Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности иммунодиагностике дирофиляриоза, и может быть использовано для серодиагностики данного заболевания у человека и животных.
Дирофиляриоз является одной из важных проблем паразитологии. Несмотря на то, что этот паразитоз отнесен к редким, в последние годы отмечается рост числа случаев данного заболевания у человека. Это обусловлено высокой пораженностью данным возбудителем собак и отсутствием надлежащих мер по их выявлению и дегельминтизации. Диагностика дирофиляриоза у человека затруднена из-за отсутствия иммунологических тестов.
Проблема иммунодиагностики этого гельминтоза является приоритетной задачей гельминтологической науки и практики, в связи с чем способ получения антигена дирофилярий имеет большую научную и практическую ценность.
Известен способ получения антигена дирофилярий, включающий помещение самки Dirofilaria immitis в 0,9% солевой раствор (в соотношении 1:3), ультразвуковую гомогенизацию в трех циклах при 70 кГц в течение 30 с при температуре 0°С, центрифугирование при 15000 g в течение 30 мин при температуре 4°С, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена (Е.Espinoza, M.Cordero, A.Muro, F.Lorente, F.Simon. Anti-Dirofilaria immitis IgE: Seroepidemiology and seasonal variation in an exposed human population / Tropical Medicine and Parasitology. - 1993. - V.44. - №3. - P.172).
Указанный способ, выбранный в качестве прототипа, не обеспечивает получение соматического антигена с высокими показателями специфичности и чувствительности, так как дает перекрестные реакции с сыворотками крови больных другими паразитозами (токсокароз, аскаридоз, фасциолез, эхинококкоз). Для увеличения специфичности данного антигена Simon F. et al сыворотки предварительно обрабатывают антигенами Toxocara canis, Ascaris suum, Fasciola hepatica и Echinococcus granulosus (F.Simon, A.Muro, M.Corder, J.Marti. A seroepidemiologic survey of human dirofilariosis in Western Spain / Tropical Medicine and Parasitology. - 1991. - V.42. - №2. - 106-108 p.).
Целью изобретения является разработка способа получения очищенного соматического антигена из неполовозрелой самки Dirofilaria repens с высокими показателями специфичности для его дальнейшего использования в диагностике дирофиляриоза у людей и животных с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).
Цель достигается путем оптимизации условий гомогенизации паразита (использование дополнительно механической гомогенизации), что позволяет добиться полного разрушения тканей и клеток; использованием экстракции белка в 0,25 М водном растворе сахарозы, тем самым увеличивается концентрация белка в антигене; проведением дополнительной очистки антигена дирофилярий от липоидов с помощью ацетона, что повышает его специфичность.
Способ включает следующие этапы.
1. Подготовка неполовозрелой самки Dirofilaria repens к гомогенизации.
Неполовозрелую самку Dirofilaria repens, удаленную хирургическим путем, отмывают многократно физиологическим раствором и помещают в 0,25 М водный раствор сахарозы (в соотношении 1:3). Пробу замораживают при температуре -18°С.
2. Получение полного соматического экстракта.
Проводят механическую гомогенизацию гельминта 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в трех циклах при 0°С. Для дальнейшей экстракции белков гомогенат выдерживают при температуре 4°С в течение 12 часов.
Проводят ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в трех циклах при 0°С.
3. Очистка экстракта в ацетоне.
Суспензию антигена медленно по каплям добавляют во флакон с охлажденным ацетоном (1 объем суспензии на 20 объемов ацетона) при непрерывном быстром перемешивании при 0°С. Смесь во флаконах выдерживают 1 час в холодильнике при температуре +4°С. Проводят центрифугирование смеси в центрифуге при 2000 об/мин в течение 8 минут при температуре 0°С. Надосадочную жидкость удаляют. Пробирку с осадком высушивают под вакуумом в течение 3 часов при 0°С.
К сухому остатку во флаконе добавляют 1 мл фосфатного буфера рН 6,4. Флакон энергично встряхивают в течение 1-2 минут, а затем помещают в холодильник при 4°С на 12 часов для полной гидратации препарата.
Раствор центрифугируют при 5000 об/мин в течение 60 минут при температуре 0°С. Надосадочную жидкость используют как антиген.
4. Анализ диагностических свойств полного соматического очищенного антигена.
Чувствительность и специфичность полученного антигена определяли в ИФА по общепринятой методике. Полученный антиген использовали в концентрации 40 мкг/мкл в объеме 100 мкл на лунку. Разведение сывороток 1:200.
Пример 1.
Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови животных. В опытах использовали сыворотки крови собак больных дирофиляриозом Dirofilaria repens, дирофиляриозом Dirofilaria immitis, свободных от данной инвазии и собак с другими паразитозами. Кровь всех собак предварительно была исследована на наличие микрофилярий классическим способом.
Результаты представленные в таблице 1, свидетельствуют, что чувствительность и специфичность очищенного соматического антигена с сыворотками крови животных составила 100%.
Пример 2.
Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови людей. В этом эксперименте использовались сыворотки больных дирофиляриозом людей (банк сывороток Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии) и людей вне инвазии: здоровых и больных токсокарозом и другими паразитозами (лямблиозом, описторхозом).
