СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АНАЭРОБНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 2009 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к лабораторному методу исследования и к диагностике анаэробной инфекции, которая может возникнуть в любых тканях организма, где имеются соответствующие условия, особенно у больных с воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области (абсцессы, флегмоны и их осложнения).

В последнее время главенствующую роль в этиологии и патогенезе воспалительных заболеваний (в том числе, при челюстно-лицевой локализации) отдают анаэробам. Диагностика анаэробной инфекции при гнойно-воспалительных процессах представляет значительные трудности, особенно в тех в случаях, когда ей сопутствует аэробная микрофлора, а строгие анаэробы почти неуловимы обычными бактериологическими методами, которыми пользуется большинство лабораторий. Кроме того, имеются сообщения об изменении соотношения аэробных и анаэробных микроорганизмов в динамике гнойно-воспалительного процесса, что, по мнению авторов, связано с проявлением периодичности в смене доминирующей флоры.

Известен качественный метод определения анаэробной инфекции (Патент РФ № 2021608, МПК G01N 33/50, опубл. 1994 г.), включающий исследование ткани очага поражения методом хроматографического анализа с определением жирных кислот, по которым судят о наличии инфекции. Однако данный способ экспресс-диагностики является достаточно эффективным только при моноинфекции, сопряжен с необходимостью приобретения бактериологического анализатора, специальных условий обработки материала (наличие бокса, специализированного персонала), а по затратам труда и времени оказывается сравним с затратами, необходимыми для проведения микробиологического анализа в целом (3-5 суток), и в условиях большинства стационаров или полевых условиях недоступен.

Известен способ диагностики анаэробной хирургической инфекции мягких тканей (Патент РФ № 2073245, МПК G01T 33/53, опубл. 1997 г.), включающий исследование содержания миоглобина в сыворотке крови с помощью реакции пассивной гемагглютинации, и при выявлении повышения ее уровня, равного 2048 нг/мл и выше, диагностируют анаэробную инфекцию мягких тканей.

Недостатком этого способа является то, что он не является строго специфичным, поскольку взятие крови происходит на значительном удалении от очага воспаления, а выявление повышенного содержания миоглобина в сыворотке крови может определяться и при других патологических состояниях: при генерализованном воспалительном процессе без участия анаэробной микрофлоры, острой интоксикации в результате укуса ядовитых насекомых, ожогах и др.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ диагностики осложнений послеоперационной раны, включающий смешивание раневого отделяемого с физиологическим раствором хлорида натрия, нанесение капли полученной смеси на прозрачную поверхность, высушивание, проведение микроскопии (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н. Морфология биологических жидкостей человека. Москва, «Хризостом», 2001 г., с. 270-271).

Недостатком данного способа является то, что он предложен в качестве контрольного теста для оценки возможности использовать полученную смесь, в которой в качестве исследуемого материала послеоперационной раны при ее заживлении может выступать жидкий секрет, вязкий секрет, тканевые комочки. Однако данный способ не позволяет точно диагностировать наличие анаэробной инфекции.

Кроме того, во всех известных способах диагностики, при проведении антибактериальной терапии может исказиться реальный состав микрофлоры, что приведет к значительному несоответствию между частотой обнаружения анаэробов и клинической картиной течения гнойно-воспалительных процессов.

Поставленной задачей было устранение данных недостатков и создание легко воспроизводимого и достоверного способа качественного определения анаэробов в исследуемом раневом отделяемом за счет более раннего выявления (в течение 3-х часов), технически простого (без использования дорогостоящей аппаратуры, специального бокса для проведения исследований, без участия специалистов-бактериологов) и экономичного.

Это достигается тем, что в способе диагностики анаэробной инфекции, включающем смешивание раневого отделяемого с физиологическим раствором (0,9%) хлорида натрия, нанесение капли полученной смеси на прозрачную поверхность, высушивание, проведение микроскопии, предложено смесь раневого отделяемого и раствора хлорида натрия брать в соотношении 1:(1-2) соответственно, перед проведением исследования выдерживать в термостате в течение 0,5-1 ч при 37-37,5°С и при наличии пузырьковых образований диагностировать анаэробную инфекцию.

