армения-98-ДЕП" вируса ящура типа А, взятый в эффективном количестве;
4) в качестве чувствительной системы культивирования используют перевиваемую культуру клеток ВНК-21;
5) в качестве чувствительной системы используют перевиваемую культуру клеток ПСГК-ЗО;
6) очистка вируссодержащей суспензии 10-20% хлороформа;
7) концентрирование вируса 8-10% ПЭГ;
8) инактивация вируса АЭЭИ в концентрации 0,01-0,05%;
9) высушивание целевого продукта.

Предлагаемое изобретение включает совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана:
1) способ получения ящурного антигена типа А для иммунохимических реакций;
2) репродукция вирусного антигена в чувствительной системе культивирования;
3) в качестве вирусного антигена используют штамм N 1707 "Армения-98-ДЕП" вируса ящура типа А, взятый в эффективном количестве;
4) очистка вируссодержащей суспензии;
5) концентрирование вируса;
6) инактивация вируса:
7) высушивание целевого продукта.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый способ и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются:
1) способ получения ящурного антигена типа А для иммунохимических реакций;
2) репродукция вирусного антигена в чувствительной системе культивирования:
3) очистка вируссодержащей суспензии;
4) концентрирование вируса;
5) инактивация вируса;
6) высушивание целевого продукта.

По сравнению со способом-прототипом существенным отличительным признаком предлагаемого способа является использование в качестве вирусного антигена штамма N 1707 "Армения-98-ДЕП" вируса ящура типа А, взятого в эффективном количестве.

Предлагаемый способ позволяет получить антиген, обладающий высокой активностью и специфичностью. Экспериментально подтверждена возможность его использования в иммунохимических реакциях для диагностики изолятов вируса ящура типа А, циркулирующего в странах Закавказья и Ближнего Востока.

Исходный вирус для получения штамма N 1707 "Армения-98" вируса ящура типа А выделен 01.08.98г. от больных коров в хозяйстве Охчик Амассийского района Республики Армения. Производственный штамма А N 1707 "Армения-98" получен путем многократных последовательных пассажей на чувствительных гетеро- и гомологичных культурах клеток. Штамм А N 1707 по данным РСК, РН и результатам секвенирования участков генома значительно отличается от производственного штамма A₂₂ N 550 (R составило 8-45% соответственно, а степень нуклеотидных различий - 18%), а также от других штаммов вируса ящура типа А, имеющихся в коллекции ВНИИЗЖ. Полученный штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации (ВГНКИ) 12.11.98 г. под регистрационном номером 1707 "Армения-98-ДЕП". Штамм А N 1707 "Армения-98" обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивает получение диагностических препаратов, позволяющих иммунохимическую диагностику изолятов вируса ящура типа А, вызывающего вспышки заболевания в последние годы в странах Закавказья и Ближнего Востока (Иран, Турция).

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, где на: фиг. 1 представлена аминокислотная последовательность белка VP₁ штамма N 1707 "Армения-98" вируса ящура типа А (^* - аминокислота не определена);
фиг. 2 изображена дендрограмма, отражающая структурное сходство участка гена VP₁ штамма N 1707 "Армения-98" вируса ящура типа А с аналогичными фрагментами геномов других штаммов вируса ящура типа А.

Штамм А N 1707 "Армения-98" вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства
Штамм А N 1707 "Армения-98" относится к семейству Picornaviridae, роду Aphtovirus, серотипу А и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона икосаэдрическая, размер 23-25 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. Белковая оболочка состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства
По своим антигенным свойствам штамм А N 1797 "Армения-98" относится к серотипу А. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются антитела, выявляемые в РДП, ИФА, РН. При вакцинации КРС вакциной из инактивированного вируса индуцирует образование специфических антител, выявляемых в ИФА, РДП, РН. При гипериммунизации морских свинок концентрированным инактивированным вирусом индуцирует образование вирусспецифических антител, выявляемых в РСК в разведении 1: 256 и в ИФА в разведении 1:6000.

При определении антигенного соответствия штамма А N 1707 "Армения-98" с производственными штаммами и полевыми изолятами вируса ящура типа А, выделенными на протяжении 1962-1998 гг. на территории стран СНГ и ряда других государств мира, было проведено сравнительное исследование первичной структуры гена и белка VP1. Сравнительный анализ установленных структур штамма А N 1707 "Армения-98" и эпизоотических изолятов, выделенных в последние годы в Турции и Иране (А-Иран-96, А-Турция-97, А-Турция-98) показал, что оба изолята А-Армения-98 идентичны между собой и отличаются от изолятов А-Турция-97, А-Турция-98 и А-Иран-96 по трем, четырем и семи нуклеотидным основаниям соответственно. Замена в 156 кодоне является значимой и приводит к изменению треонина на аланин (фиг. 1).

