СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ГНОЙНО-ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ У БОЛЬНЫХ С ТРАВМАМИ ЧЕЛЮСТНО-ЛИЦЕВОЙ ОБЛАСТИ Российский патент 2008 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике.

Лечение больных с травматическими повреждениями костей лицевого скелета и их осложнениями (гнойно-воспалительными изменениями как в мягких тканях области перелома, так и в самой кости) - важная проблема челюстно-лицевой хирургии. В последние годы в нашей стране и за рубежом интенсивно разрабатываются методы диагностики нарушений естественной защиты организма, клинически проявляющиеся в отсутствии или удлинении сроков консолидации фрагментов, присоединении вторичной патогенной микробной флоры, что приводит к повторным хирургическим вмешательствам.

Общеизвестно, что различные компоненты системы иммунитета участвуют в реакциях организма на внедрение чужеродных агентов, повреждение тканей и в последующей реализации репаративных процессов. Первой фазой иммунного ответа является фагоцитоз, активизирующий цепь реакций клеточного и гуморального иммунитета. К главным эффекторам экссудативно-деструктивного и гнойного воспаления относятся нейтрофилы, оказывающие непосредственное влияние на активность других клеток, в том числе лимфоцитов, моноцитов и тромбоцитов, участвующих в восстановлении иммунного гомеостаза. Функциональное состояние нейтрофилов является своеобразным маркером уровня неспецифической защиты, иммунного гомеостаза организма, поэтому оценка показателей этих клеток может быть использована для прогноза риска развития гнойно-воспалительных осложнений у больных с травмами челюстно-лицевой области.

Известен способ оценки течения и прогноза развития гнойных ран при флегмонах челюстно-лицевой области (Патент РФ №2233449, МПК G01N 33/52, опубл. 2004 г.), включающий визуальную оценку объема и характера экссудации, диагностические цитохимические методы исследования нейтрофильных гранулоцитов в раневом отделяемом, совокупность результатов позволяет определять интегральную функциональную активность нейтрофильных гранулоцитов.

Недостатками данного способа является то, что исследуются только нейтрофилы раневого отделяемого, без учета системной реакции (иммунного гомеостаза организма), что не позволяет объективно оценить резервные возможности неспецифической защиты и прогнозировать развитие гнойно-воспалительных осложнений. Метод также требует значительных затрат реактивов, рабочего времени для постановки реакций и одновременного выполнения нескольких цитохимических методик.

Известен способ определения показателей стимулированного фагоцитоза нейтрофилов (Патент РФ №2165621, МПК G01N 33/53, опубл. 2001 г.), характеризующего резервные возможности и функциональную активность факторов неспецифической защиты организма, по которым можно прогнозировать развитие воспалительных осложнений. Способ основан на математической обработке данных спонтанного фагоцитоза. Была обнаружена линейная зависимость относительного и абсолютного числа нейтрофилов, участвующих в спонтанных и стимулированных зимозаном фагоцитарных реакциях, что позволило определить коэффициенты пересчета для вычисления параметров стимулированного фагоцитоза без лабораторного определения последних.

К недостаткам этого метода относятся низкая точность прогноза, которая основывается только на математическом перерасчете показателей спонтанного фагоцитоза. В то время как реальные значения стимулированного фагоцитоза, отражающие резервные возможности неспецифической защиты, могут изменяться в широком диапазоне в зависимости от состояния системы неспецифического иммунитета и стадии воспалительного процесса. Кроме того, учитывается только узкий аспект функциональной активности нейтрофилов (непосредственно процесс фагоцитоза), тогда как к основным проявлениям реактивности зрелого нейтрофила относятся перестройка метаболизма, миграция, адгезия, поглощение, образование пищеварительных вакуолей, секреторная дегрануляция. Недоучет этих факторов в значительной мере снижает эффективность метода.

