СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО СОМАТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА DIROFILARIA REPENS Российский патент 2009 года по МПК A61K39/00 G01N33/531 

Описание патента на изобретение RU2356575C1

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, в частности иммунодиагностике дирофиляриоза, и может быть использовано для серодиагностики данного заболевания у человека и животных.

Дирофиляриоз является одной из важных проблем паразитологии. Несмотря на то, что этот паразитоз отнесен к редким, в последние годы отмечается рост числа случаев данного заболевания у человека. Это обусловлено высокой пораженностью данным возбудителем собак и отсутствием надлежащих мер по их выявлению и дегельминтизации. Диагностика дирофиляриоза у человека затруднена из-за отсутствия иммунологических тестов.

Проблема иммунодиагностики этого гельминтоза является приоритетной задачей гельминтологической науки и практики, в связи с чем способ получения антигена дирофилярий имеет большую научную и практическую ценность.

Известен способ получения антигена дирофилярий, включающий помещение самки Dirofilaria immitis в 0,9% солевой раствор (в соотношении 1:3), ультразвуковую гомогенизацию в трех циклах при 70 кГц в течение 30 с при температуре 0°С, центрифугирование при 15000 g в течение 30 мин при температуре 4°С, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена (Е.Espinoza, M.Cordero, A.Muro, F.Lorente, F.Simon. Anti-Dirofilaria immitis IgE: Seroepidemiology and seasonal variation in an exposed human population / Tropical Medicine and Parasitology. - 1993. - V.44. - №3. - P.172).

Указанный способ, выбранный в качестве прототипа, не обеспечивает получение соматического антигена с высокими показателями специфичности и чувствительности, так как дает перекрестные реакции с сыворотками крови больных другими паразитозами (токсокароз, аскаридоз, фасциолез, эхинококкоз). Для увеличения специфичности данного антигена Simon F. et al сыворотки предварительно обрабатывают антигенами Toxocara canis, Ascaris suum, Fasciola hepatica и Echinococcus granulosus (F.Simon, A.Muro, M.Corder, J.Marti. A seroepidemiologic survey of human dirofilariosis in Western Spain / Tropical Medicine and Parasitology. - 1991. - V.42. - №2. - 106-108 p.).

Целью изобретения является разработка способа получения очищенного соматического антигена из неполовозрелой самки Dirofilaria repens с высокими показателями специфичности для его дальнейшего использования в диагностике дирофиляриоза у людей и животных с помощью иммуноферментного анализа (ИФА).

Цель достигается путем оптимизации условий гомогенизации паразита (использование дополнительно механической гомогенизации), что позволяет добиться полного разрушения тканей и клеток; использованием экстракции белка в 0,25 М водном растворе сахарозы, тем самым увеличивается концентрация белка в антигене; проведением дополнительной очистки антигена дирофилярий от липоидов с помощью ацетона, что повышает его специфичность.

Способ включает следующие этапы.

1. Подготовка неполовозрелой самки Dirofilaria repens к гомогенизации.

Неполовозрелую самку Dirofilaria repens, удаленную хирургическим путем, отмывают многократно физиологическим раствором и помещают в 0,25 М водный раствор сахарозы (в соотношении 1:3). Пробу замораживают при температуре -18°С.

2. Получение полного соматического экстракта.

Проводят механическую гомогенизацию гельминта 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в трех циклах при 0°С. Для дальнейшей экстракции белков гомогенат выдерживают при температуре 4°С в течение 12 часов.

Проводят ультразвуковую гомогенизацию супернатанта при 70 кГц 5 раз по 30 секунд с интервалом в 30 секунд в трех циклах при 0°С.

3. Очистка экстракта в ацетоне.

Суспензию антигена медленно по каплям добавляют во флакон с охлажденным ацетоном (1 объем суспензии на 20 объемов ацетона) при непрерывном быстром перемешивании при 0°С. Смесь во флаконах выдерживают 1 час в холодильнике при температуре +4°С. Проводят центрифугирование смеси в центрифуге при 2000 об/мин в течение 8 минут при температуре 0°С. Надосадочную жидкость удаляют. Пробирку с осадком высушивают под вакуумом в течение 3 часов при 0°С.

К сухому остатку во флаконе добавляют 1 мл фосфатного буфера рН 6,4. Флакон энергично встряхивают в течение 1-2 минут, а затем помещают в холодильник при 4°С на 12 часов для полной гидратации препарата.

Раствор центрифугируют при 5000 об/мин в течение 60 минут при температуре 0°С. Надосадочную жидкость используют как антиген.

