ИНАКТИВИРОВАННАЯ ЭМУЛЬГИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ БЛЮТАНГА Российский патент 2010 года по МПК A61K39/12 A61P31/12 

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к производству и применению биологических препаратов для специфической профилактики блютанга.

Одним из наиболее сложных вопросов в системе противоэпизоотических мероприятий при блютанге является специфическая профилактика болезни. Следует отметить, что переболевшие овцы приобретают пожизненный иммунитет только к одному серотипу вируса, который вызвал болезнь. В настоящее же время известны 24 серотипа вируса, которые вызывают сходную клиническую картину при заражении восприимчивых животных. В России разработана инактивированная вакцина на основе 16-го серотипа вируса, которая была успешно применена в Бурятии при ликвидации вспышек блютанга в 1993 году [1].

Известна вакцина, применяемая для вакцинации овец, содержащая инактивированный 0,05% теотропином вирус, выращенный в однослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК) или почки сирийского хомячка ВНК-21, и масляный адъювант, состоящий из 80% минерального масла и 20% эмульгатора КЛ-230, который добавляется к инактивированному вирусному сырью в объеме 20%. Моновакцина производится из 16 серотипа вируса блютанга. Бивалентная вакцина разработана против блютанга 4 и 9 серотипов [2]. Однако вероятность возникновения этой болезни, вызванной другими серотипами, а также несколькими серотипами в пределах одной территории, достаточно высокая. Так, в настоящее время заболевание крупного рогатого скота (КРС) и овец в Европе обусловлено в основном 8 серотипом и 1 серотипом и представляет серьезную опасность заноса возбудителя этой болезни в нашу страну в связи с закупками КРС. Недостатком разработанных инактивированных моно- и бивалентных вакцин является то, что они не могут защитить от заболевания блютангом, вызванным другими серотипами вируса. Также в связи с осложнившейся ситуацией, а именно заболеванием блютангом КРС, необходима вакцина, используемая для прививки как овец, так и КРС. Использование эмульгатора КЛ-230 в количестве 20% требует значительного расхода антигенсодержащего сырья - до 80% от общего состава вакцины.

Целью настоящего изобретения является разработка инактивированной эмульгированной вакцины против блютанга из одного или нескольких серотипов, сокращающей расход вирусного сырья и применяемой для вакцинации крупного и мелкого рогатого скота.

Указанная цель достигается тем, что инактивированная вакцина в качестве вирусного сырья содержит моно - или поливарианты серотипов вируса блютанга, вызвавшие эпизоотию, размноженные в элективных культурах клеток с биологической активностью 5,5-8,0 lg ТЦД₅₀/см³, при следующем содержании компонентов в вакцине, мас.%:

Культуральное сырье вируса блютанга 40-60 Инактивант-теотропин 0,02-0,05 Масляный адъювант остальное

Инактивированная вакцина против блютанга создает иммунитет после двукратной прививки животных на 21 сутки после второй вакцинации длительностью не менее 9 месяцев. По иммуногенности и безвредности вакцина не уступает другим, применяемым при этой болезни вакцинам и стабильна при хранении.

По иммуногенности и безвредности инактивированная вакцина из одного или нескольких серотипов вируса блютанга не уступает моновакцинам, применяемым при этих болезнях [2] и стабильна при хранении (табл.1). Предлагаемый состав вакцины позволяет в 2 раза снизить расход вируссодержащего сырья за счет внесения в состав вакцины масляного адъюванта в указанном ниже соотношении, а изготовление вакцины непосредственно из эпизоотического изолята позволяет значительно сократить сроки изготовления вакцины.

Таблица 1
Сравнительная характеристика индукции ВН-антител в сыворотках крови животных, привитых моно- и поливариантными вакцинами против вируса блютанга (ВБ) Вакцина Животные Срок хранения при 4-8°С Применение Титр (log₂) ВН - антител против соответствующего серотипа Вакцина против 8 серотипа ВБ овцы, КРС и др. 2 года в/мышечно   Вакцина против 4+8 серотипов ВБ овцы, КРС и др. 2 года в/мышечно 2-5 Вакцина против 4+8+9 серотипов ВБ овцы, КРС и др. 2 года в/мышечно 1-5 Вакцина против 16 серотипа ВБ овцы 2 года в/мышечно 2-4 Вакцина против 4+9 серотипа ВБ овцы 2 года в/мышечно 1-4

Приводим примеры, содержащие компоненты в конкретных соотношениях на 100 л вакцины.