Филогенетические взаимоотношения исследованных изолятов с ранее изученными штаммами, выделенными в разных странах мира за три последние десятилетия, указаны на дендрограмме (фиг. 2). Установлено, что исследованные изоляты существенно отличаются от всех выделенных ранее изолятов, в том числе и от вируса подтипа А₂₂, куда относится используемый в настоящее время для производства средств диагностики и специфической профилактики производственный штамма A₂₂ N 550.

Антигенное родство вируса ящура А N 1707 "Армения-98" с соответствующими производственными и ранее выделенными штаммами на территории Турции и Ирана изучено в РСК. Полученные результаты представлены в таблице 1.

Как свидетельствуют данные, представленные в таблице 1, вирус А N 1707 "Армения-98" отличается как от производственных, так и от ранее выделенных эпизоотических штаммов.

Аналогичное изучение антигенного родства выделенного штамма было проведено в реакции нейтрализации, где в качестве иммунных использовались сыворотки реконвалесцентов КРС на вирусы штаммов А N 1707 "Армения-98", А-Иран-87 и A₂₂ N 550.

Результаты этих исследований представлены в таблице 2.

Приведенные в таблице 2 данные подтверждают антигенное отличие выделенного штамма от производственного штамма A₂₂ N 550 и эпизоотического штамма, выделенного в Иране в 1987 году.

Биотехнологические характеристики
Штамм А N 1707 "Армения-98" проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации. Штамм предназначен для использования в качестве сырья для получения диагностических сывороток и антигенных препаратов, а также изготовления инактивированной противоящурной вакцины. Вирус штамма А N 1707 репродуцируется в монослойных культурах первично-трипсинизированной культуры клеток почки свиньи (СП), перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК-3О), IB-RS-2, ВНК-21 и в течение 20-24 часов инкубирования накапливается до 7,0-8,0 Ig ТЦД₅₀/мл. При массированном заражении вызывает ЦПД через 4 часа.

После 3-4 пассажей инкубирования накапливается до 6,0-8,0 Ig ТЦД₅₀/мл. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Хемо- и генотаксономическая характеристика
Штамм А N 1707 "Армения-98" является РНК-содержащим вирусом с мол.массой 7 • 10⁶Д.

Нуклеиновая кислота представлена одноцепочечной линейной молекулой мол. массой 2,8 • 10⁸ МД. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP1, VP2, VP3 и VP4. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP1. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирионная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники в свою очередь расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 6 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, один (Vp_б6а) является РНК-зависимой РНК-полимеразой, участвующей в репликации РНК новых вирионов.

Проведено определение первичной структуры участка генома вируса с помощью ПЦР и сиквенса. Результаты исследований представлены на фиг. 1 и 2. Сравнительный анализ показал, что штамм отличается от штамма А-Турция-98, А-Турция-97 и А-Иран-96 по трем, четырем и семи нуклеотидным основаниям соответственно.

Установлено, что армянский изолят вируса ящура имеет наибольшую степень гомологии первичной структуры гена и белка VP1 с изолятами А-Турция-98. Две замены (в 67 и 174 кодонах) из трех, отличающих вирус ящура А-Армения-98 и А-Турция-98, являются молчащими, тогда как замена в 156 кодоне является значимой и приводит к изменению треонина на аланин. Исследуемый изолят существенно (18% различий) отличается от производственного штамма А₂₂ N 550 и других вариантов и штаммов вируса ящура A₅, A₁₀, A₁₂, A₂₄, А N 1640 Узбекистан-91 и др.

Физические свойства
Масса вириона - 8,4 • 10^-18 г. Коэффициент седиментации -146S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность - 1,45/мл.

Устойчивость к внешним факторам
Вирус штамма А N 1707 "Армения-98" устойчив к эфиру, хлороформу, фреону, ацетону и др. органическим растворителям и детергентам. Наиболее стабилен при pH 7,0- 7,6. Сдвиги pH как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, облучению, высоким температурам.

Дополнительные признаки и свойства
Иммуногенная активность - иммуногенен в составе инактивированной вакцины.

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных, новорожденных мышат, морских свинок.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей. Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм А N 1707 "Армения-98" по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом вируса ящура типа А.

Для снижения его эпизоотической опасности необходима своевременная лабораторная диагностика вновь возникающих очагов болезни, для чего необходимы высокоактивные и специфичные антигенные диагностикумы.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источник, характеризующийся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков аналога, позволил установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого способа, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого способа условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. Результаты поиска показали, что предлагаемый способа не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата.

Следовательно, предлагаемый способ соответствует условию патентоспособности "изобретательный уровень".

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исполнения.

