ШТАММ "ТАПХАР" ВИРУСА БЛЮТАНГА FEBRIS INFECTHIOSA CATARHALISS OVIUM, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ Российский патент 1997 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности, к штамму вируса блютанга (ВБ), используемого для изготовления вакцины, который может быть применен для производства вакцины против заболевания овец в научно-исследовательских учреждениях и различных отраслях биологической промышленности.

В настоящее время известны 24 серотипа возбудителя блютанга, которые вызывают сходную клиническую картину при заражении восприимчивых животных. Вирус блютанга 10 серотипа, выделенный в США, имел следующие характеристики: размножался в культуре клеток ВНК-21 в титре 6,0 lg ЦПД 50/мл. Вирусные частицы имели электронно-микроскопическую структуру, присущую вирионам рода орбивирусов [1]
Известен штамм Ильичевский вируса блютанга, выделенный в 1986 г. Нахичеваньской автономной области Армянской ССР.

Предположительно он был отнесен к 12-му серотипу вируса блютанга. Вирус размножался в культуре клеток почки новорожденного хомяка (ВНК-21) с титром 6,5-7,0 lg ЦПД 50/мл. На основе данного изолята была разработана инактивированная гидроокисьалюминиевая вакцина (ТУ 46-21-239-76). Нейтрализующие антитела, вырабатывающиеся в организме, обеспечивают защиту от заражения только гомологичным серотипом блютанга. В связи с этим вирусвакцины применяют против тех серотипов, которые циркулируют в данной местности [2]
Задачей настоящих исследований является выделение нового штамма вируса блютанга, размножающегося в перевиваемой культуре клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК), типирование его и применение для изготовления вакцины против циркулирующего в данной местности серотипа.

Штамм "Тапхар" вируса блютанга размножается в культурах клеток ПСГК в титре 6,5-7,0 lg ЦПД 50/мл, почки зеленой мартышки (CV-1) в титре 5,5-6,0 lg ЦПД 50/мл, почки овцы (ПО) в титре 5,0-6,0 lg ЦПД 50/мл и на мышах 1-2 дневного возраста в титре 8,7-9,0 lg МЛД 50/мл. При типировании в реакции нейтрализации (РН) по индексу нейтрализации штамм отнесен к 16 серотипу вируса блютанга.

С помощью электронно-микроскопических (ЭМ) и иммуноэлектронно-микроскопических (ИЭМ) исследований обнаруживают вирусные частицы размером 55-70 нм, которые тождественны морфологически представителям орбивирусов, семейства реовирусов.

Пример конкретного выполнения
Выделение вируса проводят путем инокуляции 10%-ной суспензии крови овец, поступившей для экспертизы, в культуру клеток ПСГК и мозг 1-2 дневных новорожденных мышат. Клинические признаки заболевания мышат блютангом обнаружены с первого пассажа при интрацеребральном заражении, титр вируса в крови 2,0 lg МЛД 50/0,02 мл 10%-ной суспензии. Установлены цитопатические изменения в культуре клеток, инокулированной вирус-кровью на уровне 6 пассажа, а при заражении суспензией мозга инфицированных мышат с 1-2 пассажа. Результаты этих исследований представлены в табл. 1.

Как следует из табл. 1, титры выделенного вируса в пробах суспензии мозга на уровне 1-2 пассажей в культуре клеток ПСГК составляет 4,5-6,5 lg ЦПД 50/мл, в пробах крови на уровне 6-7 пассажа 4,5-7,0 lg ЦПД 50/мл.

Для обнаружения антигена вируса прямым вариантом метода флуоресцирующих антител используют культуру клеток ПСГК, выращенную на покровных стеклах. Вируссодержащий материал вносят в разведениях от 1:100 до 1:1000. Вирусный антиген обнаруживают, начиная с 4 пассажа (табл. 2).

Как следует из данных табл. 2, методом флюоресцирующих антител вирус обнаруживают, начиная с 4-го пассажа, еще до проявления цитопатического действия.

Для идентификации выделенного вируса в РДП, РСК и ТФ ИФА готовят концентрированные культуральные антигены из зараженных клеток ПСГК и сахарозо-ацетоновые антигены из мозга инфицированных 2-3 дневных мышат. Положительные результаты получают только при взаимодействии антигенов с поли- и моноклональными антителами, специфичными к антигенам вируса блютанга. Титр культурального антигена в РДП, РСК и ТФ ИФА составляет 1:2 1:4; 1:16-1:32 и 1:64-1: 256, а сахарозо-ацетонового антигена 0; 1; 16 1:32 и 1:64-1:128, соответственно. Для контроля специфичности применяют антигены вирусов эпизоотической геморрагической болезни оленей (ЭГБО), болезней Ибараки (БИ), Акабане (БА), Найроби (БН) и лихорадки долины Рифт (ЛДР). Результаты представлены в табл. 3.

Эти результаты однозначно подтверждают как принадлежность выделенного изолята к вирусу блютанга, так и его чистоту от антигенно-родственных вирусов ЭГБО и болезни Ибараки.

С помощью ЭМ и ИЭМ исследований в культуральных концентрированных и нативных вируссодержащих препаратах обнаруживаю вирусные частицы размером 55-70 нм. Вирионы морфологически тождественны представителям рода Орбивирусов семейства Реовирусов, имеют типичную икосаэдрическую форму симметрии и располагаются одиночно или в виде скоплений.

При проведении ИЭМ положительный результат получают при использовании сахарозо-ацетонового антигена и сыворотки овцы. При постановке ИЭМ материалы используют с цельной сывороткой реконвалесцентов. В пробах обнаруживают группы вирусных частиц, связанных антителами.