Пример 1

Получение инактивированного кулътуралъного вируссодержащего сырья из эпизоотического изолята вируса блютанга

Эпизоотический изолят вируса блютанга выделяют из поступившего патматериала от больных и павших животных во время вспышки заболевания, из которого приготовляют 10% суспензию. Этой суспензией заражают элективную клеточную культуру ПСГК-60, ВНК-21 или Vero и культивируют при 37°С до 6 суток. Затем инфицированную культуру клеток замораживают-оттаивают и делают следующий пассаж до проявления цитопатических изменений. После 2-3-х пассажей в культуре клеток определяют инфекционную активность, определяют серотип выделенного изолята, паспортизируют и хранят при - 40°С.

Идентификацию выделенного вируса проводят в РДП, РСК и ТФ ИФА. Типирование выделенного вируса по индексу его нейтрализации в культуральном вируссодержащем материале сыворотками, специфичными к 24 серотипам вируса блютанга, двум серотипам вируса ЭГБО и вирусу болезни Ибараки.

Для получения культурального вируссодержащего сырья готовят 2-3-суточную культуру клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-60 в роллерных бутылях, заражают определенным серотипом вируса блютанга с множественностью 0,010-0,001 ТЦД₅₀/клетка и инкубируют при 37°С в течение 48-72 часов до проявления характерных цитопатических изменений и поражении 90-100% клеточного монослоя. Затем содержимое бутылей объединяют и определяют инфекционность вирусного материала титрованием в культуре клеток. Затем к вируссодержащей культуральной суспензии с исходной активностью не менее 10^5,5 lg ТЦД₅₀/см³ вносят теотропин, растворяют его путем тщательного перемешивания и инкубируют при 37°С 48 ч.

К полученному таким образом инактивированному сырью добавляют масляный адъювант - остальное до 100%, тщательно перемешивают, пропускают через коллоидную мельницу для эмульгирования и получают вакцину при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Культуральное сырье вируса блютанга   8 серотип 50,00 Теотропин 0,02 Масляный адъювант остальное

Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета. Содержание антигена в вакцине составляет 50% при одинаковой иммуногенной активности с моновакциной против 16 серотипа, содержащей 80% антигена (таблица).

Вакцину вводят по 1,5 см³ подкожно 4 овцам или по 3 см³ нетелям в область внутренней поверхности бедра, дважды с интервалом 14 сут. До иммунизации и через 21 день после второй вакцинации от животных отбирают кровь и сыворотку исследуют на наличие вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации. рН проводят по стандартной методике со 100-300 ТЦД₅₀ вируса гомологичного серотипа в пробирках или микрометодом в планшетах (разведение сывороток с 1:2 до 1:128), с использованием культуры клеток ПСГК-60 или CV-1 (Vero или ВНК-21). Вакцина вызывала образование ВН-антител у испытуемых животных в титрах 1:8-1:16. Вакцину считают иммуногенной, если она индуцирует образование вируснейтрализующих антител в исследуемых сыворотках крови вакцинированных животных в титре не ниже 1:4 против гомологичного серотипа вируса, включенного в состав вакцины.

Пример 2

Получение инактивированного культуралъного вируссодержащего сырья из двух серотипов вируса блютанга

Для получения производственного вируса суспензионные клетки ВНК-21/13 (посевная концентрация клеток 300-500 тыс/см³) в среде 0,25 ФГМ-С на солевом растворе Эрла помещают в реактор (10-500 дм³) и выращивают при (37,0±0,5)°С и постоянном перемешивании в течение 2-3 сут до увеличения клеточной концентрации до (1-2)×10⁶ кл/см³. Затем суспензию клеток ВНК-21/13 указанной концентрации заражают вирусом блютанга: 1 реактор вирусом 4-го серотипа, а 2-й реактор - вирусом 8-го серотипа и инкубируют при температуре 37,0°С. В течение 48-72 ч отбирают пробы на определение жизнеспособности клеток в суспензии, затем производят подсчет в камере Горяева после окрашивания 0,5% водным раствором трипанового синего по общепринятой методике. При обнаружении (80±10,0) % нежизнеспособных клеток культивирование прекращают и отбирают пробы вируса для определения наличия контаминации бактериальной и грибной микрофлорой и инфекционной активности.

Полученное таким образом культуральное вируссодержащее сырье двух серотипов вируса блютанга с исходной биологической активностью 10^5,5-10^8,0 lg ТЦД₅₀/см³, инактивируют теотропином, объединяют и добавляют масляный адъювант - остальное, тщательно перемешивают и получают вакцину при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Культуральное сырье вируса блютанга:   4 серотип 20,00 8 серотип 20,00 Теотропин 0,05 Масляный адъювант остальное

Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.