Пример 1. Культуру клеток ВНК-21, выращенную в монослое в матрасах емкостью 1,5 л, заражают вирусом ящура типа А, штамм N 1707 "Армения-98", адаптированным к указанным клеткам в течение 3-5 последовательных пассажей, из расчета по меньшей мере 1 ТЦД₅₀/клетка и инкубируют при 37^oC. После полной дегенерации монослоя, вызванной действием вируса, жидкость из матрасов сливают в общую емкость, растворяют в ней 0,2М NaCl и 8-10% ПЭГ м.м.6000, выдерживают в течение 16-18 часов при +4^oC и центрифугируют при 3000g в течение 80 мин. Осадок ресуспендируют в 100-кратно уменьшенном объеме буферного раствора следующего состава:
0,05 М трис - 6,05 мл;
0,15 М NaCl-8,7 мл;
дистиллированная вода - до 1 л.

pH доводят с помощью HCl до 7,3.

Ресуспендированный концентрат очищают путем суспендирования в нем 10% хлороформа с последующим центрифугированием в течение 30 минут при 3000g. Осадок удаляют, а надосадочную жидкость повторно очищают хлороформом.

Очищенный концентрат вируса ящура инактивируют АЭЭИ, который добавляют в вируссодержащую суспензию в концентрации 0,05%. Инактивацию ведут при 27^oC в течение 18 часов. Полученный инактивированный антиген проверяют на специфическую активность в РСК и отсутствие остаточной вирулентности путем инокуляции монослоя культуры клеток СП. При отсутствии остаточной вирулентности и активности в РСК 1: 8 и выше антиген подвергают лиофильному высушиванию в стеклянных ампулах в объеме по 1,0 мл. Перед сушкой к антигену добавляют 5% сахарозы и 0,2% желатина. Полученный антиген должен обладать комплементсвязывающей активностью по меньшей мере 1:32 -1:64, содержать общий вирусный белок - по меньшей мере 16 мкг/мл, в том числе 146 S - по меньшей мере 7,14 мкг/мл.

Указанным способом была приготовлена 1 серия диагностического антигена, характеристика которого приведена в таблице 3.

Приведенные в таблице 3 результаты исследований свидетельствуют, что предлагаемым способом получен диагностический антиген, специфическая активность которого соответствует требованиям (5).

Пример 2. Культуру клеток ПСГК-3О, выращенную в монослое в матрасах емкостью 1,5 л, заражают вирусом ящура типа А, штамм N 1707 "Армения-98", адаптированным к указанным клеткам в течение 3-5 последовательных пассажей из расчета 1 ТЦД₅₀ на одну клетку и инкубируют при 37^oC. Полученный вирус очищают, концентрируют, инактивируют, сушат и контролируют на специфическую активность и остаточную вирулентность так, как описано в примере 1.

Указанным способом была приготовлена 1 серия диагностического антигена, характеристика которого приведена в таблице 4.

Приведенные в таблице 4 результаты исследований свидетельствуют, что предлагаемым способом получен диагностический антиген, специфическая активность которого соответствует требованиям (5).

Таким образом приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности и условий:
- способ, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в ветеринарной медицине и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- антиген, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой активностью и специфичностью. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания:
1. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998, с., 539-544.

2. Методические указания по выделению и идентификации штаммов вируса ящура. - М.: Колос, 1974, с. 29.

3. Там же, с.38.

4. Инструкция по изготовлению и контролю антигенов ящурных штаммоспецифических сухих для серологических реакций (РСК, РУСК, РДП, РРИД, РПГА, РЭМА). Утверждена ГУВ МСХ СССР 28.11.79 г. с изменениями и дополнениями от 24.02.89
5. ГОСТ 25384-82.

6. Ререр X. Ящур. Пер. с нем. Г.А.Сурковой/ Под ред. и с предпис. канд. вет.наук П.В. Малярец. - М.: Колос, 1971, 432 с.

7. Бурдов А.Н., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур/ Под ред. А.Н.Бурдова. - М.; Агропромиздат, 1990, 320 с.

8. Патент СССР N 594771, A 61 К 39/135, 01.07.91
9. Патент Великобритании N 1015262, A 5 B 8, 31.12.65.

10. Патент Великобритании N 1090758, C 6 F 1, 15.11.67
11. Патент ФРГ N 1935291 30h 6, 14.01.71

Изобретение предназначено для изготовления диагностических антигенов. Вирус ящура типа А, штамм 1707 "Армения-98", выращивают в монослое клеток ВНК-21 или ПСГК-30. Полученный вирус подвергают концентрированию полиэтиленгликолем. Очищают хлороформом и инактивируют аминоэтилэтиленимином. При отсутствии остаточной вирулентности и активности в РСК 1:8 и выше антиген высушивают методом лиофилизации. Используют стабилизаторы на основе сахарозы и желатина. Изобретение повышает активность и специфичность препарата. 4 табл. , 2 ил.

Способ получения яшурного антигена типа А для иммунохимических реакций, включающий репродукцию вирусного антигена в чувствительной системе культивирования, очистку, концентрирование и инактивацию вируса и последующее высушивание целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве вирусного антигена используют штамм вируса Aphtae epizooticae, сем. Picornaviridae, род aphtovirus, типа А, коллекция ВГНКИ N 1707 "Армения-98-ДЕП", взятый в эффективном количестве.