Наиболее близким является способ оценки неспецифической защиты организма, по которой прогнозируют возможность воспалительного процесса (Медведский Е.Б., Гиндич Л.А. Хемилюминесцентный и морфометрический анализы нейтрофильных гранулоцитов крови у больных с гнойно-септическими осложнениями. // Бюл. экспериментальной биологии и медицины - 1994. - №7. - С.91-92), основанный на одновременном анализе размерных параметров нейтрофилов и оценке их хемилюминесцентной активности. Показано, что при низком уровне неспецифической защиты организма величины периметра и площади клеточной мембраны, а также периметра и площади ядерной мембраны фиксированного окрашенного нейтрофила достоверно превышают эти же показатели нейтрофилов у больных, имеющих высокий уровень неспецифической защиты. Хемилюминесцентный индекс составляет менее 20 единиц у больных с низким резервными возможностями и превышает 100 единиц у больных с малой вероятностью развития гнойно-воспалительных процессов.

Недостатками такого подхода является значительная трудоемкость, потребность длительного времени для выполнения исследований, одновременное использование двух разных методик и дополнительной аппаратуры, что делает его малопригодным для широкого использования, а тем более для экспресс-диагностики состояния неспецифической резистентности больного. Кроме того, измерения проводятся на фиксированных, высушенных и окрашенных препаратах, что не позволяет адекватно судить о реальном морфофункциональном статусе циркулирующих в крови нейтрофилов, поскольку в результате производимых физико-химических воздействий на клетку измеряемые параметры отличаются от истинных значений.

Заявляемое изобретение направлено на повышение точности прогнозирования гнойно-воспалительных осложнений за счет оперативной и объективной оценки морфологических и функциональных показателей живых нефиксированных и неокрашенных нейтрофилов периферической крови больных, например, с травматическими переломами костей лицевого скелета. Кроме того, способ позволяет исключить необходимость использования дорогостоящих реактивов, дополнительного оборудования; для проведения анализа морфофункционального состояния клеток требуется малый (не более 3-5 мл) объем крови.

Для этого в предлагаемом способе, включающем определение параметров нейтрофилов, исследование их функциональной активности, предложено определять морфологические типы и оптико-геометрические параметры живых нейтрофилов. По изменению показателей, а именно, при увеличении усредненного значения периметра нейтрофилов в пробе не менее чем на 20% от нормы, при одновременном снижении усредненного значения их высоты не менее чем на 10% от нормы, увеличении количества дегенеративных нейтрофилов свыше 5% от нормы делают прогноз о достоверной угрозе развития гнойно-воспалительных осложнений.

Анализ совокупности витальных оптико-геометрических показателей клеток представляет собой комплексную морфологическую и функциональную характеристику нейтрофильных лейкоцитов и функциональную характеристику нейтрофильных лейкоцитов и, следовательно, обобщающую оценку противомикробной защиты, т.е. состояния неспецифической резистентности организма.

Размерные параметры живого нейтрофила при фазово-интерференционной микроскопии, позволяющей исследовать клетку на просвет, содержат информацию не только о пространственно-объемных характеристиках клетки, но и о ее оптических свойствах, в частности о внутриклеточной анизотропии. Величина показателя преломления, измеряемая в каждой точке клетки, непосредственно зависит от концентрации, химического состава, агрегатного состояния внутриклеточного вещества, наличия или отсутствия органелл и включений. Изменение любого из указанных условий находит отражение в характерных локальных трансформациях фазового изображения и характеризует одновременно не только морфологические особенности, но и функциональное состояние нейтрофила.

Величина периметра клетки непосредственно отражает все изменения формы нейтрофила, связанные с появлением псевдоподий по мере его активации и реализации основных эффекторных реакций (миграции, фагоцитоза, переваривания, выделения биологически активных продуктов). Величина фазовой высоты зависит от особенностей состояния ядерных структур и гранулярного аппарата клетки, что также характеризует степень активации, дегрануляции и вакуолизации нейтрофилов.

Особенности морфологической структуры нефиксированных и неокрашенных живых функционирующих нейтрофилов позволяют выделить и идентифицировать три различных морфологических типа, характеризующих ту или иную степень их активности: неактивные, активные и дегенеративные клетки. Основой для дискриминации структурно измененных клеток служат различные варианты их формы, характера рельефа поверхности, наличие псевдоподий, гранул, вакуолей и т.п.

К дегенеративным, исчерпавшим свой функциональный резерв нейтрофилам, относят клетки разнообразной формы и размера с нечеткими размытыми границами. Цитоплазма просветленная, рыхлая, с нарушенной структурой и опустошенными гранулами, сильно вакуолизированная. Ядро сегментированное, расположено асимметрично, на периферии клетки.