Формирование пузырьковых образований, выявляемых в морфологической картине раневого отделяемого при добавлении хлорида натрия, объясняется тем, что физиологический раствор хлорида натрия создает в среде жизненное пространство для анаэробной микрофлоры и более благоприятные условия для газообразования, особенно при инкубировании смеси в условиях термостата в течение 0,5-1 часа. Кроме того, создаются лучшие условия для перемещения частиц в процессе клиновидной дегидратации раствора раневого отделяемого: мельчайшие пузырьки газа, выделяемые анаэробами, собираются в более крупные образования и четко выявляются в виде пузырьковых образований в морфологической картине. При исследовании фаций отделяемого раны без добавления раствора 0,9% хлорида натрия плотность среды не позволяет составляющим частицам распределиться по площади фации в соответствии с их физико-химическими параметрами и не дает возможности проявлять активную жизнедеятельность бактериям (в частности, газообразование). В результате вся поверхность фации нативного раневого отделяемого представлена тяжами и скоплениями аморфных масс. Выбранная нами пропорция отделяемого раны и физиологического раствора хлорида натрия в соотношении 1:(1-2) соответственно для выявления анаэробов продиктована:

1) получением возможно минимального количества отделяемого раны (20-40 мкл) в динамике ее заживления;

2) удобством использования микропробирок, содержащих определенное количество 0,9%-го раствора хлорида натрия;

3) предварительным исследованием различных соотношений отделяемого раны и физиологического раствора хлорида натрия, результатом которых явился наиболее оптимальный подбор соотношения для формирования пузырьковых образований при дегидратации капли смеси.

На фиг.1. изображена фация раневого отделяемого в смеси с раствором хлорида натрия больного с одонтогенной флегмоной при наличии анаэробной инфекции; на фиг.2 - то же, без раствора хлорида натрия; на фиг.3 - фация раневого отделяемого в смеси с раствором хлорида натрия при отсутствии анаэробной инфекции у больного.

При исследовании нативного отделяемого раны (то есть без добавления раствора хлорида натрия) высушенная капля имела аморфизированную субстанцию без каких-либо включений (фиг.2), в то же время при исследовании высушенной капли этого отделяемого в смеси с раствором хлорида натрия выявлялись пузырьковые образования, что свидетельствовало об активном газообразовании, присущем для анаэробных микроорганизмов.

Мы считаем, что данный феномен проявлялся при следующих обстоятельствах: при потере воды из капли в процессе испарения жидкости соли хлорида натрия начинают выпадать в виде папоротникообразных кристаллов, которые формируют густую сеть пространства высушенной капли. В процессе выпадения этих кристаллов солей происходит «выдавливание» легких элементов, содержащихся в биологическом материале. Таким образом осуществляется выход мельчайших пузырьков газа на поверхность высушенного образца в виде округлых образований с шаровидной поверхностью. Следовательно, продукцию газообразующих микроорганизмов, к которым и относятся анаэробы, можно наблюдать в высушенной капле смеси раневого отделяемого в присутствии кристаллов солей хлорида натрия.

Идея разработки данного способа заключалась в следующем: известно, что анаэробная инфекция является газообразующей в результате особенностей метаболизма этих микроорганизмов (ферментации), что приводит к наиболее тяжелому течению процесса и выраженной интоксикации. Следует отметить, что назначение данным больным соответствующих антибактериальных препаратов широкого действия сопровождается одновременно и их большей токсичностью для организма больного. Кроме того, эти препараты являются дорогостоящими. Поэтому получение достоверного и быстрого ответа наличия анаэробной микрофлоры в патологическом очаге позволяет избежать излишнего назначения дорогостоящих и высокотоксичных препаратов.

Осуществление способа показано на конкретном клиническом примере.

Пример 1.

Пациент Д., 28 лет. Диагноз: Одонтогенная флегмона.

У больного из раны произведено взятие раневого отделяемого в количестве 0,02 мл, которое помещено в пробирку с 0,9%-м раствором хлорида натрия в количестве 0,02 мл. Содержимое пробирки смешивали в течение 10 сек, помещали в термостат на 60 минут, затем надосадочную жидкость в количестве 0,02 мл наносили на поверхность предметного стекла в виде капли (без пузырьков воздуха!), после чего высушивали в течение часа. Высушенную каплю микроскопировали при малом увеличении микроскопа и обнаружили пузырьковые образования (фиг.1).

Заключение: морфологическая картина характерна для наличия анаэробной инфекции.

Бактериологическое исследование (результат получен на 5 сутки после взятия материала на анализ) подтвердило наличие неспорообразующей анаэробной микрофлоры в виде бактерий рода Bacteroides.

Данному пациенту была назначена соответствующая антибактериальная терапия (включающая бактерицидное действие относительно анаэробных микроорганизмов). После проведенного курса лечения повторное исследование отделяемого раны в смеси с физиологическим раствором хлорида натрия показало отсутствие пузырьковых образований в высушенной капле смеси раневого отделяемого (фиг.3).