4. Анализ диагностических свойств полного соматического очищенного антигена.

Чувствительность и специфичность полученного антигена определяли в ИФА по общепринятой методике. Полученный антиген использовали в концентрации 40 мкг/мкл в объеме 100 мкл на лунку. Разведение сывороток 1:200.

Пример 1.

Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови животных. В опытах использовали сыворотки крови собак больных дирофиляриозом Dirofilaria repens, дирофиляриозом Dirofilaria immitis, свободных от данной инвазии и собак с другими паразитозами. Кровь всех собак предварительно была исследована на наличие микрофилярий классическим способом.

Результаты представленные в таблице 1, свидетельствуют, что чувствительность и специфичность очищенного соматического антигена с сыворотками крови животных составила 100%.

Пример 2.

Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови людей. В этом эксперименте использовались сыворотки больных дирофиляриозом людей (банк сывороток Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии) и людей вне инвазии: здоровых и больных токсокарозом и другими паразитозами (лямблиозом, описторхозом).

Результаты представлены в таблице 2. По результатам ИФА установлено, что чувствительность теста с сыворотками крови людей составила 84,62%, специфичность - 87,50%.

Пример 3.

Исследование специфичности очищенного соматического антигена Dirofilaria repens в ИФА с помощью реакции ингибиции антител. Для этого соматический антиген в различных разведениях (концентрация белка от 21,90 до 1,10 мк/мл) добавляли в стандартизированные дозы сыворотки больного дирофиляриозом, инкубировали 30 мин при +37°С. Далее смесь антиген-антитело обрабатывали в ИФА по стандартной методике.

Результаты реакции ингибиции представлены в таблице 3 и на чертеже. Как видно из таблицы и чертежа, отмечалась ярко выраженная зависимость эффекта ингибиции от внесенной дозы антигена. Чем выше концентрация белка вносимого антигена, тем ниже оптическая плотность данной сыворотки.

Таблица 1.
Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови животных.
Сыворотки крови собак Количество животных Результаты ИФА положит. отриц. чувствит. специфич. Животные, больные дирофиляриозом Dirofilaria repens 126 126 0 100% 100% Животные, больные дирофиляриозом Dirofilaria immitis 10 - 10 Животные вне данной инвазии 10 - 10 Животные с другими паразитозами 10 - 10

Таблица 2.
Исследование диагностической эффективности в ИФА очищенного соматического антигена Dirofilaria repens с сыворотками крови людей.
Сыворотки крови людей Количество обследованных Результаты ИФА положит. отриц. чувствит. специфич. Больные дирофиляриозом с подтвержденным диагнозом 39 34 6 84,62% 87,50% Здоровые лица 12 1 11 Больные токсокарозом 9 2 7 Больные другими паразитозами (описторхоз, лямблиоз) 11 1 10

Таблица 3.
Исследование специфичности очищенного соматического антигена Dirofilaria repens в ИФА с помощью реакции ингибирования антител.
Оптическая плотность К- 0,057 КДиагн. 0,171 100 мкл Д+ 0,412 100 мкл Д+ + 100 мкл антигена (концентрация белка 21,90 мк/мл) 0,093 100 мкл Д+ + 100 мкл антигена (концентрация белка 5,48 мк/мл) 0,119 100 мкл Д+ + 100 мкл антигена (концентрация белка 2,74 мк/мл) 0,131 100 мкл Д+ + 100 мкл антигена (концентрация белка 1,10 мк/мл) 0,157 100 мкл Д+ + 100 мкл жидкости для разведения сывороток 0,277 К- - контроль отрицательный
КДиагн. - контроль диагностический
Д+ - сыворотка крови больного дирофиляриозом в разведении 1:50