Увеличение усредненного значения периметра при одновременном снижении высоты в указанных пределах и увеличении содержания дегенеративных форм нейтрофилов свидетельствует о низком уровне неспецифической резистентности организма, угрозе развития гнойно-воспалительных осложнений. Раннее выявление этих признаков позволяет своевременно начать противовоспалительную терапию.

Рассчитываются средние размеры нейтрофилов в популяции, определяются морфологические типы циркулирующих клеток, характеризующие ту или иную степень их активности. Основой для дискриминации структурно-измененных нейтрофилов служат различные варианты их формы, характера рельефа поверхности, наличие псевдоподий, гранул, вакуолей и т.п.Определяют процент неактивных нейтрофилов, функционально-активных и дегенеративно-измененных. Способ осуществляется следующим образом.

При поступлении больных в стационар из локтевой вены осуществляли забор крови в объеме 3,0 мл. Нейтрофилы выделяли стандартным методом на двойном градиенте плотности (1,077 и 1,093). Клетки отмывали центрифугированием в растворе Хенкса. Надосадок сливали, нейтрофилы разводили раствором Хенкса до концентрации 2×10⁶.

Прижизненную оценку морфофункционального состояния клеток проводили с помощью интерференционного микроскопа. Комплексный алгоритм морфометрии обеспечивал автоматическое определение заданных размерных параметров отдельных нейтрофилов (периметр, высота), статистическую обработку данных на популяционном уровне, расчет содержания активных, неактивных и дегенеративных клеток, документирование результатов в виде цитограмм.

Для определения показателей нормы (величины периметра, высоты нейтрофилов и количества дегенеративных клеток) были обследованы 20 практически здоровых лиц. Доноры с существенными отклонениями в общеклинических и биохимических анализах крови из исследования исключались. Средний возраст в группе здоровых лиц составил 39,2±1,8 лет. Установлено, что нормативными показателями нейтрофилов здоровых лиц являются: средний периметр в пробе - 35,2±4,1 мкм; средняя высота в пробе - 2,8±0,6 мкм; содержание дегенеративных клеток - 9,1% от общего числа в пробе.

Были обследованы 84 пациента с переломами челюсти различной локализации. Их возраст составлял от 19 до 61 года (средний возраст 38,9±1,8 лет). Критериями включения в исследование служили: наличие у пациента клинически установленного и рентгенологически подтвержденного диагноза перелома челюсти; а также согласие пациента.

Все больные были разделены на 2 группы: 42 пациентам проводили исследование по предлагаемому способу, 42 пациента были обследованы традиционным способом.

По анализу результатов морфометрии нейтрофилов периферической крови больных с переломами челюсти оценивали изменения морфофункционального статуса клеток в течение посттравматического периода. Наблюдение за пациентами позволило установить отклонения вышеуказанных показателей от нормы, по которым достоверно можно было отнести данного пациента в группу риска развития гнойно-воспалительных осложнений, либо исключить эту вероятность.

У 9 пациентов диагностировано состояние интенсивного функционального напряжения неспецифической защиты с признаками декомпенсации: содержание дегенеративных нейтрофилов составляло практически четверть от всей популяции - 24,3%, отклонение оптико-геометрических показателей от нормы составило: усредненного периметра на 20-30% от нормы, при одновременном снижении усредненного значения его высоты не менее чем на 10-20% от нормы. Это свидетельствовало, что система неспецифической резистентности имела сниженный функциональный запас, вследствие чего необходимые для полноценной защиты организма функциональные требования превышали ее потенциальные возможности. Больным была своевременно назначена адекватная терапия. Гнойно-воспалительных осложнений в послеоперационном периоде не наблюдалось.

В группе сравнения в результате поздней диагностики у 12 пациентов послеоперационный период осложнился развитием гнойно-воспалительных процессов. Купирование местных проявлений воспаления и пребывание больных в стационаре потребовало более длительного времени.

Пример 1.

Больной К., И/б №8752, 1978 г.р., поступил в отделение челюстно-лицевой хирургии с диагнозом: двухсторонний открытый перелом нижней челюсти в области углов с выраженным смещением костных отломков.