Вакцину вводят по 3,0 см³ подкожно 4 нетелям (КРС) в область внутренней поверхности бедра, дважды с интервалом 14 сут. До иммунизации и через 21 день после второй вакцинации от животных отбирают кровь и сыворотку исследуют на наличие вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации. рН проводят по стандартной методике со 100-300 ТЦД₅₀ вируса гомологичного серотипа в пробирках или микрометодом в планшетах (разведение сывороток с 1:2 до 1:128) с использованием культуры клеток ПСГК-60 или CV-1 (Vero или ВНК-21).

Вакцина индуцировала образование вируснейтрализующих антител в крови вакцинированных животных в титре не ниже 1:8-1:16 против 4 и 8 серотипов вируса, включенного в состав вакцины соответственно.

Пример 3

Получение инактивированного культурального вируссодержащего сырья из трех серотипов вируса блютанга

Для получения производственного вируса суспензионные клетки

ПСГК-с60 (посевная концентрация клеток 300-500 тыс./см³) в среде 0,25 ФГМ-С на солевом растворе Эрла помещают в реактор (10-500 дм³) и выращивают при (37,0±0,5)°С и постоянном перемешивании в течение 2-3 сут до увеличения клеточной концентрации в (1-2)×10⁶кл/ см³. Затем суспензию клеток указанной концентрации заражают вирусом блютанга: 1-й реактор вирусом 4-го серотипа, 2-й реактор - вирусом 8-го серотипа и 3-й - вирусом 9-го серотипа и инкубируют при температуре 37,0°С. В течение 48-72 ч отбирают пробы на определение жизнеспособности клеток в суспензии, затем производят подсчет в камере Горяева после окрашивания 0,5% водным раствором трипанового синего по общепринятой методике. При обнаружении (80±10,0)% нежизнеспособных клеток культивирование прекращают и отбирают пробы вируса для определения наличия контаминации бактериальной и грибной микрофлорой и инфекционной активности.

Полученное таким образом культуральное вируссодержащее сырье трех серотипов вируса блютанга с исходной биологической активностью 10^5,5-10^8,0 lg ТЦД₅₀/см³ инактивируют теотропином, добавляют масляный адъювант - остальное до 100 мас.%, тщательно перемешивают и получают вакцину при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Культуральное сырье вируса блютанга:   4 серотип 20,00 8 серотип 20,00 9 серотип 20,00 Теотропин 0,03 Масляный адъювант остальное

Приготовленная таким образом вакцина представляет собой эмульсию бледно-розового цвета.

Вакцину вводят по 2,0 см³ подкожно 4 нетелям (КРС) в область внутренней поверхности бедра, дважды с интервалом 14 сут. До иммунизации и через 21 день после второй вакцинации от животных отбирают кровь и сыворотку исследуют на наличие вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации. рН проводят по стандартной методике со 100-300 ТЦД₅₀ вируса гомологичного серотипа в пробирках или микрометодом в планшетах (разведение сывороток с 1:2 до 1:128) с использованием культуры клеток ПСГК-60, CV-1, ВНК-21 или Vero.

Вакцину считают иммуногенной, если она индуцирует образование вируснейтрализующих антител в исследуемых сыворотках крови вакцинированных животных в титре не ниже 1:2-1:4 против гомологичного серотипа вируса, включенного в состав вакцины.

Источники информации

1. Патент №2077583, 20.04.97 г., авторы Вишняков И.Ф., Стрижаков А.А., Новикова М.Б., Луницин А.В., Куриннов В.В., Карпов Г.М., Балышева В.И.

2. Сливко В.А. Усовершенствование технологии изготовления инактивированной вакцины против блютанга, канд. диссерт., 2003 г.

Изобретение относится к области биотехнологии. Вакцина содержит культуральное вирусное сырье, инактивант и масляный адъювант. В качестве вирусного сырья вакцина содержит моно- или поливарианты серотипов вируса блютанга, вызвавшие эпизоотию, размноженные в элективных культурах клеток с биологической активностью 5,5-8,0 lg ТЦД₅₀/см³, при следующем содержании компонентов в вакцине, мас.%: культуральное сырье вируса блютанга - 40-60, инактивант-теотропин - 0,02-0,05, масляный адъювант - остальное. Вакцина безвредна, обладает высокой иммуногенностью.

Вакцина против блютанга, включающая культуральное вирусное сырье, инактивант и масляный адъювант, отличающаяся тем, что в качестве вирусного сырья содержит моно- или поливарианты серотипов вируса блютанга, вызвавшие эпизоотию, размноженные в элективных культурах клеток с биологической активностью 5,5-8,0 lg ТЦД₅₀/см³, при следующем содержании компонентов в вакцине, мас.%:
культуральное сырье вируса блютанга 40-60 инактивант-теотропин 0,02-0,05 масляный адъювант остальное