Похожие патенты RU2356575C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО СОМАТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА Dirofilaria immitis 2012
  • Нагорный Сергей Андреевич
  • Васерин Юрий Иванович
  • Криворотова Елена Юрьевна
RU2525688C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ИЗ СЕТАРИЙ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ДИРОФИЛЯРИОЗА СОБАК 2011
  • Бережко Вера Кузминична
  • Написанова Людмила Александровна
  • Хайдаров Камил Абдурахманович
  • Ястреб Валерий Бронеславович
  • Медведев Андрей Юрьевич
RU2487722C2
Способ подготовки проб материала для идентификации вида нематод методом MALDI TOFF Biotyper 2018
  • Алешукина Анна Валентиновна
  • Алешукина Ираида Сергеевна
  • Ермакова Лариса Александровна
  • Нагорный Сергей Андреевич
  • Пшеничная Наталья Юрьевна
  • Криворотова Елена Юрьевна
RU2703280C1
КОМБИНИРОВАННОЕ ПРОТИВОПАРАЗИТАРНОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ ГЕЛЬМИНТОЗОВ И АРАХНОЭНТОМОЗОВ ПЛОТОЯДНЫХ ЖИВОТНЫХ 2017
  • Хахалин Александр Анатольевич
  • Тарабрин Владимир Владимирович
  • Арисов Михаил Владимирович
RU2657508C1
ПРЕПАРАТ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ ГЕЛЬМИНТОЗОВ ЖИВОТНЫХ 2004
  • Енгашев Сергей Владимирович
RU2287332C2
КОМБИНАЦИЯ НЕОНИКОТИНОИДНОГО И ПИРЕТРОИДНОГО СОЕДИНЕНИЙ ДЛЯ КОНТРОЛЯ РАСПРОСТРАНЕНИЯ ДИРОФИЛЯРИОЗА СОБАК СЕРДЕЧНОЙ ФОРМЫ 2016
  • Варлу, Мари
  • Ходжкинз, Элизабет
RU2732965C1
ПРОТИВОПАРАЗИТАРНОЕ СРЕДСТВО В ФОРМЕ РАСТВОРА ДЛЯ НАРУЖНОГО ПРИМЕНЕНИЯ НА ОСНОВЕ ИМИДАКЛОПРИДА, ПИРИПРОКСИФЕНА И МОКСИДЕКТИНА ПРИ ЭКТО- И ЭНДОПАРАЗИТОЗАХ ПЛОТОЯДНЫХ ЖИВОТНЫХ 2022
  • Арисов Михаил Владимирович
  • Точиева Оксана Николаевна
  • Арисова Гульнара Бакитовна
  • Белых Ирина Петровна
RU2799203C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗАРАЖЕННОСТИ СОБАК DIROFILARIA IMMITIS 2007
  • Бойко Оксана Витальевна
  • Николаев Александр Аркадьевич
  • Богданова Татьяна Викторовна
RU2371145C2
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КРОВИ НА НАЛИЧИЕ ПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПО ИЗМЕНЕНИЮ ЛЕЙКОГРАММЫ ПОСЛЕ УЛЬТРАЗВУКОВОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ 2015
  • Олешкевич Анна Анатольевна
  • Василевич Федор Иванович
  • Пашовкин Тимофей Николаевич
  • Комарова Эмма Муссаевна
RU2623860C2
Средство для лечения и профилактики нематодозов и цестодозов у мелких домашних животных 2019
  • Кокорина Любовь Михайловна
  • Зейналов Орхан Ахмед Оглы
RU2722272C1

Реферат патента 2009 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЧИЩЕННОГО СОМАТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА DIROFILARIA REPENS

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, а именно к иммунодиагностике, и может быть использовано для прижизненной серодиагностики дирофиляриоза у животных и человека. Способ включает получение очищенного соматического антигена Dirofilaria repens при помощи последовательной механической и ультразвуковой гомогенизации с экстракцией белков в 0,25 М водном растворе сахарозы, осаждение супернатанта в охлажденном ацетоне, растворение вакуумно-высушеного осадка в калий-фосфатном буфере. Способ обеспечивает получение соматического антигена с высокими показателями специфичности и чувствительности. 3 табл., 1 ил.

Формула изобретения RU 2 356 575 C1

Способ получения очищенного соматического антигена Dirofilaria repens, включающий гомогенизацию ультразвуковую, центрифугирование гомогената, отбор надосадочной жидкости и использование ее как антигена, отличающийся тем, что предварительно проводят механическую гомогенизацию и экстракцию белков в 0,25 М водном растворе сахарозы при 4°С в течение 12 ч, образовавшийся после ультразвуковой гомогенизации супернатант растворяют в охлажденном ацетоне при температуре 0°С в соотношении 1:20, с экспозицией 1 ч при температуре 4°С.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2009 года RU2356575C1

ESPINOZA E et al
Anti-Dirofilaria immitis IgE: seroepidemiology and seasonal variation in an exposed human population
Trop Med Parasitol
Способ изготовления фанеры-переклейки 1921
  • Писарев С.Е.
SU1993A1
US 6790630 В1, 14.09.2004
PERIBANEZ MA et al
Histochemical differentiation of Dirofilaria immitis, Dirofilaria repens and Acanthocheilonema dracunculoides microfilariae by staining

RU 2 356 575 C1

Авторы

Бескровная Юлия Григорьена

Нагорный Сергей Андреевич

Васерин Юрий Иванович

Даты

2009-05-27Публикация

2008-01-09Подача