В реакции нейтрализации используют культуральный вирус, прошедший 8 пассажей в культуре клеток ПСГК с инфекционной активностью 7,0 lg ЦПД 50/мл, выделенный из крови больных овец (N 4).

Типирование выделенного вируса по индексу его нейтрализации в культуральном вируссодержащем материале сыворотками, специфичными к двадцати серотипам вируса блютанга, двум серотипам вируса ЭГБО и вирусу болезни Ибараки показало, что наибольший индекс нейтрализации (3,0 lg) наблюдают с сывороткой, специфичной к 16-му серотипу вируса блютанга. Индексы нейтрализации выделенного штамма сыворотками, специфичными к остальным девятнадцати серотипам вируса блютанга, и гетерологичными сыворотками, не превышал 1,0 lg.

Идентификация выделенного штамма "Тапхар" проверена в комиссионных испытаниях (акт от 28.01.94 прилагается).

Приводим пример использования данного штамма для приготовления инактивированной вакцины против блютанга 16-го серотипа.

Для получения производственного вируса отбирают 2-3-х суточную культуру клеток ПСГК с полным равномерным круговым монослоем.

Из роллерных сосудов удаляют ростовую среду и в каждый сосуд вносят по 0,5 л поддерживающей питательной среды. Множественность заражения должна быть 0,01-0,001 ТЦД на клетку. Сосуды с инфицированной культурой помещают в роллерный аппарат. Выращивание вируса проводят при температуре 37±0,5 С и скорости вращения сосудов 10-12 об/ч. При необходимости среду подщелачивают 7,5% -ным раствором соды до рН 7,2-7,4. При хорошо выраженном ЦПД вируса и поражении 70-80% клеток культивирование вируса прекращают, содержимое сосудов встряхивают для отделения пораженных клеток от стекла, вирусную суспензию объединяют и хранят при температуре 2-6^oС. Для приготовления инактивированной вакцины используют вирус с активностью 6,5-7,0 lg ЦПД 50/мл.

Биологическую активность вируса определяют титрованием на монослойной культуре клеток ПСГК, выращенной в пробирках.

Инактивацию вируса проводят 0,1%-ным раствором А-24 (1,8,3 6-диэндометилен-1,3,6,8-тетразациклодекан). Предварительно рН суспензии снижают до значений 6,8-6,9. Затем при постоянном перемешивании добавляют 10%-ный водный раствор А-24 в соотношении 1:100. Вирус инактивируют при (37±0,5)^oС в течение 72 ч. В течение первых 6 ч суспензию перемешивают каждые 0,5-1 ч, затем каждые 8-10 ч. С помощью 20% -ного раствора фосфорнокислого калия (KH₂PO₄) поддерживают рН в пределах 7,1-7,3.

Полноту инактивации вируса в полуфабрикате проверяют путем проведения 3-х пассажей инактивированного вируса в культуре клеток ПСГК. Для этого в 10 пробирок с полным монослоем 2-3-х суточной культуры клеток ПСГК вносят по 1 мл вируса в разведении 1:10 и выдерживают 20 мин при температуре (37±0,5)^oС, затем монослой дважды отмывают питательной средой и инкубируют в течение 6-7 суток. Питательную среду меняют через одни сутки после заражения. Для проведения пассажей испытуемые культуры клеток кратковременно замораживают-оттаивают и содержимое пробирок переносят в 2-3-х суточную культуру клеток ПСГК и инкубируют 6-7 суток.

Полноту инактивации оценивают по отсутствию ЦПД в культуре клеток ПСГК на третьем пассаже вируса.

К инактивированной суспензии вируса добавляют 6%-ный раствор гидроокиси алюминия (ГОА) до конечной концентрации 5-10 мг/мл, тщательно перемешивают и оставляют при температуре (2-6)^oС для адсорбции вирусного антигена. Через 24 ч осторожно, не взбалтывая, декантируют 1/3 надосадка, доливают инактивированную вирусную суспензию до первоначального объема, тщательно перемешивают и выдерживают еще 24 ч.

К полученной технической жидкости (ТЖ) добавляют 10%-ный сапонин до конечной концентрации 0,5-1,0 мг/мл, перемешивают и разливают при помощи специального дозирующего устройства по 50, 100 или 200 мл в стерильные флаконы. Флаконы закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками. В конце фасовки проводят контроль вакцины на отсутствие бактериальной и грибковой микрофлоры.

Использование: ветеринарная вирусология. Сущность изобретения: выделен новый штамм вируса блютанга, размножаемый с перевиваемой культуре клеток почки сибирского горного козерога (ПСГК) и применяемый для изготовления вакцины против циркулирующего в данной местности серотипа. Штамм "Тапхар" вируса блютанга размножается в культурах клеток ПСГК в титре 6,5-7,0 lg ЦПД 50/мл, почки зеленой мартышки (CV-1) в титре 5,5-6,0 lg ЦПД 50/мл, почки овцы (ПЯ) в титре 5,0 - 6,0 lg ЦПД 50/мл на мышах 1-2 дневного возраста в титре 8,7-9,0 lg МЛД 50/мл. При типировании в реакции нейтрализации (РН) по индексу нейтрализации штамм отнесен к 16 серотипу вируса блютанга. С помощью электронно-микроскопических и иммуноэлектронно-микроскопических исследований обнаруживают вирусные частицы размером 55-70 нм, которые тождественны морфологически представителям орбивирусов, семейства реовирусов. 3 табл.

1 Штамм вируса блютанга Febris infecthiosa catarhaliss ovium ВНИИВВиМ N 1882, используемый для изготовления вакцины.