При внешнем осмотре конфигурация лица изменена за счет небольшого отека мягких тканей и смещения фрагментов нижней челюсти. Определяется умеренный воспалительный отек нижних отделов околоушножевательной областей. Кожа слегка гиперемирована, рот полуоткрыт, симптом нагрузки в области углов нижней челюсти резко положительный. При бимануальной пальпации нижней челюсти определяется подвижность костных фрагментов в области углов, боль. В полости рта - разрывы слизистой в ретромаллярных областях.

При обзорной рентгенографии - перелом нижней челюсти в области углов с выраженным смещением костных отломков. В зоне перелома нижней челюсти слева определяется полная ретенция 48 зуба.

Операция: произведен разрез кожи в подчелюстной области справа. Ткани послойно рассечены до кости. Фрагменты нижней челюсти скелетированы, сопоставлены в правильное соотношение и фиксированы внутрикостной спицей и металлической петлей. Рана послойно ушита, дренаж. Прикус фиксирован в ортогнатическом положении.

Анализ крови: НЬ - 130; Э - 4,31: L - 8,5; СОЭ - 10; GRA - 76,2; LYM - 18,3%; MON - 5,2%; PLT - 247; К - 5,6; Na - 428; Са общ - 2,4; Глюкоза - 5,9; АЛТ - 28; АСТ - 29.

Фазово-интерференционная микроскопия нейтрофилов: усредненное значение периметра - 44,2 мкм (на 25,6% больше нормы); усредненное значение высоты - 2,4 мкм (на 14,3% меньше нормы); количество дегенеративных нейтрофилов - 17,3% (на 8,2% больше нормы). Состояние неспецифического иммунитета - напряжение с элементами декомпенсации. Больной отнесен к группе риска развития гнойно-воспалительных осложнений.

В послеоперационном периоде проведена адекватная антибактериальная, симптоматическая, десенсибилизирующая терапия.

Результаты повторных исследований: анализ крови общий - Hb - 145; Э - 4,9: L - 7,1; СОЭ - 8; GRA - 67,3; LYM - 35,1%: MON - 1,4%; PLT - 252; K - 5,3; Na - 382; Са общ - 2,3; Глюкоза - 5,6; АЛТ - 31; АСТ - 35.

Фазово-интерференционная микроскопия нейтрофилов: усредненное значение периметра - 37,3 мкм (на 6% выше нормы); усредненное значение высоты - 2,7 мкм (на 3,6% ниже нормы); количество дегенеративных нейтрофилов - 11,9% (на 2,8% выше нормы). Состояние неспецифического иммунитета - без особенностей. Вероятность развития гнойно-воспалительных осложнений исключена.

Швы удалены на 7-е сутки, операционная рана зажила первичным натяжением. Больной выписан под амбулаторное наблюдение. Осмотр через 1 месяц - состояние удовлетворительное.

Предлагаемый способ позволяет провести раннюю доклиническую диагностику возможных воспалительных осложнений, что обеспечивает своевременное проведение соответствующей терапии.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, и может быть использовано для прогнозирования гнойно-воспалительных осложнений у больных с травмами челюстно-лицевой области. Сущность способа: у больных определяют морфологические типы и оптико-геометрические параметры живых нейтрофилов. При увеличении в пробе усредненного значения периметра нейтрофила не менее чем на 20% от нормы, при одновременном снижении усредненного значения его высоты не менее чем на 10% от нормы, увеличении количества дегенеративных нейтрофилов свыше 5% от нормы прогнозируют развитие гнойно-воспалительных осложнений. Использование способа позволяет проводить раннюю доклиническую диагностику возможных воспалительных осложнений, что обеспечивает своевременное проведение адекватной терапии.

Способ прогнозирования гнойно-воспалительных осложнений у больных с травмами челюстно-лицевой области, включающий определение параметров нейтрофилов, исследование их функциональной активности, отличающийся тем, что определяют морфологические типы и оптико-геометрические параметры живых нейтрофилов, и при увеличении в пробе усредненного значения периметра нейтрофила не менее чем на 20% от нормы, при одновременном снижении усредненного значения его высоты не менее чем на 10% от нормы, увеличении количества дегенеративных нейтрофилов свыше 5% от нормы, прогнозируют развитие гнойно-воспалительных осложнений.