Пример 2.

Пациент Л., 24 лет. Диагноз: Абсцесс одонтогенного происхождения.

Исследование морфологической картины раневого отделяемого указанным способом показало, что в высушенной капле смеси пузырьковые образования не обнаружены.

Заключение: в морфологической картине раневого отделяемого анаэробная инфекция не обнаружена.

Бактериологическое исследование (результат получен на 5 сутки после взятия материала на анализ) подтвердило отсутствие анаэробной микрофлоры в исследуемом материале.

Данному пациенту была назначена соответствующая антибактериальная терапия (без включения токсичного препарата метронидазола, оказывающего бактерицидное действие относительно анаэробных микроорганизмов). Через 7 дней пациент был выписан в удовлетворительном состоянии под наблюдение амбулаторного врача.

По предлагаемому способу были проведены исследования в динамике у 47 больных с гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области.

Наличие пузырьковых образований на поверхности фации, отмечалась у 30 больных с тяжелым течением заболевания (2 с абсцессом, 28 больных с флегмонами). У 17 больных, в фациях которых пузырьковые образования не выявлялись, клиническая картина воспалительного процесса протекала доброкачественно, проявляясь преимущественно лишь местными симптомами.

У 30 больных в очаге воспаления превалировали процессы альтерации и отсутствие положительной динамики даже при достаточном дренировании. Отмечалось быстрое прогрессирование (в течение одного дня или ночи) воспалительного процесса, сопровождаемое сильными болевыми ощущениями в пораженном участке, нарастание симптомов интоксикации (повышение температуры, учащение пульса, ухудшение общего самочувствия, значительный лейкоцитоз и высокая СОЭ). При хирургическом лечении рана имела типичный вид: ее поверхность была представлена серым налетом, отделяемое имело признаки газообразования, отмечался некроз окружающих мягких тканей, по периферии раны определялась зона плотной консистенции цвета «вареного мяса».

После окончания курса лечения и достижения клинического эффекта у всех 30 больных пузырьковые образования исчезали и картина центральной зоны фации была представлена только кристаллами солей хлорида натрия.

Анаэробы участвуют в развитии широкого круга гнойно-воспалительных заболеваний различной локализации и различных форм течения - от поверхностных нагноений до тяжелых инфекций со смертельным исходом. Развитию анаэробной инфекции способствуют пониженная иммунная реактивность организма и ряд факторов, снижающих обогащение тканей кислородом: тканевая деструкция, нарушение кровоснабжения, ожоги. Возникновению анаэробной инфекции могут способствовать: различные заболевания (сахарный диабет, атеросклероз, гингивиты, аспирационные пневмонии, злокачественные новообразования различной локализации), укусы животных, а также хирургические вмешательства и лечебные мероприятия (кортикостероидная, цитостатическая и иммунодепрессивная терапия).

Летальность при анаэробной инфекции при недостаточно активном лечении достигает 95% в результате быстрого нарастания полиорганной недостаточности, развития тяжелого сепсиса, септического шока. Успешность лечения больных с анаэробной инфекцией зависит от быстрой диагностики и срочного проведения этиотропной системной и местной антимикробной терапии, детоксикации, иммунокоррекции, восполнения белково-энергетических потерь, необходимости тщательной санации гнойно-воспалительного очага. Поэтому предложенный способ диагностики анаэробной инфекции должен стать ведущим в раннем обнаружении анаэробов и быстром назначении соответствующего лечения.

Изобретение относится к области медицины, а именно к лабораторным методам исследования, и касается способа диагностики анаэробной инфекции. Способ заключается в микроскопическом изучении высушенной после нанесения на прозрачную поверхность капли смеси раневого отделяемого с физиологическим раствором хлорида натрия в соотношении 1:(1-2), которую перед проведением исследования выдерживают в термостате при 37-37,5°С. При наличии пузырьковых образований диагностируют анаэробную инфекцию. Способ обеспечивает высокую точность диагностики анаэробной инфекции и позволяет откорректировать медикаментозное лечение. 3 ил.

Способ диагностики анаэробной инфекции, включающий смешивание раневого отделяемого с физиологическим раствором хлорида натрия, нанесение капли полученной смеси на прозрачную поверхность, высушивание, проведение микроскопии, отличающийся тем, что смесь раневого отделяемого и раствора хлорида натрия берут в соотношении 1:(1-2) соответственно, перед проведением исследования выдерживают в термостате в течение 1-1,5 ч при 37-37,5°С и при наличии пузырьковых образований диагностируют анаэробную инфекцию.