Результаты представлены в таблице 2. По результатам ИФА установлено, что чувствительность теста с сыворотками крови людей составила 84,62%, специфичность - 87,50%.
Пример 3.
Исследование специфичности очищенного соматического антигена Dirofilaria repens в ИФА с помощью реакции ингибиции антител. Для этого соматический антиген в различных разведениях (концентрация белка от 21,90 до 1,10 мк/мл) добавляли в стандартизированные дозы сыворотки больного дирофиляриозом, инкубировали 30 мин при +37°С. Далее смесь антиген-антитело обрабатывали в ИФА по стандартной методике.
Результаты реакции ингибиции представлены в таблице 3 и на чертеже. Как видно из таблицы и чертежа, отмечалась ярко выраженная зависимость эффекта ингибиции от внесенной дозы антигена. Чем выше концентрация белка вносимого антигена, тем ниже оптическая плотность данной сыворотки.
Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови животных.
Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови людей.
Исследование специфичности очищенного соматического антигена Dirofilaria repens в ИФА с помощью реакции ингибирования антител.
КДиагн. - контроль диагностический
Д+ - сыворотка крови больного дирофиляриозом в разведении 1:50
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО СОМАТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА Dirofilaria immitis | 2012 |
|
RU2525688C2 |
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ИЗ СЕТАРИЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ДИРОФИЛЯРИОЗА СОБАК | 2011 |
|
RU2487722C2 |
Способ подготовки проб материала для идентификации вида нематод методом MALDI TOFF Biotyper | 2018 |
|
RU2703280C1 |
КОМБИНИРОВАННОЕ ПРОТИВОПАРАЗИТАРНОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ГЕЛЬМИНТОЗОВ И АРАХНОЭНТОМОЗОВ ПЛОТОЯДНЫХ ЖИВОТНЫХ | 2017 |
|
RU2657508C1 |
ПРЕПАРАТ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ГЕЛЬМИНТОЗОВ ЖИВОТНЫХ | 2004 |
|
RU2287332C2 |
КОМБИНАЦИЯ НЕОНИКОТИНОИДНОГО И ПИРЕТРОИДНОГО СОЕДИНЕНИЙ ДЛЯ КОНТРОЛЯ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ДИРОФИЛЯРИОЗА СОБАК СЕРДЕЧНОЙ ФОРМЫ | 2016 |
|
RU2732965C1 |
ПРОТИВОПАРАЗИТАРНОЕ СРЕДСТВО В ФОРМЕ РАСТВОРА ДЛЯ НАРУЖНОГО ПРИМЕНЕНИЯ НА ОСНОВЕ ИМИДАКЛОПРИДА, ПИРИПРОКСИФЕНА И МОКСИДЕКТИНА ПРИ ЭКТО- И ЭНДОПАРАЗИТОЗАХ ПЛОТОЯДНЫХ ЖИВОТНЫХ | 2022 |
|
RU2799203C1 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗАРАЖЕННОСТИ СОБАК DIROFILARIA IMMITIS | 2007 |
|
RU2371145C2 |
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КРОВИ НА НАЛИЧИЕ ПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПО ИЗМЕНЕНИЮ ЛЕЙКОГРАММЫ ПОСЛЕ УЛЬТРАЗВУКОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ | 2015 |
|
RU2623860C2 |
Средство для лечения и профилактики нематодозов и цестодозов у мелких домашних животных | 2019 |
|
RU2722272C1 |
Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к иммунодиагностике, и может быть использовано для прижизненной серодиагностики дирофиляриоза у животных и человека. Способ включает получение очищенного соматического антигена Dirofilaria repens при помощи последовательной механической и ультразвуковой гомогенизации с экстракцией белков в 0,25 М водном растворе сахарозы, осаждение супернатанта в охлажденном ацетоне, растворение вакуумно-высушеного осадка в калий-фосфатном буфере. Способ обеспечивает получение соматического антигена с высокими показателями специфичности и чувствительности. 3 табл., 1 ил.
Способ получения очищенного соматического антигена Dirofilaria repens, включающий гомогенизацию ультразвуковую, центрифугирование гомогената, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена, отличающийся тем, что предварительно проводят механическую гомогенизацию и экстракцию белков в 0,25 М водном растворе сахарозы при 4°С в течение 12 ч, образовавшийся после ультразвуковой гомогенизации супернатант растворяют в охлажденном ацетоне при температуре 0°С в соотношении 1:20, с экспозицией 1 ч при температуре 4°С.
ESPINOZA E et al | |||
Anti-Dirofilaria immitis IgE: seroepidemiology and seasonal variation in an exposed human population | |||
Trop Med Parasitol | |||
Способ изготовления фанеры-переклейки | 1921 |
|
SU1993A1 |
US 6790630 В1, 14.09.2004 | |||
PERIBANEZ MA et al | |||
Histochemical differentiation of Dirofilaria immitis, Dirofilaria repens and Acanthocheilonema dracunculoides microfilariae by staining |
Авторы
Даты
2009-05-27—Публикация
2008-01-09—Подача